TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO EN CELAYA

Departamento de Ingeniería Bioquímica

Bioquímica del Nitrógeno y regulación genética

Reporte de laboratorio
práctica 3

EQUIPO 2
-Cano Gil Guadalupe Montserrat
-Colorado Colorado Monserrath
-Macías Pacheco JuanDiego
-Ramírez Montecillo Andrea Guadalupe

Docente: Dr. Gerardo Acosta García

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Celaya Gto Martes 21 de marzo de 2023
 ÍNDICE

COMPETENCIA ESPECIFÍCA A ALCANZAR ......................................................... 3

OBJETIVO............................................................................................................... 3

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 3

MATERIALES Y REACTIVOS ................................................................................. 5

PROCEDIMIENTO .................................................................................................. 5

Procedimiento experimental................................................................................. 5

Preparación de la solución de cloroplastos: ......................................................... 5

Reacción de Hill: .................................................................................................. 6

Cuantificación de clorofila: ................................................................................... 6

DIAGRAMA ............................................................................................................. 7

CUESTIONARIO ..................................................................................................... 8

RESULTADOS....................................................................................................... 10

Cuantificación de clorofila: ................................................................................. 11

CONCLUSIONES.................................................................................................. 11

REFERENCIAS ..................................................................................................... 12

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 PRÁCTICA No. 3 Fotosíntesis

COMPETENCIA ESPECIFÍCA A ALCANZAR

Verificar la capacidad de los cloroplastos aislados de llevar a cabo el proceso de
fotosíntesis. Aprender a cuantificar la concentración de clorofila por medio de la
espectrofotometría.

OBJETIVO
Mediante una serie de reacciones y procesos se logrará la identificación y
cuantificación de clorofila en una muestra orgánica.

INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es un proceso metabólico que realizan las plantas, las
cianobacterias y algunos protistas. En los organismos eucariotas se realiza en los
cloroplastos. La reacción general de la fotosíntesis es la siguiente:
Energía solar + 6 H2O + 6 CO2 → C6H12O6 + 6 O2 + Energía
La fotosíntesis no es un proceso simple y consta de múltiples etapas. Las primeras
etapas se conocen como Reacciones lumínicas y se encargan de convertir la
energía solar en energía química produciendo oxígeno, como producto de desecho.
Se dan en las membranas de los tilacoides. Las segundas reacciones se conocen
como Ciclo de Calvin (o reacciones de oscuridad) y producen moléculas de azúcar
utilizando el CO2 y los productos de alto contenido energético de las reacciones
luminosas. Se llevan a cabo en el estroma. De acuerdo con el dibujo anterior, la
energía luminosa se utiliza para:
1. Fabricar ATP a partir de ADP y P.
2. Impulsar la transferencia de electrones (e-) desde el H2O a la molécula
de NADP
3. formando NADPH. El H2O se rompe (se oxida) liberando oxígeno.

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Este rompimiento de la molécula de H2O se conocer como Reacción de Hill y puede
ejemplificarse mediante la siguiente reacción:
A + H2O → H2A + ½ O2
En la reacción, A es el aceptor de electrones, es decir la molécula de NADP.
Durante esta práctica se utilizará un aceptor artificial, el colorante 2,6 dicloro fenol
inodefenol, el cual es reducido:
Colorante Colorante -H2 + H2O → + ½ O2
Por otro lado, en el Ciclo de Calvin, el carbono del dióxido de carbono se fija en
compuestos orgánicos y las enzimas fabrican carbohidratos (principalmente
glucosa).
Desde el punto de vista ambiental, el proceso de fotosíntesis es seguramente el
proceso bioquímico más importante de la biosfera por varios motivos, tales como:
1. La síntesis de materia orgánica a partir de la inorgánica permite el
comienzo de múltiples cadenas tróficas.
2. Libera oxígeno, fundamental para la supervivencia de todos los seres
aeróbicos.
3. De ella depende la energía almacenada en los combustibles fósiles,
como carbón, petróleo y gas natural.

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MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos
4 tubos de ensayo 15x150 Hojas verdes frescas de espinaca
(ALUMNO)

2 vasos de precipitado 250 mL Cloruro de Sodio 0.35 M

Mortero con pistilo Acetona

4 tubos Falcon para centrífuga Buffer de fosfato 0.1M, pH:6.5

2 celdas de vidrio para Solución colorante de dicloro fenol
espectrofotómetro indofenol, 1.2x10-4 M

3 pipetas de 5 mL Agua destilada

2 pipeta de 1 mL 4 gasas (ALUMNO)

1 pipeta de 10 mL Hielo (ALUMNO)

Vidrio de reloj Papel de aluminio (ALUMNO)

Tabla para picar

Cuchillo
Embudo de plástico
2 perilla de succión

PROCEDIMIENTO

Procedimiento experimental

Preparación de la solución de cloroplastos:

Tome las hojas de espinaca, retire las venas y pese unos 4 gramos. Macérelos con
10 ml de NaCl 0.35 M. Esto debe hacerse manteniendo el mortero en hielo. A
continuación, filtre en un vaso de precipitado.
Ponga el extracto filtrado en un tubo Falcon y centrifugue a 4000 rpm durante 5
min. En la fase superior quedarán los cloroplastos.

