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Hidrocoloides alimentarios 133 (2022) 108020

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Hidrocoloides alimentarios

revista Página de inicio:www.elsevier.com/locate/foodhyd

Influencia del pH y la complejación de pectina con metoxi alto/bajo en los sitios de

unión hidrofóbicos de la β-lactoglobulina estudiada por un método de sonda
fluorescente

hao-li*, Teng Wang, Jiaqi Su, Paul Van der Meeren

Grupo de Tecnología Interfacial y de Partículas (PaInT), Departamento de Química Verde y Tecnología, Facultad de Ingeniería de Biociencias, Universidad de Ghent, Coupure Links 653, 9000,
Gent, Bélgica

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Palabras clave: Los complejos solubles de β-lactoglobulina (β-Lg)-polisacárido formados en un rango de pH específico a través de la atracción
β-lactoglobulina electrostática han atraído un interés creciente en el diseño de sistemas de encapsulación de calidad alimentaria para
pH compuestos hidrófobos, que se atribuye principalmente a las propiedades de unión a ligandos de β-Lg. Sin embargo, no está
Sondas fluorescentes
claro si los cambios conformacionales inducidos por el pH en β-Lg y su complejación electrostática con pectina aniónica
Pectina
afectan su capacidad para unirse a compuestos hidrofóbicos. Aquí, se empleó un método de sonda fluorescente para
Compuestos hidrófobos
proporcionar información útil sobre el campo. Se seleccionaron tres sondas fluorescentes solvatocrómicas (es decir, rojo Nilo,
retinol y curcumina) como modelos representativos de compuestos hidrofóbicos que se unieron a la cavidad interna y/oa la
superficie externa de β-Lg. La unión con complejos β-Lg o β-Lg/pectina mejoró en gran medida la fluorescencia de las sondas
hidrofóbicas. Especialmente, la diferencia de polaridad de los diferentes sitios de unión en β-Lg fue revelada por los espectros
de fluorescencia de β-Lg-Nile red en función del pH. Tanto el rojo del Nilo como el retinol se unieron más favorablemente a β-
Lg a pH neutro que a pH ácido, posiblemente debido a la accesibilidad de la cavidad interna en el primer caso. Tras la
acidificación, la reducción gradual de la intensidad de la fluorescencia de los complejos proteína-ligandos preformados (es
decir, a pH 7,0) se atribuyó a la disociación entre el rojo Nilo (o retinol) y la cavidad interna de β-Lg. Las interacciones β-Lg-
curcumina se vieron menos afectadas por las variaciones de pH, lo que sugiere que la curcumina se une principalmente a la
superficie externa de β-Lg. Para los tres compuestos hidrofóbicos probados, la formación de complejos solubles entre β-Lg
con pectina no tuvo efectos adversos en sus interacciones con la proteína. Estos resultados pueden proporcionar información
útil sobre la unión de compuestos hidrófobos a complejos de β-Lg o β-Lg/pectina. La metodología también puede extenderse
para estudiar el rendimiento de encapsulación de otros biopolímeros o partículas.

1. Introducción
La β-lactoglobulina (β-Lg) pertenece a la familia de proteínas lipocalina que
son capaces de acomodar moléculas hidrofóbicas o anfifílicas en su cavidad
interna (Sawyer y Kontopidis, 2000). Como la proteína globular más abundante en
el suero bovino (alrededor del 60%), la β-Lg tiene un peso molecular de 18,3 kDa,
lo que corresponde a una cadena polipeptídica de 162 residuos. Su estructura
secundaria comprende nueve hebras β y una hélice α, y ocho de las hebras β se
pliegan en un barril β aplanado (es decir, la cavidad). Además, también pueden
existir uno o dos sitios de unión para compuestos hidrófobos o anfifílicos en su
superficie externa. Se ha demostrado la complejación de β-Lg con diversos
compuestos bioactivos, como vitaminas, carotenoides, ácidos grasos, polifenoles,
péptidos y drogas sintéticas (li,
Wang, Hu, Wu y van der Meeren, 2022;Livney, 2010). Estas interacciones son
generalmente espontáneas y las fuerzas impulsadas pueden involucrar interacciones
hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas. Muchos compuestos
bioactivos que se encuentran en alimentos y productos farmacéuticos se benefician de la
formación de complejos (o encapsulación) con proteínas, como la mejora de la
estabilidad química y la dispersabilidad acuosa de los carotenoides (METROøller et al.,
2020), reducción del amargor de los polifenoles del té (Bohin et al., 2012), cristalización
controlada de flavonoides (Israel-Lev et al., 2017), y mayor biodisponibilidad (Zhu, Li, Xu y
Wang, 2019). Además, β-Lg resiste la hidrólisis de pepsina a pH 2,0 (es decir, fluidos
gástricos simulados) debido a su estructura compacta (Mandalari et al., 2009;Sakurai y
Goto, 2007). Por lo tanto, ha habido un interés creciente en el uso de β-Lg como
nanoportador molecular para encapsular, proteger y transportar compuestos bioactivos.

* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico:Hao.li@ugent.be (H. Li).

https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2022.108020
Recibido el 20 de junio de 2022; Recibido en forma revisada el 20 de julio de 2022; Aceptado el 26 de julio de 2022
Disponible en Internet el 1 de agosto de 2022
0268-005X/© 2022 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
H. Li et al.
(Li, Wang, Hu y otros, 2022;Livney, 2010;METROøller et al., 2020).
