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Instituto Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey

Campus Puebla
Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas
Departamento de Biotecnología
Materia: Bioseparaciones (BT3010)
Grupo 1
Semestre: Agosto – Diciembre 2015
Profesor:
Dr. Alberto Jesús Donayre Torres
Nombre del Proyecto:

Purificación de Glucosa Isomerasa termoestable con métodos de
Ruptura Celular (Downstream processing) en Streptomyces
Flavogriseus.
Presentan:
Kayra Ixchel Castillo Cruz A01324805
Miguel Ojeda Millán A01099203
Aldo Betancourt Sánchez A01324454
Isis Sánchez Salgado A01098826
Fecha de entrega: 6 de noviembre 2015

cristalización e incluso inmovilización de las enzimas. El primer paso de la bioseparación como tal lo constituye cosechar la biomasa a partir del medio fermentado. De este modo se han desarrollado nuevas técnicas de separación para asegurar tanto la integridad del producto como su factibilidad económica.Introducción La separación y purificación de los bioproductos representa un reto en la industria. se extrae la glucosa isomerasa por sonicación. En cuanto a los rendimientos generales de los procesos estudiados se mantienen bajos. que es encargada de transformar la glucosa en fructosa y así producir el jarabe de fructosa. autolisis o ruptura enzimática. por uso de agentes surfactantes. entre el 3% y el 11%. Como etapa de purificación los autores concuerdan con uno o varios pasos de cromatografía. según lo propuesto en los artículos revisados. sin embargo usan distintos tipos de modos de operación Lee y colaboradores proponen el uso de cromatografía de afinidad mientras que Chen y colaboradores y Takasaki y colaboradores utilizan cromatografía de intercambio iónico. contaminación. Posteriormente. donde utilizan una enzima llamada glucosa isomerasa. Debido a esto decidimos investigar sobre distintos métodos de obtención y purificación de la glucosa isomerasa. enfocándonos en el Downstream del bioproceso para poder analizar la eficiencia de los procesos actuales en cuanto al rendimiento de producto con respecto a los recursos usados. etc. por lo que se debe analizar cada operación unitaria para buscar una opción más efectiva para esta bioseparación. cuyo rol principal en la industria es sintetizar jarabe de fructosa a partir de glucosa. Finalmente el paso de acabado. ya que es un producto intracelular. La glucosa isomerasa es una endoenzima de tipo isomerasa producida por microorganismos del género Streptomyces. Siguiendo con el proceso se utilizan diversas estrategias de concentración de la fracción enzimática de interés como la precipitación. puede estar constituido por diálisis. En muchas industrias se utilizan bioseparaciones para obtener diversos bioproductos. según su proceso. . la cual los autores la hacen por centrifugación o filtración. Ésta posee una gran importancia a nivel industrial y por ende la cantidad demandada del producto en el mercado es muy grande. filtración y/o centrifugación. un ejemplo de esto es la industria alimenticia. En la literatura seleccionada se comienza por la fermentación de medio de cultivo para la producción de la enzima de interés con diversas cepas de Streptomyces. ya que muchos compuestos de interés son intracelulares o inestables cuando se someten a variaciones de temperatura. pH.

y recomendaciones nuestras para complementarlo y volverlo más eficiente. .Esquema del Bioproceso: Esquema 1. Septiembre 20). Bioproceso seleccionado. (1979. tomando partes de los artículos Takasaki Y. P. (2014) y Chen W.