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Con una pipeta tome la solución de cloroplastos y pásela a otro tubo Falcon.
Centrifugue nuevamente a 4000 rpm durante 5 min. Esta vez, los cloroplastos
estarán al fondo del tubo.
Decante el sobrenadante teniendo cuidado de no tirar los cloroplastos, y agregue
a estos últimos 5 ml de NaCl 0.35 M frío. Agite la mezcla. Cubra el tubo con papel
aluminio y consérvelo en un baño frío.

Reacción de Hill:

Tome dos tubos de ensayo y ponga en cada uno 1 ml de suspensión de

cloroplastos y adicione: 2ml de Buffer 0.1M, 2ml de solución colorante, 6ml de
agua destilada. Cubra con papel aluminio uno de los tubos, el otro, expóngalo a la
luz durante 10 min. Transcurrido este tiempo, obsérvelos contra un fondo blanco y
compárelos.
Cuantificación de clorofila:

Tome 1ml de solución de cloroplastos, póngala en un tubo de ensayo, y adiciónele

8 ml de acetona. Mezcle y agregue enseguida 1ml de agua destilada.
Centrifugue en un tubo Falcon a 4000 rpm por 15 min y ponga el sobrenadante en
la celda del espectrofotómetro. Lea la absorbancia en el espectrofotómetro a 650
nm. Para esto, utilice como blanco agua destilada.
Calcule la cantidad total de clorofila en 1ml de suspensión utilizando la siguiente
fórmula:
mg Clorofila/ml = Absorbancia x 10 / 34.5

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 DIAGRAMA

PRÁCTICA 3: FOTOSÍNTESIS

para Franela, cinta masking,

la realización de la práctica. marcador permanente, lentes de
seguridad, guantes de nitrilo.

Cuantificación de
Reacción de Hill
clorofila

2 tubos de ensaye, poner 1ml de

Retirar venas a hojas de Tomar 1ml de solución de
suspensión de cloroplastos y
espinaca y pesar 4g. cloroplastos, poner 8ml de
adicionar: 2ml de Buffer 0.1M,
Macerar con 10ml de NaCl acetona. Mezclar y agregar
2ml de solución colorante, 6ml
0.35M y filtrar en vaso pp. 1ml de agua destilada.
de agua destilada.

Poner extracto filtrado en

Cubrir con papel aluminio Centrifugar a 4000rpm/15
tubo falcón y centrifugar
uno de los tubos, el otro minutos.
4000 rpm/5minutos.
exponer a la luz durante
10 minutos.
Tomar solución de cloroplastos Poner sobrenadante en la
y nuevamente centrifugar celda de espectrofotómetro.
4000rpm/5minutos. Leer absorbancia a 650nm.
Utilizar como blanco agua
destilada.

Decantar sobrenadante y
agregar 5ml de NaCl 0.35M
frío. Agitar, cubrir con papel
aluminio y conservar en frío.
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CUESTIONARIO

1. ¿Por qué el procedimiento de aislamiento de los cloroplastos debe

llevarse a cabo en frío?
El procedimiento general se realiza a temperaturas bajas (aprox. 4 ºC) con
el propósito de demorar la degradación de los componentes celulares
2. ¿La solución de cloruro de sodio 0?35M es una solución hipotónica?
¿Qué significa esto y qué relación tiene con la práctica?
Si es hipotónica, esto hace referencia a que tiene un valor mayor de .32M lo
que significa que posee mayor concentración de solutos de
los que hay en el interior de la célula lo que ayuda a una mejor remoción de
la clorofila.
3. ¿En qué consiste la reacción de Hill?
La fase luminosa, fase clara, fase fotoquímica o reacción de Hill es la primera
etapa de la fotosíntesis, que convierte la energía solar en energía química.
La luz es absorbida por complejos formados por clorofilas y proteínas. Estos
complejos clorofila-proteína se agrupan en unidades llamadas fotosistemas,
que se ubican en los tilacoides (membranas internas) de los cloroplastos. Se
denomina fase luminosa o clara, ya que al utilizar la energía lumínica, sólo
puede llevarse a cabo en condiciones de alta luminosidad, ya sea natural o
artificial.
4. ¿Qué función cumple el buffer de fosfato 0?1M, pH: 6.5?
Esta solución se ocupa para mantener a las células en condiciones
fisiológicas estables durante periodos cortos, así como la preparación de
tratamientos, administración agentes xenobióticos o la inoculación de células
cancerígenes en ratones
5. ¿Con que fin se adiciona el colorante dicloro fenol indofenol?
Las moléculas del colorante interceptan los electrones en la
cadena fotosintética; específicamente acepta dos electrones en lugar de
que vayan a P680, por lo que la pérdida del color demuestra que el flujo
de electrones está ocurriendo durante las reacciones dependientes de
la luz. Dicha pérdida es proporcional al flujo de electrones y puede ser
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cuantificada en un espectrofotómetro
6. ¿Qué es un espectrofotómetro?
Los espectrofotómetros son instrumentos que apoyan a la
espectrofotometría para medir la cantidad de intensidad de luz absorbida
después de pasar a través de una solución muestra.
En cuanto al Espectrofotómetros se usa en el análisis químico que sirve para
medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una
misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la
concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra.
También se utiliza en laboratorios de química para la cuantificación de
sustancias y microorganismos.
El espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz
monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es
absorbida por dicha muestra.
Esto le permite al operador realizar dos funciones:
Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra.
Indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está
presente en la muestra.

