Guía Práctica 4 G 50A - 50B Talleres y Laboratorios de Ingeniería de Alimentos I - Proteínas 17 Noviembre

ESCUELA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
PROGRAMA INGENIERÍA DE ALIMENTOS

TALLERES Y LABORATORIOS DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS I
PRACTICA 4: 50A– 50B. Identificación de la estructura primaria de proteínas – determinación del pH
isoeléctrico – determinación de solubilidad de proteínas por acidez – temperatura y solventes orgánicos –
identificación cualitativa de presencia de proteínas
Preparado por: Ing. Libardo Castañeda Florez
e-mail: libardo.castaneda@correounivalle.edu.co
Fecha: 17 noviembre 2021
INTRODUCCIÓN
Las proteínas en conjunto forman algo funcional, éstas se construyen por medio de uniones peptídicas entre aminoácidos,
lo cual da como resultado la estructura: primaria. La estructura: primaria corresponde a la secuencia de los aminoácidos.
De la estructura primaria se genera la secundaria y esta da origen a la terciaria y esta a su vez a la cuaternaria. Existen
factores que causan una destrucción de la estructura cuaternaria, terciaria y secundaria con la pérdida de la actividad
biológica. Este proceso se denomina “Desnaturalización" (Melo y Cuamatzi, 2007, 98).
Las proteínas, debido a que están compuestas totalmente o en su mayor parte por aminoácidos, poseen propiedades que
reflejan en gran medida las propiedades de los constituyentes. Entre las propiedades ácido-base de las proteínas en
solución, podemos hablar del pH isoeléctrico (pI), el cual está determinado cuando la carga neta de la molécula es cero
(Díaz y Begovich, 2004). La carga total de la molécula proteica depende pues, del pH de la solución y del número relativo
de cada aminoácido en la molécula.
OBJETIVOS
 Identificar la estructura primaria de proteínas a partir de bases de datos usando usando visualizadores de
estructuras
 Analizar la estructura secundaria y terciaria de proteínas obtenidas en bases de datos.
 de proteínas.
 Determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de una proteína.
 Provocar la desnaturalización de proteínas por diferentes métodos
 Identificar proteínas haciendo uso de la reacción de Biuret.
 Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de proteínas hidrosolubles en solución acuosa.
 Separar proteínas de una solución acuosa de proteínas hidrosolubles utilizando precipitación salina.
Fundamento teórico Péptidos, estructura secundaria, proteínas, α-hélice y hoja β.
Los péptidos (del griego πεπτός, peptós, digerido) son un tipo de moléculas formadas por la unión de varios
aminoácidos mediante enlaces peptídicos.
Figura 1. Reacción de formación del enlace peptídico.
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El enlace peptídico es un enlace covalente entre el grupo amino (–NH2) de un aminoácido y el grupo carboxilo
(–COOH) de otro aminoácido. Los péptidos y las proteínas están formados por la unión de aminoácidos
mediante enlaces peptídicos. El enlace peptídico implica la pérdida de una molécula de agua y la formación de
un enlace covalente CO-NH. Es, en realidad, un enlace amida sustituido. Podemos seguir añadiendo
aminoácidos al péptido, pero siempre en el extremo -COOH terminal.
Los péptidos, al igual que las proteínas, están presentes en la naturaleza y son responsables por un gran número
de funciones, muchas de las cuales todavía no se conocen.
La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido, y si el número es alto, a una proteína,
aunque los límites entre ambos no están definidos.
Clasificación de péptidos:
 Oligopéptido: de 2 a 9 aminoácidos - Polipéptido: entre 10 y 100 aminoácidos - Proteína: más de 100