“quitándole” el agua a la proteína y causando su precipitación.. 2. Obteniendo un total de 21. flavogriseus. se agregan 3. Purificación. Se obtienen 10.6 kg de proteína con un Rendimiento global hasta este punto: 100%. Rendimiento por paso: 100% (Takasaki Y. Rendimiento por paso: 76. más los 8.250 kg de células húmedas.000 litros que salen del filtro rotatorio. 1969).. ya que el sulfato al ser una sal se disocia e interacciona con el agua. Se realiza una centrifugación de tanque rígido para recuperar la torta formada en los extremos del tanque.5-7.0 con 10 N NaOH. (Takasaki Y.000 litros entrantes. La purificación se lleva a cabo a una temperatura de 5°C para asegurar la estructura y las propiedades de la enzima permanezcan intactas. De manera continua se recuperará la torta utilizando rasadores.000 litros de acetona.0 y 40°C durante 6 horas. la cual además no es buena a nivel industrial. Una cepa de S. 5. Rendimiento global hasta este punto: 57. 1969). Con esto se pretende separar las células del medio de cultivo para que no interfiera con la autolisis. aislada del suelo y se inocula en 30.000 lts y se mantiene un pH entre 6. Una vez recuperada. 7.Descripción del Bioproceso: 1. más los 9.485 kg de proteína es la misma cantidad ya que lo único que hace el sulfato es precipitar las proteínas.9%. 2. ésta . 6. 3.000 lts de agua destilada.5% licor de maíz fermentado y 0.09% (Takasaki Y. con el pH ajustado a 7. Centrifugación: La primera centrifugación se lleva a cabo con una centrífuga de discos con descarga intermitente a 12. Extracción: Este procedimiento se lleva a cabo con un agente tensoactivo catiónico como el cloruro de cetilpiridinio. el cual debe ser descartado. 4. Se obtienen 2. Inoculación del cultivo. Fermentación: El caldo de cultivo inoculado del paso anterior se deja fermentar de 2530 horas con flujo de aire 7500 lt/min. las cuales son resuspendidas en 7. Posteriormente se agrega sulfato de amonio ((NH4)2SO4). 90% volumen con el fin de precipitar las proteínas.000 litros de medio con 1% de paja de arroz hidrolizado hemi celulósico. Se obtienen 7. donde el rendimiento de este paso es casi completo en comparación con la sonicación. Filtración: Posterior a la autolisis se somete la suspensión a un filtro rotatorio al vacío para separar los restos celulares del bioproducto GI. 1969). Lo que se estima que salga son aproximadamente 7. Después se agrega acetona al sobrenadante (80% volumen) mientras se agita para remover los iones metálicos.1% MgSO4-7H20. De este cultivo se obtienen los 30.000 rpm por 6 horas. lo cual fomentará la formación de un precipitado. El medio es elegido gracias a que la bibliografía menciona que en estos medios se produce una mayor cantidad de glucosa isomerasa..485 kg de proteína. Entran los 10. se lava la torta para asegurar que la mayor parte de glucosa isomerasa se quede en el caldo clareado.000 lts de caldo con las células crecidas. Se debe mantener en agitación (200 rpm) a 30°C en un fermentador de acero inoxidable.000 litros de caldo clareado con glucosa isomerasa en él.000 litros de sulfato de amonio para formar un total de 19.

0002M a un pH de 6. se eligió el modelo Westfalia Separator SC6-06-076 usado en la industria cervecera para la recuperación de levaduras ya que los volúmenes usados y las características de la mezcla en esta industria son muy similares a las .000 litros de cultivo de Streptomyces flavogriseus en 6 horas. El procedimiento de purificación es mejorado utilizando una cromatografía con la resina DEAE-Sephadex A-50 equilibrada con buffer de fosfatos a una concentración de 0. Después este paso se obtiene 5.05M de buffer de fosfato de sodio para realizar una diálisis y así deshacerse de las sales utilizadas como el sulfato de amonio.5M para recuperar el bioproducto. la bolsa es colocada en una solución de sulfato de magnesio al 0. Se estima que se obtendrá 6. Después de una revisión exhaustiva de centrifugación de biomasa . Debido a que la cantidad que se obtiene después de la diálisis sólo se puede determinar experimentalmente. En este paso se obtiene un rendimiento global del 7. ya que en este paso se obtiene un rendimiento global de 30% (Takasaki Y.3%. 1969). debido a que a este pH nuestra enzima tienen una carga neta negativa. Después se coloca en un refrigerador y se espera 4 horas y se aumenta la concentración de acetona a un 40% (v/v).48 kg de proteína después de este proceso. lo que se asemeja a las condiciones requeridas en una producción industrial.68 kg de proteína. de esta forma todos los compuestos cargados neutra o positivamente no se adherirá a la columna. teniendo un rendimiento global hasta este paso de 27. 8.8% para lo cual obtenemos una masa de 1. Se realiza posteriormente una elución con el mismo buffer conteniendo KCl a una concentración de 0. la concentración es aumentada a 45% y después a 50%(Takasaki Y.85 kg de proteína. Cálculos y Resultados: Para el diseño de la centrifugación se definió el volumen a procesar de 30. 1969) con esta información se obtiene un rendimiento por paso del 87%. para este caso en especial. los cristales de glucosa isomerasa son recolectados por centrifugación y secados.5. Acabado: La solución enzimática obtenida es diluida en agua para obtener una solución de 1-2 mg de proteína por mililitro. 1969) y un rendimiento por paso del 90. consideraremos las pérdidas despreciables. posteriormente es agregado acetona hasta llegar a una concentración del 30%(v/v).05M y ajustando el pH a 7. 10.005M y cloruro de cobalto al 0.1% (Takasaki Y. a esta concentración la glucosa isomerasa comienza a cristalizarse.05M. El rendimiento por paso es del 28. La proteína obtenida es recolectada y dializada con agua destilada.8%. La cromatografía se realiza con una resina de dietilaminoetil (DEAE) ajustando el pH a 7 con un buffer de fosfatos a una concentración de 0. después se coloca en una bolsa de celofán para realizar una diálisis. El tubo de celofán es dializado con una solución de acetona al 50% para remover los iones metálicos restantes.se resuspende en 0. 11. 9.