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RESULTADOS

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Cuantificación de clorofila:

𝑚𝑔 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 ∗ 10
=
𝑚𝑙 34.5

𝑚𝑔 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 0.047 ∗ 10 𝑚𝑔 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎

= = 0.0136
𝑚𝑙 34.5 𝑚𝑙
Al finalizar la practica logramos determinar que la clorofila que está presente en 1
ml de la muestra es de 0.0136 mg por cada ml.

Dado que la clorofila es un componente esencial para la fotosíntesis y además es

la encargada de darle el color verde a las plantas era un hecho que tendríamos un
nivel alto de clorofila por cada ml sin contar la clorofila que se pudo llegar a perder
en los demás procesos de preparación de la muestra.

CONCLUSIONES

Al finalizar la práctica se logró la cuantificación de la clorofila en un mililitro de una

muestra de espinaca que en el campo de la agricultura sirve para ayudar a saber el
estado en el que se encuentra el cultivo, además, se logró observar lo que sucede
con la reacción de Hill la cual nos ayuda a entender la primera fase de la fotosíntesis
que consta de la fase luminosa en la cual la energía solar pasa a convertirse en
energía química que será utilizada más adelante en los demás procesos de la
fotosíntesis.

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REFERENCIAS

• Bravo, Inclán, L., & Tomasini Ortiz, C. (2017). Experiencias en la

determinación de clorofila'a'y feopigmentos por espectrofotometría.
• Villagómez Correa, S. R. (2016). Efecto de la temperatura en las
curvas de fluorescencia inducida de clorofila a en hojas de
espinaca (Bachelor's thesis, Quito, 2016.).
• Rivera, C., Zapata, Á., Pinilla, G., Donato, J., Chaparro, B., &
Jiménez, P. (2005). Comparación de la estimación de la clorofila-a
mediante los métodos espectrofotométrico y fluorométrico. Acta
Biológica Colombiana, 10(2), 95-103.
• Carril, E. P. U. (2011). Fotosíntesis: aspectos básicos. Reduca
(Biología), 2(3).
• Reol, E. M. (2003). Los pigmentos fotosintéticos, algo más que la
captación de luz para la fotosíntesis. Ecosistemas, 12(1).

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LISTA DE COTEJO

INSTRUMENTO DE EVALUACIÓN PARA PRÁCTICAS

DATOS GENERALES DEL PROCESO DE EVALUACIÓN

Nombre(s) del alumno(s) y/o Equipo: 2 Firma del alumno(s):
Juandiego Macias, Montse Cano, Andrea Ramírez,
Monse Colorado
Producto: Nombre del Trabajo de Fecha: 06/marzo/2023
Investigación:
Asignatura: bioquímica del Nitrógeno Grupo: A Periodo Semestral:
Enero-Junio
Nombre del Docente: Firma del Docente:
Gerardo Acosta

Práctica en el
Indique si es: Práctica en Laboratorio Práctica en Empresa
Aula
CRITERIOS DE EVALUACIÓN

Valor del Valor

Característica a cumplir (Reactivo) OBSERVACIONES
reactivo Obtenido

Investigación previa y preparación de

%
insumos requeridos para la práctica
Organización del trabajo, definición de roles y
% participación y de todos los miembros del
equipo
Desarrollo correcto y adecuado de la
% secuencia de la práctica

Modelo físico o Producto obtenido en la

%
práctica, en tiempo y forma
Contenido del reporte de la Práctica y
% Conclusiones, así como su entrega, en
tiempo y forma
Examen individual de asimilación del
%
conocimiento de la práctica
100% CALIFICACIÓN:
OBSERVACIONES GENERALES:

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