9

Captulo 2

LA PATOLOGA EN LA AUTOPSIA
El profesor William Boyd escribi con su estilo inimitable:
La patologa se inici en la camilla de autopsias. La importancia de la autopsia para la patologa se destaca en la inscripcin en latn en una sala de autopsias, que significa: ste es el
sitio donde la muerte ayuda a la vida. Como se afirm en el captulo anterior, el italiano G. B. Morgagni (1682-1771) y el francs T. H. A. Laennec (1781-1826) comenzaron a coleccionar informes de casos hospitalarios y a relacionar las caractersticas
clnicas con las lesiones observadas en las autopsias, de manera
que establecieron la correlacin clnico-patolgica. Este mtodo
an se mantiene como la forma ms importante de enseanza
clnica en las instituciones mdicas de todo el mundo.
El minucioso examen posmrtem le india al mdico la patogenia de la enfermedad, le revela los efectos nocivos de la terapia administrada y establece las discrepancias entre los diagnsticos previo y posterior a la muerte; an no se ha hallado un
sustituto para este mtodo.
Hay dos mtodos tradicionales para realizar una autopsia,
que se pueden emplear de forma indistinta:
1. Extraccin en bloque de los rganos abdominales y torcicos.
2. Diseccin in situ de cada rgano por separado.
Cuando se cree que varios rganos podran estar comprometidos, se debe realizar una autopsia completa, pero si se sospecha una enfermedad de un rgano especfico, una miniautopsia o una autopsia limitada podran ser suficientes.
El estudio realizado durante la autopsia proporciona conocimientos y habilidades tanto al mdico como al patlogo. Los
objetivos principales de la autopsia son los siguientes.
1. Evaluacin de la calidad de la atencin del paciente mediante:
i) la confirmacin de la causa de la muerte,
ii) el establecimiento del diagnstico de certeza y
iii) el estudio de la respuesta teraputica.
2. Educacin de todo el equipo comprometido en la atencin del
paciente mediante:
i) el diagnstico en la autopsia de trastornos que, a menudo, pasan inadvertidos en el examen clnico, como por
ejemplo neumona, embolia pulmonar, pancreatitis
aguda, carcinoma de prstata;
ii) el descubrimiento de nuevas enfermedades en la autopsia, como por ejemplo sndrome de Reye, legionelosis
(enfermedad de los legionarios), sndrome de dificultad
respiratoria aguda grave;

iii) el estudio de la demografa y la epidemiologa de las enfermedades y

iv) la educacin de los estudiantes y el personal de patologa.
La reduccin de la tasa de autopsia en todo el mundo durante
los ltimos aos se debe a las siguientes razones:
1. Diagnsticos ms confiables gracias a los avances en las tcnicas de diagnstico por la imagen, como la tomografa computarizada (TC), la resonancia magntica (RM), la angiografa y otras.
2. Temor del mdico frente a la responsabilidad legal por cometer un error.
La estimulacin de la realizacin de autopsias a cargo de
mdicos y patlogos en hospitales de tercer nivel es fundamental para mejorar la atencin de los pacientes y para el avance de
la ciencia mdica.