Las moléculas nativas de β-Lg experimentan reordenamientos/agregación
estructural sensible al pH en una solución acuosa (Marrón, 1993;Stender et al.,
2019). A niveles de pH por debajo de 4,0 y por encima de 5,2, la proteína muestra
un equilibrio monómero-dímero, pero en el primer caso se favorece la disociación
en monómeros a medida que se reduce el pH. Entre pH 4,0 y 5,2 se forman
estructuras oligoméricas de mayor tamaño debido a la proximidad de su punto
isoeléctrico (PEI 5,2). En consecuencia, la agregación secundaria da como
resultado soluciones altamente turbias e incluso la precipitación de proteínas, lo
que limita la funcionalidad de β-Lg en condiciones ligeramente ácidas.Ron, Zimet,
Bargarum, &Livney, 2010). En el escenario, se ha utilizado la complejación
electrostática con polisacáridos aniónicos para mejorar la estabilidad coloidal de
las partículas de proteína, dotándolas de una repulsión electrostática mejorada y
un impedimento estérico (Li, Wang, Hu y otros, 2022;Ron et al., 2010). En general,
la proteína y el polisacárido aniónico se mezclan a un pH superior al IEP de la
proteína en el que tienen el mismo signo de carga y, posteriormente, se forman
espontáneamente complejos solubles en una ventana de pH específica tras la
acidificación.Li, Wang, Hu y otros, 2022;Zimet y Livney, 2009).
En cuanto a la unión de compuestos bioactivos a la cavidad interna de β-Lg, se
reconoce que la llamada transición de Tanford (es decir, protonación/
desprotonación de Glu89) controla la entrada a la cavidad hidrofóbica de β-Lg (
Uhrínová et al., 2000a). En condiciones neutras a ligeramente básicas, se considera
que la proteína está en un estado "abierto", lo que permite la entrada de
compuestos moleculares pequeños. A pH por debajo de 6,2, el bucle EF se mueve
para ocluir la entrada, lo que da como resultado una conformación "cerrada" (
Uhrínová et al., 2000b). La mayoría de los estudios en este campo solo se
centraron en las interacciones entre β-Lg y compuestos bioactivos a pH neutro.
Figura 1.Estructura química del rojo del Nilo, retinol y curcumina (A); Intensidad de fluorescencia (FI) de rojo Nilo 1,2 μM en presencia o ausencia de β-Lg (0,6 mg/mL, 30 μM) a varios
valores de pH (B). El Panel C es una ventana ampliada del espectro rojo del Nilo en tampón fosfato/acetato 20 mM (pH 7,0) sin β-Lg. (Para la interpretación de las referencias al color en
la leyenda de esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).
2
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(Bohin et al., 2012;Cheng, Colmillo, Liu, Gao y Liang, 2018;Liang, Tajmir-Riahi
H y Subirade, 2007;Zhu, Sun, Wang, Xu y Wang, 2017), a pesar de que las
condiciones de pH ácido son más relevantes para los sistemas alimentarios
(por ejemplo, en bebidas) y después de la ingestión (por ejemplo, en fluidos
gástricos). Por ejemplo, no está claro en qué medida los cambios de
conformación de β-Lg a pH ácido afectan la afinidad de unión y si la
acidificación influye en los complejos preformados de proteína/compuestos
hidrofóbicos obtenidos a pH neutro. Además, con respecto a la interacción
electrostática entre β-Lg con polisacáridos aniónicos, se ha demostrado que
la formación de complejos influye en los estados de plegamiento/despliegue
de la conformación nativa de β-Lg (Benjamin, Lassé, Silkock y Everett, 2012;
Burova et al., 2022), que de alguna manera puede afectar los sitios de unión
hidrofóbicos de β-Lg.
En este estudio, se utilizó un método de sonda fluorescente para examinar el papel
de las variaciones de pH y la complejación electrostática con polisacáridos en las
interacciones proteína-compuestos hidrofóbicos a nivel molecular. Tres sondas
fluorescentes solvatocrómicas (InFigura 1A), incluidos el rojo del Nilo, el retinol y la
curcumina, se seleccionaron como modelos representativos de compuestos hidrofóbicos
unidos a la cavidad interna y/o la superficie externa de β-Lg. El rojo Nilo es un colorante
fluorescente sensible a la polaridad, como lo demuestran sus espectros de fluorescencia
variables en varios disolventes orgánicos o tejidos biológicos (Teo et al., 2021).
Especialmente, el rojo del Nilo tiene un largo rango de longitud de onda de trabajo (por
ejemplo, 500-700 nm) que está lejos de las longitudes de onda en las que muchas
biomoléculas absorben la luz. En consecuencia, el efecto de filtro interno de los
biopolímeros o compuestos coexistentes puede eliminarse en su mayoría en
comparación con el método de extinción de la fluorescencia de proteínas. Además, la
interferencia de la dispersión de la luz de partículas grandes en las mediciones de
fluorescencia también es mucho menor en longitudes de onda más largas.
H. Li et al.
En una solución acuosa, el rojo Nilo puro es básicamente insoluble y muestra poca
fluorescencia. Sin embargo, una vez que los vehículos de unión al colorante (p. ej.,
proteínas con sitios de unión hidrófobos) están presentes, se puede observar una
intensidad de fluorescencia muy mejorada y un aparente desplazamiento hacia el azul de
la emisión máxima (Sacket & Wolff, 1987). Además, la fluorescencia del rojo Nilo es
relativamente estable a los cambios de pH. De acuerdo aSackett y Wolff (1987), la
fluorescencia del rojo Nilo no se ve afectada por un pH entre 4,5 y 8,0. Recientemente,
algunos estudios han extendido su aplicación al pH.
2,5–4,0 (Polverini et al., 2006;Sturm, Cuerno y Schuhen, 2021). Solo en ambientes
muy ácidos, el rojo del Nilo se protona, lo que puede causar un desplazamiento
hacia el rojo de su espectro de fluorescencia (Moreno y Levy, 2000). En cuanto a las
interacciones β-Lg/rojo Nilo a pH neutro, las simulaciones moleculares y los
experimentos de extinción de la fluorescencia con triptófano han sugerido que un
β-Lg podría unirse a 1 o 2 moléculas de rojo Nilo, y el sitio de unión principal está
en la cavidad interna (Marrón, 1993;Olsen et al., 2020). Teniendo en cuenta la alta
sensibilidad de la fluorescencia roja del Nilo a la polaridad del entorno
circundante, se planteó la hipótesis de que los sitios de unión hidrófobos en β-Lg
podrían identificarse y examinarse (es decir, con diferentes polaridades dentro de
la cavidad o en la superficie externa) a través de la fluorescencia. método de
sondeo. Además, el destino de los complejos de β-Lg-Nilo rojo preformados ante
estímulos externos (p. ej., cambios de pH) podría adquirirse monitoreando los
espectros fluorescentes durante la titulación de pH. Con respecto al retinol y la
curcumina, se emplearon como compuestos hidrofóbicos representativos para
validar y complementar aún más los hallazgos (Benjamín et al., 2012;Patra y
Barakat, 2011). Se seleccionaron pectinas de alto y bajo metoxi (con diferentes
densidades de carga) ya que tienen diferentes afinidades de unión a la proteína.