Bernard. 2008) Velocidad angular ω 12.06 g/ (Lindegren. & Stewart. 2008) discos Gasto (en modelo) 5. Calculo del factor Σ para el modelo: Σ= 2 πn ω2 3 ( R0−R3i ) cotθ 3g . 2011). 2008) Para diseñar el equipo de centrifugación se utilizó el factor de escalamiento Σ. Bernard. Bernard. & Stewart. & Stewart. 2008).02 g/ cm Gravedad (g) Viscosidad (μ) Diámetro de la centrifuga g μ dc 9. μm dl 2012) levadura 1. Q1 2008) Volumen a procesar V 30. Bernard. R1 2008) discos Ángulo de los θ 40° (Chlup. presentado en 1957 por Ambler. & Stewart. & Stewart. Bernard. por lo tanto es aplicable en este caso porque el modelo de centrifuga es el mismo. 1953) ρ celular ρc cm3 ρ del medio ρm 1.81 0. Montesinos. En la Tabla 1 se presentan los datos y parámetros usados en la operación. R0 2008) los discos Radio interno de los 31 mm (Chlup. Bernard. & Stewart. Tabla 1.0102 600 Supuesta 3 m/ s 2 g/cm*s mm --Supuesta (Chlup.requeridas por un proceso industrial (Chlup. & Stewart. 2008) Radio externo de 62 mm (Chlup. & Guzmán. & Stewart. Bernard. con igual geometría y capacidad (Tejeda.500 L/h (Chlup.000 rpm (Chlup. Centrifuga de discos: modelo Westfalia Separator SC6-06-076 Variable Simbolo Valor Unidad Fuente gía es Numero de discos n 76 (Chlup.000 L Estimado con la demanda Tiempo estimado t 6 h Requerido por el de procesamiento bioproceso Diámetro de la 3 (Trujillo & Alexandro. El cual se usa para escalar parámetros en centrifugas de geometría similar. Bernard.

000 L 6h Q2=5.81 ) m/s ( 2 π ( 76 ) 2 Σ= 2 ) s1 (.031 ) m∗cot ⁡( 40) 2 3 3 Σ 2=6367 m 2 Ecuación de escalamiento: Σ 1 Q1=Σ 2 Q2 Σ1 Q1 =Σ 2 Q2 Calculo del flujo requerido en la operación: Q 2= V t Q 2= 30.0132 m2∗5. La cual es congruente con procesos similares presentados en la industria cervecera (Bernard. & Stewart.0 62 −.500 ) h Σ 2= 5.π∗12000 60 3 ( 9. Chlup.0623−0. √ ω= 2 √ Σ∗3 g cotθ∗( R30 −R 3i )∗2 π∗n m ) s2 ω= cot ⁡( 40)∗( 0.000 L/ h Calculo de factor Σ para nuestro bioproceso: L (0. 2007).0313 )∗2 π∗(76) 2 7234 m2∗3(9.000 L/h Σ 2=7234 m2 Una vez obtenido el factor Σ para nuestro proceso específico se utilizó la ley de Stokes para calcular la velocidad de rotación en radianes por minuto.81 .

0102 ) V g =1.06−1.ω=1317 rad 12585 rpm s Con la ayuda de la ley de Stokes se calcularon la velocidad terminal en el campo gravitacional para después poder determinar el tiempo de sedimentación de las partículas y el tiempo de sedimentación para validar el proceso.02 ) g/cm 3∗981 cm s2 g cm∗s V g =¿ 18 ( 0. Gracias a los conocimientos adquiridos en la clase de bioseparaciones podemos también elegir de manera correcta a nuestro parecer los distintos equipos y métodos .92 x 10−5 cm s Calculo de tiempo de sedimentación: t s= [ [ R0 g ∗ln ⁡( ) 2 Ri V g∗ω ] ] cm s 62 t s= ∗ln ⁡( ) 2 31 cm 2 π∗12. razones que enlistamos a continuación. V g= d2 Δρg 18 μ 0.000 1 1.92 x 10−5 ∗( ) 2 s 60 s 980 t s=2041 s  0.56 h Discusión: Revisando los 3 artículos nos dedicamos a armar nuestro propio bioproceso eligiendo las mejores operaciones unitarias de cada uno con base en distintas razones. en otras palabras aquellas que ya habíamos visto en clase.3 x 10 2 2 (¿¿−4) cm ∗( 1. Uno de los factores más influyentes en nuestra selección fue escoger aquellas operaciones con las que estuviéramos relacionados.