aminoácidos.
Las proteínas con una sola cadena polipeptídica se denominan proteínas monoméricas, mientras que las
compuestas de más de una cadena polipeptídica se conocen como proteínas multiméricas.
La estructura secundaria de las proteínas es el plegamiento regular local entre residuos aminoacídicos cercanos
de la cadena polipeptídica. Se adopta gracias a la formación de enlaces de hidrógeno entre los grupos carbonilo
(-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos involucrados en las uniones peptídicas de aminoácidos cercanos en la
cadena. Estos también se los encuentra en forma de espiral aplana.
Hélice alfa: En esta estructura la cadena polipeptídica se desarrolla en espiral sobre sí misma debido a los giros
producidos en torno al carbono beta de cada aminoácido. Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de
hidrógeno intracatenarios formados entre el grupo el grupo -C=O del aminoácido "n" y el -NH del "n+4"
(cuatro aminoácidos más adelante en la cadena).
Un ejemplo particular es la Hélice de colágeno: una variedad particular de la estructura secundaria,

característica del colágeno, proteína presente en tendones y tejido conectivo. Existen otros tipos de hélices:
Hélice 310 (puentes de hidrógeno entre los aminoácidos "n" y "n+3") y hélice Π (puentes de hidrógeno entre
los aminoácidos "n" y "n+5"), pero son mucho menos usuales.
Hoja plegada beta o ß-plegada: Cuando la cadena principal se estira al máximo que permiten sus enlaces
covalentes se adopta una configuración espacial denominada cadena beta. Algunas regiones de proteínas
adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre sí estableciendo uniones mediante enlaces de hidrógeno
intercatenarios. Todos los enlaces peptídicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo así gran
estabilidad a la estructura.
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La forma en beta es una conformación simple formada por dos o más cadenas polipeptídicas paralelas (que
corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en direcciones opuestas) y se adosan estrechamente por
medio de puentes de hidrógeno y diversos arreglos entre los radicales libres de los aminoácidos. Esta
conformación tiene una estructura laminar y plegada, a la manera de un acordeón.
Giros beta-ß: Secuencias de la cadena polipeptídica con estructura alfa o beta, a menudo están conectadas entre
sí por medio de los llamados giros beta. Son secuencias cortas, con una conformación característica que impone
un brusco giro de 180 grados a la cadena principal de un polipéptido.
(C)
Figura 2. Principales estructuras secundarias de las proteínas: (A) β-plegada, Tachiplesina I; (B) α-hélice, Magainina 2, (C)
Giros beta-ß. [4-6]
https://www.youtube.com/watch?v=wvTv8TqWC48
Fundamento teórico reconocimiento de proteínas
Para saber si una sustancia desconocida, es una proteína se utiliza el reactivo de Biuret es aquel que detecta la
presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de
composición desconocida. Está hecho de hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato cúprico (CuSO4).
El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH). La
reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de
coordinación entre los iones Cu+2 y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos, esto si la reacción da positiva. Cuando la reacción de Biuret da negativa, queda de color
azul.
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Figura 3. (Izq.: resultado negativo derecha.: positivo)
Figura 4. Complejo formado entre la proteína y el ión Cu+2
El Reactivo de Biuret indica la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más
enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.
Está hecho de hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio
(KNaC4O6·4H2O). El reactivo cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con
polipéptidos de cadena corta. El hidróxido de sodio no participa en la reacción, pero proporciona el medio
alcalino necesario para que pueda ocurrir la reacción.
Figura 5. Efecto adición Reactivo de Biuret a la Albumina
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También se puede aplicar Biuret por medio del método colorimétrico que permite determinar la concentración
de proteínas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm
(para detectar el ion Cu+2).
Fundamento teórico Caseína
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K),
minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los
aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece
la leche son el hierro y la vitamina C.
La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche
y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra
en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas
globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones
intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo
solubilizadas en suspensiones coloidales.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por
acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de proteínas que están químicamente
unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos
por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de
sal cálcica (Caseinato cálcico). La leche líquida contiene aproximadamente entre 2,7% y 3,5% de proteínas
totales de las cuales cerca del 77% al 82% son de caseína.
La caseína está formada por α (S1), α (S2) - caseína, ß-caseína, y kappa-caseína (K-caseína), formando una
micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la
kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es
solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las α y beta
son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.
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Figura 6. La kappa caseína, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella .
También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los
carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en
agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente a las α y β caseína
insoluble, lo que da lugar a la formación de la micela.
Figura 7. Efecto de la acidez sobre la solubilidad de la caseína
La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6

aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se
añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se
protonan) y la proteína neutra precipita
Ca+2 Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2
La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares.
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El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e
inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes disulfuro.
De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la
desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos
hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua.
En cambio, es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y
acetato sódico.
La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble
en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estomago para favorecer una nutrición eficiente.
Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticos y
suero. Estas micelas ocupan del 6 -12% del volumen total de la leche.
Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio ácido son proteínas
globulares, hidrofilicas y fácilmente solubles en agua, así como susceptibles de desnaturalización por calor. Las
principales son ß lacto globulina, α lacto albumina, bovine serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig).
Fundamento teórico pH Isoeléctrico pHI
Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica
de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los
aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína
de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas
dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido
a que los grupos COOH de los aminoácidos Aspártico y Glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos
amino de Arginina y Lysina estarían protonados (-NH3+). De igual forma si la proteína se encuentra en un
medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían
desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se
le denomina punto isoeléctrico (pHI). En el punto isoeléctrico (pHI), se encuentran en el equilibrio las cargas
positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su
solubilidad y facilitar su agregación.
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Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta
de la proteína dependería exclusivamente de la protonación /desprotonación de los grupos amino y carboxilo
terminal. En la realidad las proteínas están formadas por muchos aminoácidos unidos mediante enlaces
peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminoácidos que la componen y del
pH del medio.
Figura 8. Enlace peptídico entre dos aminoácidos
Fundamento teórico precipitación salina de las proteínas
Es una técnica en donde se logra la precipitación de una fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza
iónica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción
proteína-H2O porque quita la capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando
la precipitación de las mismas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para
todas las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas
particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH 4)2SO4 para tal fin, a
causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato de amonio/1000 mL de agua a una temperatura de 20 °C) y
porque el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas. La adición gradual de ésta sal permite el
fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas, pero no desnaturalizadas.
Fundamento teórico desnaturalización proteínas
Si en una disolución de proteínas se producen cambios de pH, alteraciones en la concentración, agitación

molecular o variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de las proteínas puede verse reducida hasta el
punto de producirse su precipitación. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformación globular se
rompen y la proteína adopta la conformación filamentosa. De este modo, la capa de moléculas de agua no
recubre completamente a las moléculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre sí dando lugar a grandes
partículas que precipitan. Además, sus propiedades biocatalizadores desaparecen al alterarse el centro activo.
Las proteínas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseñadas, en
resumen, no son funcionales.
Esta variación de la conformación se denomina desnaturalización. La desnaturalización no afecta a los enlaces

peptídicos: al volver a las condiciones normales, puede darse el caso de que la proteína recupere la
conformación primitiva, lo que se denomina renaturalización.
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Ejemplos de desnaturalización son la leche cortada como consecuencia de la desnaturalización de la caseína, la