PATOLOGA QUIRRGICA
PERSPECTIVA HISTRICA
El trmino patologa quirrgica se aplica en la actualidad
como sinnimo de histopatologa, anatoma patolgica, patologa anatmica y patologa celular. La patologa quirrgica es el
mtodo clsico y comprobado para el diagnstico tisular basado en el examen macroscpico y microscpico de los tejidos.
Como se coment, la patologa quirrgica inici el estudio
patolgico de los tejidos obtenidos en las autopsias. Los primeros cirujanos slo dependan de los hallazgos quirrgicos o macroscpicos y descartaban los tejidos resecados sin aprovechar
la oportunidad de realizar un diagnstico microscpico. No
obstante, con los avances tecnolgicos realizados en la industria
de los colorantes en los primeros aos del siglo XX, se desarroll la especialidad de la patologa quirrgica diagnstica a travs de la creacin de la biopsia.
Al comienzo, esta tarea estaba a cargo de un miembro con
experiencia del equipo quirrgico en los departamentos de ciruga, que reciba el nombre apropiado de patlogo quirrgico. En la actualidad, el campo de la anatoma patolgica quirrgica se expandi tanto que se desarrollaron varias
subespecialidades, como nefropatologa, neuropatologa, hematopatologa, dermatopatologa, citopatologa ginecolgica,
patologa peditrica y otras.
LA EXTENSIN Y LAS LIMITACIONES
DE LA PATOLOGA QUIRRGICA
Los servicios de patologa quirrgica de cualquier hospital
grande dependen, sobre todo, del material proporcionado por
los cirujanos y los mdicos familiarizados con la extensin y las
limitaciones de la especialidad. En consecuencia, resulta fundamental que el mdico se pueda comunicar con libertad con el patlogo, tanto de manera formal como informal, a travs de formularios de patologa quirrgica, de forma verbal y en diferentes
foros como reuniones y conferencias interdepartamentales.

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

Tcnicas para el estudio de la patologa

Para aprender la patologa contempornea de manera eficiente, resulta fundamental que el estudiante est familiarizado
con los diversos mtodos de laboratorio, y con las tcnicas y herramientas empleadas para el estudio de esta materia. Este captulo se dedicar a los aspectos bsicos de los mtodos disponibles en los laboratorios modernos de patologa desde la
microscopia bsica, hasta los mtodos ms recientes.

CAPTULO 2

Tcnicas para el estudio

de la patologa

10

LOS PROTOCOLOS DE LA PATOLOGA QUIRRGICA

SECCIN I

FORMULARIOS. La primera tarea y la ms importante del

mdico que solicita un diagnstico tisular consiste en enviar un
formulario completo con los datos de identificacin del paciente, que deben coincidir con los del recipiente con la pieza.
El formulario debe contener toda la informacin relevante sobre el caso y la enfermedad (anamnesis, hallazgos en el examen
fsico y en la ciruga, resultados de otras pruebas bioqumicas,
hematolgicas y radiolgicas relevantes y diagnsticos clnicos
y diferenciales) y referencias a exmenes citolgicos o biopsias
previas en los servicios de patologa.

Patologa general y tcnicas bsicas

RECEPCIN DEL TEJIDO. El personal del laboratorio que recibe la pieza de la biopsia siempre debe controlar la identificacin del paciente en el formulario y en el recipiente con la
muestra. Para el procesamiento habitual de los tejidos con la
tcnica de inclusin en parafina, el tejido se debe introducir en
una solucin fijadora (con mayor frecuencia solucin fisiolgica
y formol al 10% o formalina amortiguada al 10%) o se puede recibir en fresco sin fijar. Para el corte por congelacin, el tejido
siempre se transporta en fresco sin fijacin. La fijacin con microondas tambin se puede usar en el laboratorio para la fijacin rpida y el procesamiento de piezas quirrgicas.
EXAMEN MACROSCPICO. El examen macroscpico de la
pieza recibida en el laboratorio es el paso siguiente ms importante. El corte tisular macroscpico apropiado, la descripcin
macroscpica y la seleccin de una muestra representativa de
tejido de una pieza ms grande son partes esenciales del examen anatomopatolgico del tejido remitido. Un error en este
paso no puede resolverse en un estadio posterior, ya que podra
requerir la separacin de fragmentos de tejido en fresco en caso
de que la pieza sea bastante grande y de que se pueda retrasar
el transporte; o, si la biopsia es pequea y se pierde en el procesamiento, ser necesario realizar otra vez todo el procedimiento quirrgico para obtener la biopsia.
Los laboratorios modernos para la evaluacin macroscpica
disponen de un sistema de grabacin de la descripcin macroscpica a travs de un dictfono sin la necesidad de un asistente
que escriba el informe. Algunos laboratorios tienen un protocolo para la obtencin de fotografas de la pieza macroscpica
y radiografas de la muestra antes y despus del corte del tejido
para su documentacin.
Los tejidos calcificados y el hueso se deben someter a descalcificacin para eliminar los minerales y ablandar el tejido
mediante su tratamiento con agentes descalcificantes, como cidos y quelantes (con mayor frecuencia, cido ntrico acuoso).
Resulta fundamental que todo el personal de la sala de examen macroscpico mantenga precauciones estrictas para la manipulacin de los tejidos infectados con tuberculosis, hepatitis,
HIV y otros virus.
EL LABORATORIO DE HISTOPATOLOGA. Los bloques de
tejido con su nmero de la sala de macroscopia se someten a los
procedimientos del laboratorio. La mayora de los departamentos de histopatologa usa procesadores tisulares automticos
(Fig. 2.1) que cuentan con doce espacios separados para completar el ciclo durante la noche en aproximadamente dieciocho
horas. Se describen a continuacin:
formalina al 10% para su fijacin,
grados ascendentes de alcohol (10, 95% hasta 100%) para
su deshidratacin durante cinco horas en 6 o 7 recipientes,
xileno, tolueno y cloroformo para su limpieza en tres horas
en dos recipientes e
impregnacin en parafina durante seis horas en dos baos
de cera con termostato.