June). La siguiente operación unitaria fue el Filtro Rotatorio al Vacío utilizado para nuestra única filtración. así alteran la permeabilidad de la membrana y forma poros en ella.9% (acetona 44-70% con sulfato de amonio). Después se eligió la centrífuga de tazón rígido. el segundo artículo maneja el Bromuro de hexadeciltrimetilamonio que también es un agente tensoactivo catiónico. además de que este agente tenso-activo tiene un rendimiento más completo y mayor a la sonicación. comparando rendimientos de 49% (solo sulfato de amonio) a 57. Como resultados obtuvimos que para un volumen de procesamiento de 30. colectándose a través de unas exclusas en la parte superior para después proceder a la autolisis. esto nos permite recuperar las células y deshacernos del medio de cultivo gracias a la acción del rebosamiento. La primera centrifugación seleccionada fue una centrífuga de discos debido a que los artículos no especifican en sí cuál tipo de centrífuga usan..000 lts.utilizados. Una desventaja sería que si la torta formada es impermeable o difícil de separar de la tela no se puede utilizar el filtro además de que los gastos de instalación son elevados. sin embargo se requieren altos costos de inversión. y tienen una alta adherencia en diferentes sustratos y persistencia de adhesión. cuyas ventajas es que vamos a poder recuperar el precipitado de glucosa isomerasa. Para la extracción se decidió usar un agente tensoactivo catiónico. ajustándose con el mínimo error a la bibliografía. Estos poseen una carga positiva en su parte hidrofílica. evidentemente el segundo es el más eficiente y entre sus ventajas se encuentra: la alta selectividad y el alto rendimiento. que dan como resultado productos de alta pureza. colectada mediante las válvulas de exclusión de sólidos de la descarga intermitente. Bhosale. además sabemos que opera de manera continua pues los rasadores van quitando la . por lo que cambian las propiedades superficiales de los compuestos y convierte la superficie hidrofílica en una hidrofóbica y viceversa. después del sulfato de amonio. (Monreal P. Snehalata H. et. esto porque como la bibliografía nos menciona Streptomyces sp. Es una bacteria Gram positiva por lo que podemos usar un agente químico para romperla. por lo que estos son la mejor opción. se requieren 12585 rpm por 6h. La purificación con acetona se seleccionó porque tiene mucho más rendimiento que solo el fraccionamiento con sulfato de amonio. Se eligió debido a que necesitamos la formación de torta (donde van los restos celulares) y deshacernos de ella para recuperar el clareado con nuestro bioproducto y demás biomoléculas. se puede decir que este agente es un detergente usado en las técnicas de permeabilización. nos inclinamos por la ya mencionada debido a que es de las más utilizadas y también involucra la formación de torta. Además esta centrífuga es de excelente uso para grandes volúmenes a tratar como en este caso. al. Con el sulfato de amonio aseguramos la precipitación completa de la glucosa isomerasa. 2009). así como los riesgos relacionados con el uso de solventes. (1996. Además conocemos perfectamente los cálculos necesarios para obtener el gasto de ésta y saber cuánto volumen procesaremos en determinado tiempo.