Además, los grupos éster de la pectina pueden interactuar con β-Lg a través de
enlaces de hidrógeno o interacciones hidrofóbicas (Girard, Turgeon y Gauthier,
2002). Sin limitarse a las tres sondas hidrofóbicas, los resultados obtenidos
pueden proporcionar información útil o genérica sobre la unión de compuestos
hidrofóbicos a β-Lg.
2. Materiales y métodos
La proteína de suero BiPro enriquecida con β-Lg (más del 85 % de pureza) se
obtuvo de Davisco (Le Sueur, MN, EE. UU.). La proteína se purificó adicionalmente
para eliminar los agregados y sales de proteína desnaturalizados o insolubles de
acuerdo con Jung, Savin, Pouzot, Schmitt y Mezzenga (2008). Brevemente, la
solución de proteína (10 %, p/p) se disolvió en agua desionizada. Después de una
noche de hidratación, el pH se redujo a 4,6 con HCl 6 M y la mezcla se centrifugó a
11 500 RPM (15 200 g) durante 1 hora a 20ºC.◦C en una centrífuga Sorval RC-5B. El
sobrenadante claro se recogió y se dializó con una membrana de 10 kDa (Spectra/
Por®membrana de celulosa regenerada (RC)) frente a agua desionizada de pH 4,6
durante 12 h y frente a agua de pH 2,0 durante 12 h. A continuación, la solución de
proteína se liofilizó y almacenó a temperatura ambiente para uso futuro. β-Lg (≥
90%) de leche bovina, retinol (R7632) y Nile red (N3013) se adquirieron de Sigma-
Aldrich Corp. (St. Louis, MO, EE. UU.). La curcumina (95 %, B21573) se obtuvo de
Alfa Aesar (Alemania). Se recibieron de Cargill (Gante, Bélgica) LMP (OB700) de
calidad alimentaria con un grado de esterificación (DE) entre 33 y 38 % (peso
molecular medio 45,6 kDa) y HMP (AYD 2560SB) con un DE del 68 % (Li, Wang, Su y
otros, 2022). Se utilizó agua desionizada para todos los experimentos. Todos los
demás productos químicos eran de grado analítico.
2.1. preparación de la muestra
La solución madre de β-Lg se preparó en agua desionizada (que contenía azida de
sodio al 0,02 %) a una concentración de 8 mg/mL después de 2 h de agitación e
hidratación durante la noche a 4◦C. Las soluciones madre de LMP o HMP se disolvieron en
el tampón de pH 7,0 a una concentración de 1,2 mg/ml después de agitar durante la
noche. Las soluciones preparadas se pasaron a través de un filtro de membrana de éster
de celulosa mixta (MCE) de 0,45 μm para eliminar los materiales insolubles.
La solución madre de proteína se diluyó en tampones de pH 3,0, 4,5 o 7,0
(sal 20 mM que incluye fosfato de sodio 10 mM y sodio 10 mM).
3
Hidrocoloides alimentarios 133 (2022) 108020
acetato) para su uso posterior, seguido de un ajuste del pH al valor deseado con
HCl 0,6 M o NaOH 1 M, si es necesario. Para mayor claridad, los experimentos
preliminares revelaron que la ligera diferencia de fuerza iónica tenía poco efecto
sobre la unión.
El rojo del Nilo y la curcumina se disolvieron en DMSO a 100 μM. El retinol se
disolvió en DMSO a 132 μM. Estos colorantes se almacenaron a 4◦C si no está en
uso.
2.2. Espectroscopía de fluorescencia y UV/Vis
Los espectros de fluorescencia se registraron mediante un espectrómetro
Cary Eclipse con cubetas de cuarzo de cuatro lados transparentes. Para investigar
el efecto del pH sobre la unión de los colorantes a la proteína, la concentración de
los colorantes se fijó en 1,2 μM para el rojo Nilo y la curcumina, y en 1,6 μM para el
retinol. A estas bajas concentraciones, el efecto de filtro interno de los tintes
básicamente podría ignorarse. La concentración de proteína osciló entre 0,025
mg/ml y 1,6 mg/ml (es decir, correspondiente a 1,25–80 μM β-Lg, según lo
confirmado por los valores de absorbancia a 280 nm. Los espectros de
fluorescencia se registraron inmediatamente después de la mezcla directa y
después de 60 min de equilibrio Todas las mediciones se realizaron a temperatura
ambiente (20◦C).
A un voltaje del detector de 600 V, los espectros de emisión del rojo del Nilo se
recolectaron entre 560 y 750 nm usando una longitud de onda de excitación de
550 nm. Para el retinol se seleccionó una longitud de onda de excitación de 340
nm y se recogieron los espectros de emisión entre 350 y 650 nm. Para la
curcumina, el voltaje del detector se ajustó a 800 V o 600 V, la longitud de onda de
excitación fue de 425 nm y los espectros de emisión se recolectaron entre 435 y
650 nm.
Para estudiar el efecto de la acidificación y la adición de pectina
(LMP o HMP) sobre la unión proteína-colorante, los colorantes se
agregaron previamente a la solución de proteína diluida a pH 7.0 (tanto
en presencia como en ausencia de pectina). El valor del pH se redujo
lentamente con HCl 0,6 M de 7,0 a 3,0. La relación de masa de proteína
a polisacárido se fijó en 1:1. En un grupo de control, se usó el mismo
volumen del tampón de pH 7,0 para reemplazar la solución de pectina.
En los experimentos con rojo Nilo y curcumina, la concentración total
de biopolímero fue de 0,8 mg/ml (es decir, 0,4 mg/ml de proteína y 0,4
mg/ml de pectina). Sin embargo, para el retinol, la concentración total
de biopolímero fue de 0,2 mg/ml (es decir, 0,1 mg/ml de proteína y 0,1
mg/ml de pectina).