Figura 2.1
Procesador automtico de tejido para el procesamiento
mediante la tcnica de inclusin en parafina.
(Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt.
Ltd., Nueva Delhi.

Para evitar la contaminacin del laboratorio con formalina

y alcoholes, tambin se dispone de procesadores tisulares por
vaco con sistema cerrado.
La fijacin del tejido se realiza en cera derretida, en bloques
que se preparan con molde metlicos L (de Leuckhart). En la actualidad, tambin hay moldes plsticos de diferentes colores
para constituir bloques con las diversas biopsias. Todo el proceso de fijar los tejidos y formar bloques se puede controlar a
travs de la temperatura; adems, hay centros dedicados a la fijacin de los tejidos (Fig. 2.2). Luego, los bloques se cortan despus de su seccin con micrtomo, con mayor frecuencia con
un micrtomo rotatorio, que emplea bistur fijo u hojas de bistur desechables (Fig. 2.3).
El cristato o el corte por congelacin eliminan todos los pasos de procesamiento tisular y de inclusin en parafina. En
cambio, el tejido se congela rpidamente con hielo a alrededor
de 25 C que acta como medio de fijacin, y luego se secciona (Fig. 2.4). A continuacin, los cortes quedan listos para su
tincin. El corte por congelacin es un procedimiento de diag-

Figura 2.2
Centro de inclusin tisular para la tcnica de parafina
(Histocentre).
(Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt.
Ltd., Nueva Delhi.

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

Figura 2.3
Micrtomo rotatorio para la seccin de la pieza con la
tcnica de inclusin en parafina.
(Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt.
Ltd., Nueva Delhi.

nstico intraoperatorio rpido que se puede llevar a cabo en los

tejidos antes de avanzar a una ciruga radical mayor. Asimismo,
tambin se usa para identificar algunos componentes que, en
condiciones normales, se pierden durante el procesamiento en
alcohol o xileno, como por ejemplo los lpidos, las enzimas y
otros. Este procedimiento se puede realizar en el quirfano
cerca de la camilla.

EL CONTROL DE CALIDAD. El control de la calidad de la informacin proporcionada por el laboratorio de histopatologa

es importante para detectar los resultados inadecuados, los procedimientos de actualizacin y los avances en los informes definitivos. Es posible implementar un control de calidad interno
mediante discusiones mutuas en los casos controvertidos y la
autoevaluacin de la calidad de los cortes en el mbito del laboratorio. En la actualidad, tambin se cuenta con programas
de control de calidad externo de todo el laboratorio de histopatologa.
EL HISTOPATLOGO Y LOS ASPECTOS LEGALES. En este
momento, el problema de las demandas por negligencia y mala
prctica en histopatologa se equipara con el que acecha a otras
disciplinas clnicas. En las biopsias y en los casos controvertidos, se pueden solicitar interconsultas internas y externas. Asimismo, la tarea responsable nunca se debe delegar, salvo que el
superior sienta confianza de que su delegado tiene la suficiente
experiencia y capacidad.