con estas dos cromatografías aseguramos la separación de la glucosa isomerasa. por lo que lo sugerimos como la mejor opción para la producción industrial de la glucosa isomerasa. Conclusión: Después de haber consultado la literatura seleccionada y de haber comparado las operaciones unitarias presentadas en ella.8% de enzima recuperada. ya que esta operación unitaria nos permite obtener un producto puro a gran escala sin la necesidad de utilizar equipo costoso. Artículos seleccionados: . En términos generales los rendimientos en los procesos estudiados se mantienen bajos. No obstante este modelo de bioproceso. Como solvente orgánico se seleccionó la acetona ya que es miscible en el agua pero inmiscible con la glucosa isomerasa a bajas temperaturas por lo cual el procedimiento de cristalización se llevó a cabo en un refrigerador y se aumentó gradualmente la concentración de acetona hasta llegar a la formación de cristales.9% a tan solo el 30% de producto recuperado. Para las cromatografías se eligió el tipo de intercambio aniónico.torta conforme se necesita por lo que no detendremos el proceso. Septiembre 20). P. la única desventaja sería que se quedara un poco de precipitado en el tanque. entre el 3% y el 11% . Como segundo punto crítico tenemos la cristalización la cual reduce el rendimiento global de 27. y por lo tanto el que disminuye considerablemente la eficiencia de la separación es la columna de celulosa en la que se baja el rendimiento global de 57. de esta forma se puede realizar el proceso de cristalización sin mayor problema. (1979.1% al 7. posteriormente se realizó otra cromatografía ahora con la resina DEAE Sephadex ya que ésta aunque sea una intercambiadora de aniones débil mantiene una alta capacidad de trabajo constante y su rango de pH es amplio variando de 2-9. como se mencionó con anterioridad. por lo que se eligió la opción de mayor eficiencia en la combinación de cada una de sus operaciones que ofrece como rendimiento global final un 11 % de producto al final del acabado. Como procedimiento de acabado se realizó una cristalización. debido a que se sabe que la glucosa isomerasa a un pH 7 presenta una carga positiva (Takasaki Y. Se concluye que el paso clave en el que se pierde la mayor cantidad de producto. Chen W. prueba tener el mejor desempeño en cuanto a recuperación de enzima se trata en comparación con los otros artículos consultados. se encontró el método por el que se puede obtener mayor rendimiento en comparación de los demás. además de que este reactivo es barato en el mercado. lo que representa pérdidas en el proceso. 1969) por lo cual se eligió la resina DEAE celulosa ya que esta resina presenta un grupo funcional amino con carga positiva lo cual lo hace ideal para nuestra cromatografía.

Takasaki Y. 1527-1534). P. Dielectric analysis and multicell electrofusion of the yeast Pichia pastoris for electrophysiological studies. Montesinos.pdf Anexos: Paso Rendimiento por paso Rendimiento global . & Stewart. A.alimentosargentinos. The Journal of Membrane Biology . S. Bibliografía: Bernard.. J.. 114 (1). Immobilization. and Some Properties of Glucose Isomerase from Streptomyces flavogriseus.. A method for deterninig the weight of an Individual Yeast Cell. pp. México: McGraw Hill. C. G. G... & Alexandro. 1639-1642. México: Pearson. G. (2012). Bernard. et. Chen W.gob. Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase. June 29). Journal of the American Society of Brewing Chemists . Terpitz. Disc Stack Centrifuge Operating Parameters and Their Impact on Yeast Physiology. Chlup. XVIII. 29-37. P. (2012). En Agricultural and Biological Chemistry( p. M. pp. D. (1996. et al. (2007). 03/11/15.. Crystallization and Some Properties of Glucose Isomerase from Streptomyces sp. S. C. 815-826. G. 45-61. A. y otros. 153-156. & Stewart. Micología médica básica (4a ed. U. (1953). 20. Tejeda. (2009). BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING . Chlup. Bioseparaciones. MICROBIOLOGICAL REVIEWS. D. Purification. Sonora. Journal Of The Institude Of Brewing ..280-300. Chiba City.. Monreal P. H. al. S. Purification of Glucose Isomerase by Affinity Chromatography . Trujillo. (1979. S. Lindegren. BHOSALE. Japón: Taylor & francis. Biological Research Laboratory . 1111-1119. de Alimentos argentinos Sitio web: http://www. L. (1976. June).. Lee Y. B. & Guzmán. SNEHALATA H. The Disc Stack Centrifuge and its Impact on Beer Quality . P. 65 (1).ar/contenido/sectores/tecnologia/Ficha_10_Fraccio namiento. Applied Environmental Microbiology. H... Studies on Sugar-isomerizing Enzyme Purification. pp. CRISTALIZACIÓN FRACCIONADA.. Hermosillo. 38(6). H. Septiembre 20). (2008). R.). R. G.. U. B.. 245 (12). (2011). (1969).

9 30 27.1 7.8 .8 Tabla 2.09 acetona DEAE Celulosa 87 DEAE Sephadex A-50 90. Purificación de glucosa isomerasa de Streptomyces flavogriseus (%) 100 57.3 Cristalización 28.(%) 100 Extracción (permeabilización) Fraccionamiento con 76.