Como el voltaje del detector se fijó en 600 V, la fluorescencia de fondo sobre
un pH de 3,0 a 7,0 (es decir, la intensidad de la propia proteína en ausencia de
pectina) fue insignificante en comparación con la fluorescencia del colorante. Para
las mezclas de β-Lg y pectina, la contribución de la intensidad de fluorescencia de
fondo debida a las interacciones proteína/polisacárido a pH 4,5–7,0 también fue
marginal. Sin embargo, los complejos insolubles de β-Lg/pectina se formaron por
debajo de pH 4,5 (especialmente el LMP), donde las interacciones más fuertes de
β-Lg/pectina condujeron a una mayor turbidez de la solución. En consecuencia, la
dispersión de la luz resultó en una mayor intensidad de fluorescencia de fondo.
Por lo tanto, los resultados mostrados ya se habían corregido al restar la
fluorescencia de fondo de los datos sin procesar. No obstante, los datos a pH 3,0–
4,5 en presencia de pectina deben tratarse con cuidado, como se analiza a
continuación.
Los cambios de turbidez para 0,4 mg/ml de β-Lg (con y sin 0,4 mg/
ml de pectina) al reducir el pH de 7,0 a 3,0 se mostraron como valores
de absorbancia a 425 nm.
La afinidad de unión de los complejos proteína-colorante se analizó
según la ecuación de tipo Langmuir:
F
F=MÁX.×C (1)
(1/K) +C
Donde elFes la intensidad de fluorescencia de las mezclas de colorantes y proteínas;
FMÁX.es la intensidad de fluorescencia de saturación de los colorantes;Ces la
concentración de β-Lg (μM);kes la constante de asociación (y 1/Kpuede ser
H. Li et al.
indicado como la constante de disociación (kd)).
2.3. Estadísticas
Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes y se
muestran como media±DAKOTA DEL SUR. La diferencia entre las muestras se
evaluó mediante ANOVA de una vía. La regresión no lineal se realizó en el software
GraphPad Prism 9.0 (San Diego, EE. UU.).
3. Resultados y discusión
3.1. Unión de rojo Nilo con β-Lg
El rojo Nilo es una sonda sensible a la polaridad que generalmente exhibe un mayor
rendimiento cuántico y una longitud de onda de emisión máxima más corta en solventes
menos polares (Sacket & Wolff, 1987;Teo et al., 2021). En un ambiente acuoso (es decir,
un solvente altamente polar), el rojo Nilo es básicamente insoluble (o altamente
agregado), y su intensidad máxima de fluorescencia (FI) fue extremadamente baja (por
ejemplo, FI por debajo de 2 enFigura 1B y C) a una longitud de onda de emisión máxima (
λmáximo) de 660 nm, independientemente del pH de 3,0 a 7,0.
En presencia de β-Lg 30 μM a pH 7,0, el FI máximo de Nile Red 1,2 μM
aumentó hasta aproximadamente 165 y se desplazó hacia el azul con una emisión
máxima de alrededor de 606 nm. Con un pH de 3,0 o 4,5, el FI del rojo Nilo
también mejoró (alrededor de 49) yλmáximose desplazó al azul a longitudes de
onda entre 625 y 632 nm. Por lo tanto, estos resultados demostraron claramente
la unión del rojo del Nilo a β-Lg, por lo que el colorante entró en un entorno
menos polar en relación con el agua. Como había presente una pequeña cantidad
de α-lactoalbúmina en las muestras, también se realizaron experimentos similares
con β-Lg muy pura y se obtuvieron espectros idénticos (datos no mostrados). En
consecuencia, β-Lg jugó un papel dominante aquí y la existencia de una fracción
menor de α-lactoalbúmina no afectó las conclusiones (Marrón, 1993).
Teniendo en cuenta la dependencia del pHλmáximo, se planteó la hipótesis de que el
rojo del Nilo podría unirse a dos sitios diferentes (es decir, con diferentes polaridades) en
condiciones de pH neutras y ácidas, respectivamente. Como se mencionó en la sección
de introducción (es decir, la existencia de dos sitios de unión), se puede inferir que el rojo
del Nilo se une principalmente a la cavidad hidrofóbica interna de β-Lg a pH 7,0 pero a la
superficie exterior a pH 3,0 y 4,5. Estos
Figura 2.Intensidad de fluorescencia (FI) y longitud de onda máxima de emisión (λmáximo) de rojo Nilo 1,2 μM en función de la concentración de β-Lg a pH 7,0 (A), 4,5 (B) o 3,0 (C). (Para la
interpretación de las referencias al color en la leyenda de esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).
4
Hidrocoloides alimentarios 133 (2022) 108020
las diferencias podrían estar relacionadas con los cambios conformacionales de β-
Lg, donde el bucle EF ocluye la entrada a la cavidad interna en este último caso (
Uhrínová et al., 2000a).
Para dilucidar aún más las interacciones, se determinaron los espectros de
fluorescencia del rojo Nilo en función de la concentración de proteína a diferentes
niveles de pH. EnFigura 2, el FI se mejoró gradualmente y elλmáximose desplazó
hacia el azul a medida que aumentaba la concentración de proteína. Además, la
estabilidad de la fluorescencia del rojo Nilo (es decir, 0 min frente a 60 min)
aumentó a concentraciones de proteína más altas. En pH 7.0, elλmáximose
estabilizó a 606 nm a 10 μM β-Lg, mientras que a pH 3.0 y 4.5 elλmáximodisminuyó
continuamente hasta 40 μM y luego se estabilizó a 625–632 nm. Tenga en cuenta
que la relación molar es mucho más alta que la estequiometría común de 1: 1 o 1:
2 y, sin embargo, no ha alcanzado la saturación.
Se cree que el efecto del tiempo sobre la estabilidad de FI se debe al hecho de
que el rojo del Nilo en un solvente polar tiene una fuerte tendencia a
autoagregarse en agregados más grandes, lo que conduce a la pérdida de
fluorescencia (Ray, Das y Chattopadhyay, 2019). A concentraciones de proteína
más altas, la probabilidad de que la molécula de colorante encuentre una
molécula de proteína mejorará y, por lo tanto, aumentará la unión. Por lo tanto, es
más probable que Nile Red se una a la proteína que se agregue consigo mismo.