TINCIONES ESPECIALES
(HISTOQUMICA)

Figura 2.4
Cristato para la realizacin de cortes mediante la tcnica de congelacin (Cryotones).
(Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt.
Ltd., Nueva Delhi.

Con la tincin de H & E, la hematoxilina tie los ncleos y la

eosina se usa como contratincin para el citoplasma y varios materiales extracelulares. La tincin con H & E se emplea de forma
habitual para diagnosticar mediante microscopia la gran mayora de las piezas quirrgicas. Sin embargo, en algunas circunstancias especiales, cuando el patlogo desea demostrar sustancias o componentes especficos de las clulas para confirmar
constituyentes etiolgicos, histognicos o patognicos, se pueden
emplear tinciones especiales tambin denominadas tinciones
histoqumicas. La tincin depende de las caractersticas fsicas
o qumicas, o de la solubilidad diferencial entre la tincin y los tejidos. Los principios de algunos de los procedimientos de tincin
se conocen de forma amplia, pero otros an son desconocidos.
Algunas de las sustancias para las cuales hay tinciones especiales que se emplean con frecuencia en el laboratorio de patologa quirrgica son el amiloide, los hidratos de carbono, los
lpidos, las protenas, los cidos nucleicos, el tejido conectivo,
los microorganismos, los tejidos nerviosos, los pigmentos y los
minerales; estas tinciones se enumeran en el Cuadro 2.1.

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

Tcnicas para el estudio de la patologa

EL INFORME ANATOMOPATOLGICO. La ltima tarea, y

la ms importante del laboratorio de patologa, es la elaboracin de un informe rpido, preciso, breve y con relevancia pronstica. El informe ideal debe contar con cinco elementos:
i) Datos del paciente (disponibles para el patlogo, como el
nombre del paciente).
ii) Descripcin macroscpica precisa.
iii) Hallazgos microscpicos.
iv) Diagnstico morfolgico, que debe incluir el rgano con fines de clasificacin con los cdigos de SNOMED (Scientific Nomenclature in Medicine, Nomenclatura cientfica en medicina).
v) Otros comentarios en algunos casos.

11

CAPTULO 2

Los cortes incluidos en parafina se tien de forma sistemtica con hematoxilina y eosina (H & E). El material sometido a
corte por congelacin se puede teir con H & E rpida o con
azul de toluidina de manera habitual. Se pueden emplear tinciones especiales con cualquiera de los dos mtodos de acuerdo
con la necesidad. Los cortes se colocan en un portaobjetos y se
envan al laboratorio para su estudio microscpico.

12

CUADRO 2.1: Tinciones especiales (histoqumicas) usadas con mayor frecuencia en patologa quirrgica (en orden alfabtico de los componentes)
Tincin

SECCIN I
Patologa general y tcnicas bsicas

Componente/tejido

Colorantes

Interpretacin

1. Rojo Congo con luz

polarizada

Amiloide

Rojo Congo

Birrefringencia verde: amiloide

2. Azul de toluidina

Amiloide

Azul de toluidina

Azul ortocromtico: amiloide

3. cido peridico de Schiff

(PAS)

Hidratos de carbono (en

particular, glucgeno), todas las
mucinas

cido peridico, reactivo de Schiff

(fucsina bsica)

Glucgeno y otros hidratos de

carbono: magenta
Ncleos: azul

4. Mucicarmn/Carmn de Best

Mucina cida

Carmn

Mucina: rojo
Ncleos: azul

5. Azul alcin

Mucina cida

Azul alcin (a pH 2,5)

