PLAN DE EXTRACCIÓN DE COMPONENTES

Grupo 7
Rubén Guzmán
Mario Villamizar
Santiago Santos
Lukas Rey

1. Extraer la muestra objetivo, realizar lisis enzimática celular y homogeneizar el contenido en

un tubo de ensayo.

2. Colocar el tubo en una centrifugadora de alta velocidad, para posteriormente realizar

centrifugación diferencial a 2500 x g durante al menos 15 minutos (Rivadeneira, 1987),
buscando separar en un inicio los fragmentos de membrana de otros componentes como
orgánulos, proteínas solubles y posibles células intactas (Merck, 2023). Se realiza este
proceso de manera seriada, en presencia de inhibidores de proteasas y DNAsas (ídem). En
este caso, puede ser utilizada una solución en HEMES 20mM (para mantener un pH estable)
junto con TPCK (coctel enzimático inhibidor de proteasas) 0.1 mM, evitando que se degraden
las proteínas de membrana (Rivadeneira, 1987).

Para la extracción de los componentes de membrana microalgales, se realiza un

pretratamiento, en el cual, las microalgas son separadas por ozoflotación y centrifugadas a
15000 g por 10 minutos en una centrifugadora Beckman Coulter a 20 °C. La biomasa
resultante se lleva a la estufa a calentar a 50 ° C. (Valeriano González et al., 2016).

3. Los lípidos se tratan con una solución homogénea de cloroformo-metanol, con una
proporción de (2:1 v/v). Dicha mezcla se centrifuga a 1500 g, 20 ° C durante 15 minutos con
la centrifugadora Beckman Coulter. (González-Balderas et al., 2020). Esta solución se deja
toda la noche a 4 °C. Posteriormente se hace un filtrado al vacío con un papel de filtro de
microfibra de vidrio de Whatman. Esto permite filtrar el sobrenadante y, el pellet puede ser
retenido para la extracción de proteínas. Por último, el filtrado se deposita en un Erlenmeyer
previamente pesado y, se dispone a incubar a 40 ℃ y 50 rpm con centrifugadora Beckman
Coulter. La cuantificación total de lípidos se calcula restando el peso del matraz con el peso
final constante.

4. Para la extracción de proteínas, se toma el pellet resultante de la ultracentrifugación y se

coloca bajo una solución (usualmente un detergente como Triton X-114, IGEPAL CA-630 o
CHAPS) que pueda solubilizarlas sin que se desnaturalizen; en conjunto debe realizarse en
presencia de agentes reductores que impidan la oxidación, y, por ende, pérdida de la
estructura protéica (Tan & Yiap, 2009). Sin embargo, este proceso puede ser prescindido si
se utiliza ácido estirenomaléico (SMA), el cual genera una bicapa lipídica muy parecida a un
microdisco alrededor de la proteína de membrana (Hawkins et al., 2021). Se adiciona una
solución al 5% (w/v) de SMA, y se pone en agitación constante durante al menos 1 hora. Se
 realiza nuevamente ultracentrifugación a 100.000 g por 20 minutos a 4°C para separar
posibles proteínas solubles (Hawkins et al., 2021). El material insoluble puede llevarse a
electroforesis en dos dimensiones, en presencia de SDS para la posterior caracterización de
las proteínas.

5. Para la extracción de carbohidratos, se suspendió el pellet celular en agua destilada y se

mezcló con ácido sulfúrico concentrado al 10% (v/v). La hidrólisis se realizó a 100 ℃ durante
1 hora y la suspensión resultante se centrifugó a 1500 g, 20 ℃ durante 15 minutos. El
sobrenadante se utilizó para cuantificar los carbohidratos utilizando el método del ácido
fenol-sulfúrico. En este método, los carbohidratos reaccionan con el ácido sulfúrico y el ácido
fenol para producir una solución coloreada, y se realizaron al menos tres repeticiones.