Además, las constantes de disociación (kd) a diferentes condiciones de pH se
determinaron ajustando los resultados obtenidos con una ecuación no lineal de
tipo Langmuir (Ecuación(1)). El más bajokdse encontró a pH 7,0, seguido de valores
comparables a pH 4,5 y 3,0. Por lo general, cuanto menor sea elkd, más favorable
es la unión proteína-ligando. Los muy variadoskdcombinado con la diferencia de
polaridad (por ejemplo, desplazadoλmáximoy rendimiento cuántico de fluorescencia
reducido) podría respaldar la hipótesis anterior de la existencia de dos sitios de
unión diferentes y una mayor afinidad de unión a pH 7.0. Los espectros 3D a
continuación proporcionan más evidencia de este punto.
Durante la titulación de pH de complejos de proteína-tinte preformados a partir de pH
7,0 a 3,0, los espectros de fluorescencia de la interacción proteína-colorante se
registraron en tiempo real. Los resultados se resumen enFig. 3A y B. El FI
disminuyó bruscamente entre pH 7,0 y 6,0 y se mantuvo constante entre pH 5,5 y
4,0, y luego aumentó ligeramente cuando el pH se redujo aún más a 3,0. Mientras
tanto, elλmáximodesplazado hacia el rojo durante la acidificación. El color de la
solución cambió de rosa a púrpura tras la observación visual. El FI reducido puede
deberse a que había más moléculas de rojo Nilo en un entorno más polar (es
decir, con menor rendimiento cuántico de fluorescencia), como
H. Li et al. Hidrocoloides alimentarios 133 (2022) 108020

Fig. 3.Intensidad de fluorescencia (FI, A) y longitud de

onda máxima de emisión (λmáximo, B) de rojo Nilo 1,2 μM
en presencia de mezclas de β-Lg (0,4 mg/mL) o β-Lg-
pectina (LMP o HMP) (0,4 mg/mL+0,4 mg/mL) durante la
acidificación de pH 7,0 a 3.0. La fotografía insertada
muestra el cambio de color reversible de las muestras
de pH 3,0 (izquierda) a 7,0 (derecha). La flecha amarilla
indica el ajuste de pH de 3,0 a 7,0; Espectros 3D de rojo
Nilo (1,2 μM) en presencia de β-Lg (40 μM) a pH 3,0 (C) y
pH 7,0 (D). (Para la interpretación de las referencias al
color en la leyenda de esta figura, se remite al lector a
la versión web de este artículo).

indicado por los espectros 3D (Fig. 3C y D). Además, debido a la mayor k cargas, podría desencadenar la liberación del ligando. La razón del FI ligeramente
den condiciones ácidas (tabla 1), la disminución de FI podría atribuirse a aumentado a pH 3,0 no está clara. Mientras que este efecto podría atribuirse a la
la disociación entre el rojo del Nilo y la cavidad hidrofóbica de β-Lg. ligera protonación del rojo del Nilo, también se observó un fenómeno similar para
el retinol (como se analiza más adelante).
De hecho, la llamada "transición de Tanford" también ocurre en pH 6.0-7.0, Fig. 3A y B también muestran claramente que el FI yλmáximode rojo Nilo no se
donde la estructura del bucle EF tiende a cerrar la puerta a la cavidad interna a vieron afectados por la presencia de pectina (ya sea LMP o HMP) a pH 7,0. Tras la
medida que se reduce el pH. Inesperadamente, el colorante encapsulado también acidificación, las curvas de FI básicamente se superpusieron con las de ausencia
se liberó o excluyó de la cavidad (p. ej., aproximadamente un 80 % de pérdida de de pectina (a pH 4.5–7.0). Estudios previos que utilizaron dispersión de luz y
FI a pH 5,5, en Fig. 3A), posiblemente debido a las interacciones estéricas microbalanza de cristal de cuarzo han demostrado que la formación de complejos
desfavorables que surgen de la molécula de colorante y el bucle EF (Ragona et al., intramoleculares de pectina bajos en metoxi proteína de suero se inicia alrededor
2000). Por debajo de pH 5.0, elλmáximofluctuó alrededor de 625–630 nm, lo que de pH 6.5 (Girard et al., 2002;Li, Wu, Doost, Su y van der Meeren, 2021). Al bajar el
indica que el rojo del Nilo estaba unido a un sitio más polar, probablemente pH, la atracción electrostática se vuelve más favorable y se forman complejos
correspondiente a la superficie exterior de β-Lg. Estos resultados reflejan los de solubles. Por debajo de pH 4,5 se pueden obtener agregados insolubles o
Zsila, Hazai y Sawyer, 2005quien también descubrió que la piperina unida en la coacervados. Sin embargo, parece que la complejación con cadenas de pectina no
cavidad de β-Lg se liberaba gradualmente al bajar el pH de 7,0 a 4,5. Este hallazgo fue capaz de evitar que las moléculas de colorante se liberaran de la cavidad
también está de acuerdo con un estudio de espectroscopía de RMN que durante la acidificación. Además, los complejos solubles preformados a pH 5,0
demuestra la reducción del área del pico del ácido palmítico en los complejos de también se mezclaron con rojo Nilo 1,2 μM (datos no mostrados), donde el FI yλ
β-Lg/ácido palmítico al reducir el pH de 7,0 a 2,0, y el análisis cuantitativo reveló máximofueron comparables a las obtenidas por acidificación de pH 7,0 a pH 5,0.