Mucina cida: azul

Ncleos: rojo

6. Azul alcin-PAS combinados

Mucina neutra

Azul alcin

Mucina cida: azul

Mucina neutra: magenta
Ncleos: azul plido

7. de Van Gieson

Colgeno extracelular

cido pcrico, fucsina cida,

celeste azul hemalum

Ncleos: azul/negro
Colgeno: rojo
Otros tejidos: amarillo

8. Tricrmico de Masson

Colgeno extracelular

Fucsina cida, cido

fosfomolibdnico, metil azul,
celeste azul hemalum

Ncleos: azul/negro
Citoplasma: msculo,
clulas rojas: rojo
Colgeno: azul

9. cido fosfotngsticohematoxilina (PTAH)

Msculo y filamentos gliales

Hematoxilina, cido fosfotngstico,

permanganato, cido oxlico

Estras musculares, fibras

neurogliales, fibrina: azul oscuro
Ncleos: azul
Citoplasma: rosa plido

10. Elstico de Verhoeff

Fibras elsticas

Hematoxilina, cloruro frrico,

yodo, yoduro de potasio

Fibras elsticas: negro

Otros tejidos: contratincin

11. de Gordon y de Sweet

Fibras reticulares

Nitrato de plata

Fibras reticulares: negro

Ncleos: negro o contratincin

12. Aceite rojo O

Lpidos (cristato sin fijar)

Aceite rojo O

Aceites minerales: rojo

Lpidos no saturados, fosfolpidos: rosa

13. Sudn negro B

Lpidos (cristato sin fijar)

Sudn negro B

Lpidos no saturados: azul negro

14. Tetrxido de osmio

Lpidos (cristato sin fijar)

Tetrxido de osmio

Lpidos no saturados: marrn negro

Lpidos saturados: no teidos

15. de Gram

Bacterias (cocos, bacilos)

Cristal violeta, yodo Lugol,

rojo neutro

Grampositivas: queratina, fibrina: azul

Gramnegativas: rojo

16. de Ziehl-Neelsen

Bacilos tuberculosos

Carbol fucsina, azul de metileno

(diferencia en cido-alcohol)

Bacilos tuberculosos,
eje piloso, actinomices: rojo
Fondo: azul plido

17. Fite-Wade

Bacilos de la lepra

Carbol fucsina, azul de metileno

(decolorar en cido sulfrico
al 10%)

Bacilos de la lepra: rojo

Fondo: azul

18. Metenamina de plata

de Grocott

Hongos

Tetraborato de sodio, nitrato de

plata, metenamina

Hongos, Pneumocystis: negro

Clulas rojas: amarillo
Fondo: verde plido

19. Giemsa

Parsitos

Polvo de Giemsa

Protozoos: azul oscuro

Ncleos: azul

20. Orcena de Shikata

Antgenos de superficie de la
hepatitis B (HBsAg)

Permanganato cido, orcena,

tetrazina

HBsAg positivo: marrn a negro

Fondo: amarillo

A. AMILOIDE

B. HIDRATOS DE CARBONO

C. TEJIDOS CONECTIVOS

D. LPIDOS

E. MICROORGANISMOS

Contina

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana


CUADRO 2.1: (Continuacin )

Tinciones especiales (histoqumicas) usadas con mayor frecuencia en patologa quirrgica (en orden alfabtico de
los componentes)

Tincin

Componente/tejido

Colorantes

Interpretacin

Azul rpido de Luxol

Mielina

Azul rpido de Luxol, violeta de

cresilo

Mielina: azul/verde
Clulas: violeta/rosa

22.

Plata de Bielschowsky

Axones

Nitrato de plata

Axones y neurofibrillas: negro

G. PIGMENTOS Y MINERALES

Azul de Prusia de Perl

Hemosiderina, hierro

Ferrocianuro de potasio

Hierro frrico: azul

Ncleos: rojo

24.

Masson-Fontana

Melanina, clulas argentafines

Nitrato de plata

Melanina, argentafn, cromafn,

lipofucsina: negro
Ncleos: rojo

25.

Rojo alizarin S

Calcio

Rojo alizarin S

Depsitos de calcio: rojo naranja

26.

von Kossa

Hueso mineralizado

Nitrato de plata, safranina O

Hueso mineralizado: negro

Osteoide: rojo

27.

cido rubenico

Cobre

cido rubenico

Cobre: negro verdoso

Ncleos: rojo plido

28.