precipitación de la clara de huevo al desnaturalizarse la ovoalbúmina por efecto del calor o la fijación de un
peinado del cabello por efecto de calor sobre las queratinas del pelo.
Fundamento teórico desnaturalización de la enzima α-amilasa
Para esta parte, se utilizó la saliva de un grupo de estudiantes, la velocidad de reacción para la α-amilasa
corresponde a la temperatura del cuerpo, en caso contrario, su acción de degradación es afectada (Ponce, 2010,
P. 4). La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del
almidón, polisacárido formado por amilosa y amilopectina. Las uniones de glucosa en la amilosa y en algunos
de la amilopectina son enlaces α- C1-C4, enlaces que rompe la α-amilasa (Garrido, S.f. p. 1).
MATERIALES
MATERIAL MATERIAL
Diez vasos desechables de 25 mL Termómetro digital (1)
Dos vasos de precipitado de 50 mL Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro
12 tubos de ensayo Potenciómetro (pH-metro)
Un vaso de precipitado de 250 mL Acetato sódico 0,1 N
Probeta de 50 mL Ácido acético 0,01 N
Matraz aforado de 50 mL Ácido acético 0,1 N
Pipeta graduada de 5,0 mL Ácido acético 1,0 N
Pipeta graduada de 1,0 mL NaOH 1,0N
Pipeta graduada de 10,0 mL NaOH 20%
Embudo de vidrio mediano Etanol al 70%
Papel de filtro Reactivo de Biuret: Solución de NaOH al 20% - Solución de CuSO4 al
1% y Tartrato de sodio y potasio
Espectrofotómetro Éter etílico grado analítico
Nota: cada grupo debe aportar 500 mililitros de leche entera – 100 mL de solución de yema de huevo
(deben llevarla preparada con 4 yemas) – 100 mL de Jugo de zanahoria rallada (deben llevarla
preparada con media zanahoria pequeña) – 50 gramos gelatina sin sabor
Procedimiento para preparar las soluciones:
500 mL. de solución de acetato sódico 0,1 N: (4,00 g acetato de sodio y diluir en agua destilada y completar
hasta 500 mL. con agua destilada)
1000 mL de solución de ácido acético 0,1 N: (6,00 g acético glacial y diluir en agua destilada y completar hasta
1000 mL. con agua destilada)
100 mL ácido acético 0,01 N: (0,06 g acético glacial y diluir en agua destilada y completar hasta 100 mL. con
agua destilada)
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500 mL ácido acético 1,0 N: (30 g acético glacial y diluir en agua destilada y completar hasta 500 mL. con agua
destilada)
300 mL NaOH 1,0 N: (12 g NaOH y diluir en agua destilada y completar hasta 300 mL. con agua destilada)
Procedimiento 1: Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de proteínas
Metodología
Existen muchas bases de datos en donde se pueden encontrar las secuencias en aminoácidos y ácidos nucleicos
de proteínas. Para esta práctica se hará uso de estas bases de datos.
1. Cada grupo escogerá 4 secuencias problema (de 4 proteínas diferentes) a las cuales les debe realizar los
análisis descritos desde el ítem 2 al 6.
2. Ingrese a la página de protein data bank http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do En esta página puede
buscar proteínas por palabras claves. Escoja 4 proteínas diferentes.
3. Descargue la secuencia de la proteína en formato FASTA y en formato PDB.
4. Reporte el número de residuos de aminoácidos, punto isoeléctrico, el número de hojas β y de α-hélices.
5. Descargue un visualizador de proteínas, en internet se encuentran varios para esta práctica se recomienda
uno de los más sencillos http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm Siga las instrucciones e
instale el programa.
6. En el visualizador RasMol abra cada una de las proteínas descargadas en el ítem a (en formato PDB), resalte
las estructuras secundarias y juegue con el visualizador.
Procedimiento 2: Aislamiento de la caseína
Metodología
1. Caliente en un vaso de precipitado 150 mL de agua destilada a 38 ºC, añada 50 mL. de leche y
luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 1N, hasta que observe que se forma un
precipitado (la leche se corta).
2. Deje sedimentar y filtre al vacío sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.
3. Lave el precipitado con 20 mL de etanol en el mismo filtro.
4. Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
5. Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente pesado, vuelva a pesar el
vaso con el precipitado y luego adicione 5 mL de éter etílico/g de precipitado.
6. Filtre nuevamente.
7. Deseche el líquido. Pese el precipitado blanco que es la caseína.
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Procedimiento 3: Preparación de la solución de caseína
Metodología
1. Coloque aproximadamente 250 mg (0,25 g) de caseína en un vaso de 50 mL.
2. Agregue 20 mL de agua destilada y 5 mL de NaOH 1,0 N; agite hasta lograr una solución total de la caseína.
3. Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml.
4. Tome 50 mL de solución de la caseína preparada y adicione 5 ml. de ácido acético 1,0 N y diluya con agua
destilada hasta 50 mL y mezcle bien.
5. Observe que la solución sea clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.
Procedimiento 4: Determinación del pHI de la caseína
Metodología
1. En diez vasos desechables de 25 mL limpios y secos, adicione exactamente los volúmenes de los reactivos
según la siguiente tabla:
Tabla1. pHExp para Mezcla de Soluciones de Acetato de Sodio y Ácido Acético
VASO Acetato de Ácido Acético Ácido Acético pHT pHExp