que el 78 % del ácido palmítico unido se había eliminado. liberado de la cavidad Estos resultados implican que el rendimiento de encapsulación de β-Lg no se ve
interna (Ragona et al., 2000). Según los autores, una posible explicación es que un afectado por la adición de LMP o HMP aniónicos a pH 4,5–7,0, lo que permite la
puente salino entre la cadena lateral de Lys83 (hebra E) y Glu74 (hebra D) se formación de complejos solubles alrededor del IEP de la proteína y evita su
interrumpe con la acidificación, lo que suaviza la estructura de la molécula cerca agregación/precipitación. A pH 3,0–4,5, se formaron complejos insolubles
de la entrada. La pérdida de un puente salino, junto con la repulsión electrostática (especialmente para LMP altamente cargado). Como consecuencia adicional, la
de positivo precisión de las mediciones de FI puede verse afectada y los datos deben tratarse
con cuidado. Los valores de FI ligeramente más altos podrían deberse a la
interferencia de la fluorescencia de fondo (p. ej., causada por la dispersión de la
tabla 1 luz de las soluciones turbias) que no se pudo corregir por completo, como se
La constante de disociación (kd) de complejos de proteína-colorante a varios niveles de pH. analiza más adelante enSección 3.3. Tenga en cuenta que las moléculas de β-Lg a
pH β-Lg-rojo Nilo β-Lg-retinol β-Lg-curcumina pH 4,5 tienden a formar oligómeros debido a la repulsión electrostática reducida
alrededor de IEP y la solución de proteína se volvió ligeramente turbia a una
kd(μM) R2 kd(μM) R2 kd(μM) R2
concentración de 200 μM. Sin embargo, el buen ajuste da como resultadotabla 1(R
3.0 61.6±5.2a 0.995 18.3±1.6b 0.998 52,9±2.9b 0.998
2> 0,97) básicamente puede excluir la presencia de errores de medición. Además,
4,5 54,6±11.4a 0.973 30.4±3.1a 0.997 68.0±2.8a 0.999
el contenido soluble de β-Lg no se redujo a este pH ya que la fracción de proteína
7,0 23,8±4.5b 0.970 2.9±0.3c 0.989 58.8±8.8ab 0.986
desnaturalizada (es decir, insoluble a pH 4,6) se había eliminado durante el
Nota lakdlos valores se mostraron como Media±SD de tres repeticiones; Letras diferentes
proceso de purificación.
en una columna indican diferencias significativas (p<0.05).

5
H. Li et al.
Finalmente, el pH se ajustó de nuevo a 7,0. El FI aumentó a 60–80% del FI
original a pH 7.0 y elλmáximovolvió a alrededor de 606 nm, lo que sugiere la
reversibilidad de la unión del tinte (tanto en presencia como en ausencia de
pectina). Mientras tanto, se observó que el color púrpura en condiciones de
pH ácido se volvió rosa de forma reversible a pH 7,0 (resultados no
mostrados).
Estos resultados sugieren que el rojo del Nilo se puede utilizar como una sonda
fluorescente sensible para investigar el efecto de las condiciones ambientales cambiantes
sobre los cambios conformacionales o las propiedades de unión a ligandos de β-Lg. Para
validar aún más estos hallazgos, se analizaron dos sondas fluorescentes hidrofóbicas
adicionales relacionadas con los alimentos (es decir, retinol y curcumina) de acuerdo con
protocolos similares.
3.2. Unión de retinol con β-Lg
Ha sido bien reconocido que el retinol se une principalmente a la cavidad de β-
Lg en condiciones de pH neutro (Cho, Batt y Sawyer, 1994; Considine, Flanagan,
Loveday y Ellis, 2020). En consecuencia, se espera que las propiedades de unión
del retinol sean similares a las del rojo Nilo. Como se muestra enFigura 4A, en
ausencia de β-Lg, el FI fue inferior a 1, independientemente de las variaciones de
pH. Los picos de los espectros apenas se pueden observar, posiblemente debido al
log K mucho más alto.Ay(5,68) de retinol que rojo Nilo (2,76) y curcumina (3,29).
Con la presencia de β-Lg, el FI mejoró en gran medida a 9,2 a pH
4,5, 18,2 a pH 3,0 y 38,9 a pH 7,0. Cabe señalar que el FI de β-Lg-retinol alcanzó los
valores estables segundos después de la mezcla y permaneció básicamente
constante dentro de 1 h. Mientras tanto, elλmáximose observó a 478 nm
independientemente del pH, lo que puede deberse al hecho de que el retinol es
menos sensible a las diferencias de polaridad de la sonda en comparación con el
rojo Nilo. A pH 7,0, la cavidad interna podría ser el sitio de unión principal y se
observó el FI más alto. Por el contrario, la cavidad interna no estaba disponible a
pH 3,0 y 4,5 y, por lo tanto, el retinol podía unirse principalmente a la superficie
externa de β-Lg. Además, el FI a pH 3,0 fue significativamente más fuerte que el de
pH 4,5 en todas las concentraciones de proteína probadas (Figura 4B).
Pasando ahora a las constantes de disociación entabla 1, el más bajokdse
observó a pH 7,0 (es decir, alrededor de 3,2 μM), mucho más pequeño que a pH
6
Hidrocoloides alimentarios 133 (2022) 108020
3,0 (17,2 μM) y 4,5 (27,3 μM), lo que sugiere que la conformación abierta de β-Lg
(es decir, la cavidad interna accesible) es más favorable para unirse al retinol. Elkda
pH 7,0 determinado en este estudio es comparable con algunos valores anteriores
(es decir, entre 0,02 y 10 μM), a pesar de que estos valores varían
considerablemente dependiendo de los parámetros experimentales, como la
temperatura, la selección de modelos de ajuste y la corrección de la efecto de filtro
interno (Keppler, Sönnichsen, Lorenzen y Schwarz, 2014). Asimismo, un método de
extinción de la fluorescencia observó la dependencia del pH kdde complejos β-Lg-
retinol (Dufour, Genot y Haertlé, 1994). Sin embargo,Fugate y Canción (1980)
afirmó que la unión del retinol a β-Lg era independiente del pH en pH 2–7.5.
Con respecto a las interacciones β-Lg/retinol a pH 3,0 y 4,5, este aumento de FI
a pH 3,0 puede deberse a que el retinol interactúa con parches cargados
positivamente de β-Lg a través de la afinidad dipolar con sus dobles enlaces
conjugados, también conocidos como catión pi. interacción (Benjamín et al., 2012).
Además, considerando las estructuras oligoméricas más grandes formadas a pH
4,5, también es posible que el área de superficie reducida causada por la
autoagregación de proteínas impidiera la unión del retinol.
El FI del retinol al bajar el pH de 7.0 a 3.0 se muestra en Figura 4C. El FI
disminuyó abruptamente de pH 7,0 a 5,5, lo que podría sugerir la liberación
de retinol desde la cavidad interna. Posteriormente, el FI aumentó
ligeramente a pH por debajo de 5,0. Además, no se pueden observar
diferencias significativas entre las curvas de FI tras la acidificación,
independientemente de la adición de pectina aniónica. Estos resultados son
consistentes con los obtenidos cuando se usa rojo Nilo. Finalmente, cuando
el pH volvió de 3,0 a 7,0, el FI del retinol aumentó a alrededor de 22, lo que
indica una unión reversible entre β-Lg y retinol.
3.3. Unión de curcumina con β-Lg
El sitio de unión de la curcumina en β-Lg ha sido controvertido durante mucho
tiempo. Algunos estudios previos informaron que la curcumina se unía
principalmente a la cavidad de β-Lg a pH 7,0 según una constante de asociación
más alta a pH 7,0 que a pH 6,0, que se obtuvo a través de un método de extinción
de fluorescencia (Li, Ma y Ngadi, 2013;Sneharani, Karakkat, Singh, &Rao, 2010). Sin
embargo,Hosseini, Emam-Djomeh, Sabatino y van der
Figura 4.Intensidad de fluorescencia (FI) de retinol 1,6
μM en presencia o ausencia de β-Lg 5 μM (A) y en
función de la concentración de proteína (B) a varios
valores de pH. FI yλmáximode retinol 1,6 μM en presencia
de mezclas de β-Lg (0,1 mg/mL) o β-Lg-pectina (LMP o
HMP) (0,1 mg/mL+0,1 mg/mL) durante la acidificación
de pH 7,0 a 3,0 (C) . La flecha amarilla indica el ajuste de
pH de 3,0 a 7,0. (Para la interpretación de las
referencias al color en la leyenda de esta figura, se
remite al lector a la versión web de este artículo).
H. Li et al.
Meeren (2015)sugirió el principal sitio de unión para la curcumina existente en la
superficie exterior de β-Lg, que también fue respaldado por otro estudio de
acoplamiento molecular (Zhang et al., 2022).
Los presentes resultados muestran que las interacciones β-Lg/curcumina
son menos afectadas por las variaciones de pH, e incluso se vuelven más
favorables al bajar el pH de 7.0 a 3.0. El FI de la curcumina alcanzó un valor
estable al mezclarse con β-Lg y permaneció casi constante dentro de una
hora (datos no mostrados). como se muestra enFigura 5A, la fluorescencia
de la curcumina fue muy débil sin β-Lg: fue de aproximadamente 10 a unaλ
máximode 498 nm, independientemente de los valores de pH. Para aclarar, el
voltaje del detector en estas mediciones se aumentó a 800 V ya que el FI
intrínseco de la curcumina (incluso en presencia de β-Lg) fue mucho más
bajo que el de las otras dos sondas. Al mezclar con β-Lg 30 μM, el FI mejoró
a alrededor de 110 a pH 7,0 o 6,0, 139 a pH 4,5 y 169 a pH 3,0. No se mostró
el espectro fluorescente a pH 6,0 ya que era muy parecido al de pH 7,0.
Mientras tanto, elλmáximoa 498 nm no se vio afectado por los cambios de pH.
La curcumina puede ser menos sensible a la polaridad que el rojo del Nilo,
que también es el caso del retinol. Otra posible explicación es que la
curcumina se une principalmente al exterior de β-Lg, que no debería verse
afectado por el pH debido a la alta estabilidad estructural de la proteína.
FI en función de la concentración de proteína enFigura 5B puede
vincularse fácilmente a la afinidad de unión en función del pH: una mayor
unión de curcumina produciría una fluorescencia más intensa. Como se
muestra entabla 1, sin diferencias significativas enkdse observaron entre pH
4,5 y 7,0 (p>0.05). A pesar de que el promediokdfue ligeramente inferior a pH
3,0, la influencia del pH fue sutil o insignificante en comparación con los
casos de rojo Nilo y retinol.
Por lo tanto, en lugar de unirse a la cavidad interior, parece que la curcumina
se une principalmente a la superficie exterior de β-Lg que es altamente estable
ante cambios de pH. Esta hipótesis también es apoyada por algunos estudios
previos. Riihimäki et al. (2008)compararon las interacciones entre varios
compuestos fenólicos (p. ej., miricetina y daidzeína) y β-Lg y observaron efectos de
pH insignificantes (es decir, pH 7,0 frente a 2,0). Similarmente, Liang y Subirade
(2012)informó la estabilidad ácida de β-Lg/resveratrol
Figura 5.Intensidad de fluorescencia (FI) de curcumina 1,2 μM en presencia o ausencia de β-Lg 30 μM (A) y en función de la concentración de proteína (B) a varios valores
de pH. FI de 1,6 μM de curcumina en presencia de mezclas de β-Lg (0,4 mg/mL) o β-Lg-pectina (LMP o HMP) (0,4 mg/mL+0,4 mg/mL) durante la acidificación de pH 7,0 a
3,0 (C ); Valor de absorbancia a 425 nm de soluciones de β-Lg y β-Lg/pectina sin curcumina en función del pH (D).
7
Hidrocoloides alimentarios 133 (2022) 108020
complejos tras la acidificación de pH 7,0 a 2,0. Ambos estudios propusieron que
los compuestos fenólicos podrían unirse a la superficie externa de β-Lg en lugar
de a la cavidad interna. En consecuencia, la curcumina podría exhibir un patrón de
unión similar.