No. sodio 0,1N 0,01 N
0,1 N (mL) (mL)
(mL)
1 0,5 9,5 0,0 3,2
2 1,0 9,0 0,0 3,6
3 1,5 8,5 0,0 3,8
4 2,0 8,0 0,0 4,0
5 3,0 7,0 0,0 4,2
6 4,0 6,0 0,0 4,5
7 6,0 4,0 0,0 4,7
8 8,0 2,0 0,0 5,1
9 6,0 0,0 4,0 5,5
10 8,0 0,0 2,0 6,1
2. Medir experimentalmente el pH de todos los vasos, (debe cubrir un rango aproximado semejante al teórico
(3 a 6,5).
3. Anotar los valores reales en la Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso creciente.
4. Añadir a cada vaso 1,0 mL de la disolución de caseína preparada en el punto 2 del procedimiento 3.
5. Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.
6.
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7. En el espectrofotómetro medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de

colorimetría de 1 cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de cada
tubo para obtener una solución/ suspensión homogénea antes de verter una parte en la cubeta.
8. Anotar resultados en la Tabla 2
Tabla 2. pHExp Vs. Absorbancia para Mezclas de Soluciones de Acetato de Sodio y Ácido Acético
VASO Acetato de Ácido Ácido Acético pHT pHExp Absorbancia
No. sodio Acético 0,01 N (640 nm)
0,1 N 0,1N (mL)
(mL) (mL)
1 0,5 9,5 0,0 3,2
2 1,0 9,0 0,0 3,6
3 1,5 8,5 0,0 3,8
4 2,0 8,0 0,0 4,0
5 3,0 7,0 0,0 4,2
6 4,0 6,0 0,0 4,5
7 6,0 4,0 0,0 4,7
8 8,0 2,0 0,0 5,1
9 6,0 0,0 4,0 5,5
10 8,0 0,0 2,0 6,1
Con los datos de absorbancia a diferentes pH se realiza una tabla y posteriormente una gráfica mostrando todos
los puntos evaluados.
La caseína está compuesta por a, b y k-caseína las cuales tienen puntos isoeléctricos diferentes en un rango de
4.4 a 5.7, en promedio de 4.6
Procedimiento Solubilidad de las proteínas. Desnaturalización de las proteínas
5 A. Metodología: Desnaturalización por pH extremo
1. Tome 2 mL de la solución de yema de huevo

2. Mida el pH y regístrelo en la Tabla 3.
3. Agregar lentamente por las paredes del tubo 2 mL. de Ácido Nítrico HNO3 concentrado hasta que se formen
dos capas.
4. Luego mezcle cuidadosamente utilizando un agitador
5. Medir nuevamente el pH y anotar el resultado.
6. Repetir procedimiento con la solución de la otra proteína (gelatina sin sabor).
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Tabla 3. Efecto del pH de soluciones de proteína sin desnaturalizar y con desnaturalización
VASO pH sin Coagulación pH con Coagulación

Ácido Nítrico Positiva Negativa Ácido Nítrico Positiva Negativa
HNO3 HNO3
Solución de
proteína 1
(Yema de
huevo)
Solución de
Proteína 2
(Gelatina sin
sabor)
5 B. Metodología: Desnaturalización por calor
1. Tome cuatro tubos de ensayo y cada uno agregar 4 mL de solución proteica: dos con la misma proteína
(albumina) y dos con otra proteína (gelatina sin sabor)
2. Luego colocar uno de los tubos en un baño de agua a ebullición durante 10 minutos y el otro a temperatura
ambiente
3. Observar y registrar los resultados de las dos proteínas en la Tabla 4
Tabla 4. Efecto de la Temperatura en solubilidad de proteínas sin desnaturalizar y con desnaturalización