El método de valoración del pH se utilizó para evaluar la estabilidad del pH de
los complejos de β-Lg-curcumina preformados a pH neutro. Dado que un alto
voltaje del detector (p. ej., 800 V) también produce una señal de fondo mucho más
alta, p. ej., debido a la dispersión de la luz en muestras de alta turbidez, solo se
muestran los resultados a un voltaje de 600 V. Tenga en cuenta que el voltaje del
detector no influye en las conclusiones. Como se muestra enFigura 5C, el FI de la
curcumina fue inferior a 0,6 a pH 3,0-7,0 sin proteína. En presencia de β-Lg, el FI
fluctuó ligeramente (es decir, dentro del 10 %) al bajar el pH de 7,0 a 5,5. En
contraste con el rojo Nilo y el retinol (es decir, 80 % de pérdida de FI), los
resultados indican que la unión de la curcumina no se ve afectada relativamente
por la accesibilidad de la cavidad interna. Además, no se observaron cambios
significativos de rojo o azul en azul o rojo durante la reducción del pH. Cuanto
mayor sea el FI y menorkda pH 3.0 podría sugerir un aumento en la unión de la
curcumina, lo que puede deberse a un aumento en las interacciones de los
cationes pi (consulte la discusión en sección 3.2). Algunos estudios previos
también afirmaron que la curcumina interactúa con proteínas (por ejemplo, β-
caseína) a través de interacciones electrostáticas a pH 2.0–3.0 (Zembyla, Murray B
y Sarkar, 2018;Zhao, Qin y Zhong, 2021), pero es menos probable considerando el
alto pKa de la curcumina (es decir, entre 7,7 y 9,0).
A pH 4,5–7,0, las curvas FI de β-Lg-HMP y β-Lg-LMP esencialmente se
superpusieron con las de solo β-Lg, lo que sugiere que la complejación de HMP y
LMP no tuvo efecto en los sitios de unión de la curcumina. Sin embargo, el FI fue
mucho mayor en presencia de pectina (especialmente LMP) por debajo de pH 4,5.
De hecho, se formó una gran cantidad de complejos insolubles (particularmente
para LMP) a pH 4.5-3.0, lo que resultó en una turbidez de la solución y una
fluorescencia de fondo mucho mayores. La mayor turbidez de LMP se atribuyó a
su mayor densidad de carga que podría unir más moléculas de proteína en la
saturación (Girard et al., 2002;Jones, Lesmes, Dubin y McClements, 2010). En
consecuencia, el FI más grande se debió al hecho de que el fuerte efecto de
dispersión de la luz no pudo ser efectivamente
H. Li et al.
corregido por simple resta (versección 2.2), en lugar de mejorar la unión de
la curcumina (Kumar Panigrahi y Kumar Mishra, 2019). En general, el efecto
de dispersión de la luz es menos pronunciado a longitudes de onda de
excitación más altas y concentraciones de biopolímero total más bajas, como
se demostró en los experimentos con rojo Nilo y retinol.
No obstante, la adición de pectina está destinada principalmente a mejorar la
estabilidad coloidal de la proteína alrededor de su IEP (es decir, alrededor de 5,2).
Por encima de pH 4,5, la interferencia con FI debida a la dispersión de la luz estuvo
prácticamente ausente, como lo confirmaron los valores de absorbancia a 425 nm
(Figura 5D) de las mezclas de β-Lg/pectina. En este escenario, los resultados
pueden probar que la complejación electrostática con pectina no influyó
negativamente en la unión de la curcumina. Por último, un ajuste de pH de 3,0 a
7,0 restauró el FI a su valor original (es decir, alrededor de 5) antes de la
acidificación.
4. Conclusión
El pH más favorable para la unión de β-Lg con rojo Nilo o retinol se
observó a pH 7,0 debido a la conformación abierta (es decir, cavidad interior
accesible) de β-Lg. A pH 3,0–4,5, las interacciones entre las dos sondas y β-Lg
fueron menos favorables y los tintes solo pudieron unirse a la superficie
exterior de β-Lg, posiblemente debido al hecho de que el bucle EF ocluía la
entrada a la cavidad interior. Para los complejos preformados de β-Lg-rojo
Nilo o β-Lg-retinol a pH 7,0, la acidificación provocó la liberación de ligandos
de la cavidad interna de β-Lg (p. ej., liberación repentina de pH 7,0 a 5,5), lo
que podría deberse a algunas interacciones estéricas en condiciones de pH
ácido. A pesar de que la pectina aniónica forma complejos moleculares con
β-Lg por debajo de pH 6,5, parece que no se puede evitar la liberación de las
sondas hidrofóbicas.
En cuanto a la curcumina, su afinidad de unión con β-Lg se vio
menos afectada por las variaciones de pH, aunque la intensidad de la
fluorescencia fue ligeramente mayor a pH 3,0 que a otras condiciones
de pH. Los resultados actuales sugieren que la curcumina se une
principalmente a la superficie exterior de β-Lg. Asimismo, la
acidificación de pH 7,0 a 3,0 aumentó el FI de los complejos de
proteína-curcumina preformados, posiblemente debido a una mayor
unión de curcumina. Además, la adición de pectina aniónica (LMP o
HMP) apenas afectó la unión de la curcumina a un pH de 4,5 a 7,0. Por
debajo de un pH de 4,5, la formación de complejos insolubles de β-Lg/
pectina (es decir, soluciones turbias) provocó errores en las mediciones
de fluorescencia. Además, se encontró que estas interacciones
proteína-ligando eran reversibles.
Declaración del autor
Hao Li: Conceptualización; curación de datos; análisis formal;
Investigación; Metodología; Validación; Visualización; Escritura - borrador
original; Administración de proyecto; Recursos; Software; Teng Wang:
Redacción - revisión y edición; Software; Jiaqi Su: Escritura - revisión y
edición; Paul Van der Meeren: Supervisión; Redacción: revisión y edición.
Declaración de competencia de intereses
No existe conflicto de intereses en la presentación de este manuscrito, y el
manuscrito está aprobado por todos los autores para su publicación.
Disponibilidad de datos
Los datos que se han utilizado son confidenciales.
Reconocimiento
El Consejo de Becas de China (CSC) recibió un agradecimiento por
otorgarle a Hao Li una beca de doctorado (NO. 201906330092) en la
Universidad de Ghent.
8
Hidrocoloides alimentarios 133 (2022) 108020
abreviaturas
β-Lg β-lactoglobulina
LMP pectina baja en metoxi
HMP pectina alta en metoxi
FI Intensidad fluorescente
λmáximo longitud de onda máxima de emisión
PEI punto isoeléctrico
kd constantes de disociación
k constante de asociación
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