VASO T ebullición Coagulación Tambiente Coagulación
Positiva Negativa Positiva Negativa
Solución de proteína
1 (Yema de huevo)
Solución de Proteína
2 (Gelatina sin sabor)
5 C. Metodología: Desnaturalización por precipitación de solventes orgánicos
1. Tome cuatro tubos de ensayo y adicionar a cada uno 2 mL de solución de una solución proteica albumina y
otros cuatro con gelatina sin sabor
2. A uno de los tubos de una proteína agregue: 2 ml de etanol al 70% - a otro 2 mL de acetona al 70% – al otro
2 mL de hexano al 70% y el otro sin nada.
3. agitar cuidadosamente. Repetir procedimiento la otra proteína
4. Observe y registre los resultados en la Tabla 5.
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VASO Solución Etanol Solución Acetona Solución hexano Sin Solvente

70% 70 % 70% Orgánico
Coagulación Coagulación Coagulación Coagulación
+ - + - + - + -
Solución de proteína 1
(Yema de huevo)
Solución de Proteína 2
(Gelatina sin sabor)
6. Procedimiento de desnaturalización de la enzima α-amilasa
a. Cada grupo debe recoger 15 mL de saliva de uno de los integrantes

b. Tome un tubo de ensayo y agregar 1 mL de solución de almidón
c. Agregar 1 mL de saliva, agitar y esperar que actúe la α-amilasa sobre el polisacárido.
d. Agregar al tubo anterior dos gotas de Lugol
e. Registre como positiva la prueba si aparece una coloración violeta o como negativa en caso contrario.
f. Agregar a otro tubo de ensayo 1 mL de la solución de saliva y agregar 10,0 mL de HCl al 10%
g. Agitar y esperar que actúe el ácido sobre la α-amilasa de la saliva (altera el pH de la enzima provocando la
desnaturalización de la α-amilasa)
h. Al tubo anterior agregar 5 mL de solución de bicarbonato al 10% para neutralizar el exceso de HCl
i. Luego agregar 1,0 mL de solución de almidón y agite el tubo.
j. Luego agregar dos gotas de Lugol
k. Registre en la Tabla 6 como positiva la prueba si aparece una coloración violeta o como negativa en caso
contrario.
VASO Saliva Natural Saliva + HCl (10%) +

bicarbonato (10%)
Solución Lugol Solución Lugol
+ - + -
Solución Almidón
Procedimiento 7. Identificación de la presencia de proteínas
Metodología:
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1. Tome 5 mL de solución de albumina (yema de huevo) en un tubo de ensayo

2. Tome 5 mL de solución de zanahoria en otro tubo de ensayo
3. A cada tubo adicionar 5 mL de solución de NaOH al 20 %
4. Adicione 3 gotas de solución de CuSO4 al 1,0 % con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O).
5. Registre en la Tabla 7 como positiva la prueba si aparece una coloración violeta o como negativa en caso
contrario.
Tabla 7. Identificación de la presencia de proteínas por medio del Reactivo de Biuret
Vaso Reactivo de Biuret solución
de NaOH 20% + CuSO4 +
KNaC4O6.4H2O
+ -
Solución yema de huevo
Jugo de zanahoria
Figura 8. Efecto adición del Reactivo de Biuret a una solución proteica

Preguntas:
1 Explique los procesos fisicoquímicos que ocurre en cada uno de los diferentes procedimientos realizados
(Reacciones Químicas)
2 ¿Qué información adicional es reportada en la página de la protein data bank?
3 ¿De dónde sale la información reportada en la página?
Graficar el pHExp Vs. Absorbancia (A) a 640 nm de cada tubo en el apartado 3.
4 Grafique pHExp Vs. Transmitancia T; sabiendo que A = – log T; T = 10-A
5 Determine el porcentaje de error del pHI de la caseína establecido por el método experimental contra el pHI
teórico:
(pHIExp – pHITeórico)
% error = ---------------------------- x 100
pHITeórico
6 ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? Según el gráfico

7 Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pHI?
15
Bibliografía
1. Ofennema, Introducción a la Química de alimentos. Editorial Reverte. España, 1993

2. Mark Leslie F. Análisis moderno de los Alimentos. 1971
3. Bernal, R. I. Análisis de Alimentos. 1993
4. Coultate, Tom P. Alimentos. Química de sus componentes. 1954
5. Vojda Odon. I. Química de Alimentos. 1976
6. Belitz H. D. Química de Alimentos.
7. Koradi R, Billeter M, Wuthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular
structures. J Mol Graph 1996;14(1):29–32.
8. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
9. Visualizador RasMOl: http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm
16

Guía Práctica 4 G 50A - 50B Talleres y Laboratorios de Ingeniería de Alimentos I - Proteínas 17 Noviembre

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ESCUELA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

PROGRAMA INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Fundamento teórico Péptidos, estructura secundaria, proteínas, α-hélice y hoja β.

Figura 1. Reacción de formación del enlace peptídico.

 Oligopéptido: de 2 a 9 aminoácidos - Polipéptido: entre 10 y 100 aminoácidos - Proteína: más de 100

Un ejemplo particular es la Hélice de colágeno: una variedad particular de la estructura secundaria,

Fundamento teórico reconocimiento de proteínas

Figura 3. (Izq.: resultado negativo derecha.: positivo)

Figura 4. Complejo formado entre la proteína y el ión Cu+2

Figura 5. Efecto adición Reactivo de Biuret a la Albumina

Figura 7. Efecto de la acidez sobre la solubilidad de la caseína

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6

Ca+2 Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2

La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares.

Fundamento teórico pH Isoeléctrico pHI

Figura 8. Enlace peptídico entre dos aminoácidos

Fundamento teórico precipitación salina de las proteínas

Fundamento teórico desnaturalización proteínas

Si en una disolución de proteínas se producen cambios de pH, alteraciones en la concentración, agitación

Esta variación de la conformación se denomina desnaturalización. La desnaturalización no afecta a los enlaces

Ejemplos de desnaturalización son la leche cortada como consecuencia de la desnaturalización de la caseína, la

Fundamento teórico desnaturalización de la enzima α-amilasa

Procedimiento para preparar las soluciones:

Procedimiento 1: Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de proteínas

Procedimiento 2: Aislamiento de la caseína

Procedimiento 3: Preparación de la solución de caseína

Procedimiento 4: Determinación del pHI de la caseína

Tabla1. pHExp para Mezcla de Soluciones de Acetato de Sodio y Ácido Acético

VASO Acetato de Ácido Acético Ácido Acético pHT pHExp

7. En el espectrofotómetro medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de

Procedimiento Solubilidad de las proteínas. Desnaturalización de las proteínas

5 A. Metodología: Desnaturalización por pH extremo

1. Tome 2 mL de la solución de yema de huevo

Tabla 3. Efecto del pH de soluciones de proteína sin desnaturalizar y con desnaturalización

VASO pH sin Coagulación pH con Coagulación

5 B. Metodología: Desnaturalización por calor

Tabla 4. Efecto de la Temperatura en solubilidad de proteínas sin desnaturalizar y con desnaturalización

5 C. Metodología: Desnaturalización por precipitación de solventes orgánicos

Tabla 5. Efecto de la Temperatura en solubilidad de proteínas sin desnaturalizar y con desnaturalización

VASO Solución Etanol Solución Acetona Solución hexano Sin Solvente

6. Procedimiento de desnaturalización de la enzima α-amilasa

a. Cada grupo debe recoger 15 mL de saliva de uno de los integrantes

Tabla 6. Efecto de la Temperatura en solubilidad de proteínas sin desnaturalizar y con desnaturalización

VASO Saliva Natural Saliva + HCl (10%) +

Procedimiento 7. Identificación de la presencia de proteínas

1. Tome 5 mL de solución de albumina (yema de huevo) en un tubo de ensayo

Figura 8. Efecto adición del Reactivo de Biuret a una solución proteica

6 ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? Según el gráfico

1. Ofennema, Introducción a la Química de alimentos. Editorial Reverte. España, 1993

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