Extraccin de pigmento

Eliminacin del pigmento

formalina y del pigmento de la
malaria

cido pcrico alcohlico

Pigmento formalina/pigmento de
malaria: eliminados

29.

de Grimelius

Clulas argirfilas

Nitrato de plata

Grnulos argirfilos: marrn-negro

Metabisulfito de potasio

DNA: rojo prpura

Citoplasma: verde

Verde de metilo, pironina Y

DNA: verde-azul
RNA: rojo

H. PROTENAS Y CIDOS NUCLEICOS

30.

Reaccin de Feulgen

DNA

31.

Metil verde pironina

DNA, RNA

HISTOQUMICA PARA LAS ENZIMAS

Las tcnicas histoqumicas para las enzimas requieren tejido no fijado para poder cortarlo con el cristato, y no se pueden aplicar en piezas fijadas en parafina o en formalina dado
que las enzimas se daan con rapidez. En la actualidad, la histoqumica para las enzimas tiene una utilidad diagnstica limitada y no es tan popular; en parte, debido al requerimiento de
tejidos frescos y a la tcnica compleja y en parte, a causa de la
escasez relativa de especificidad de la reaccin en muchos casos. Esto determin que las tcnicas histoqumicas se reemplacen en la mayora de los casos por procedimientos inmunohistoqumicos y tcnicas de patologa molecular.
En este momento algunas de las aplicaciones ms frecuentes de la histoqumica para las enzimas en patologa diagnstica son para la identificacin de enzimas relacionadas con el
msculo (ATPasas) en las miopatas; acetilcolinesterasa, para el
diagnstico de la enfermedad de Hirschsprung; cloroacetato esterasa, para detectar clulas mieloides y mastocitos; reaccin
DOPA, para la actividad de la tirosinasa en los melanocitos;
deshidrogenasa endgena (que requiere nitroazul de tetrazolio
o NBT), para establecer la viabilidad del msculo cardaco, y las
fosfatasas cida y alcalina.

MICROSCOPIA PTICA. El tipo de microscopia usado con

mayor frecuencia en los laboratorios clnicos se denomina microscopio ptico. En general, hay dos tipos de microscopios pticos:
Microscopio simple. Es una lupa que tiene una potencia magnificadora de entre 2 y 200.
Microscopio compuesto. Posee una batera de lentes dispuestos en un instrumento complejo. Un tipo de lente permanece
cerca del objeto (objetivo) y otro tipo se ubica cerca del ojo del
observador (ocular). El ocular y el objetivo tienen distintas
magnificaciones. El microscopio compuesto puede ser monocular, con un solo ocular, o binocular, con dos oculares (Fig. 2.5).
Los microscopios multicabezales se usan en el mbito de la enseanza y con fines demostrativos.
VARIEDADES DE MICROSCOPIOS PTICOS. Adems de
los microscopios pticos, a continuacin se describen otras modificaciones especiales para el laboratorio clnico:

MICROSCOPIA BSICA

Iluminacin de campo oscuro. Este mtodo se usa para el examen de microorganismos vivos no teidos, como por ejemplo
Treponema pallidum. Los microorganismos se iluminan con un
haz de luz oblicuo que no atraviesa el microorganismo. El condensador se oscurece en el centro y la luz pasa a travs de su
periferia para iluminar el microorganismo vivo sobre un portaobjetos.

El microscopio es la herramienta bsica para el patlogo, de

la misma manera que el estetoscopio lo es para el mdico clnico y el espculo para el gineclogo. Este instrumento permite
agrandar las imgenes de objetos diminutos.

Microscopia de luz polarizada. Este mtodo se usa para mostrar birrefringencia, p. ej., del amiloide, cuerpos extraos, pelos,
etctera. Se emite una luz polarizada plana. Tras atravesar un
disco, los haces de luz vibran en un solo plano en ngulo recto

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

Tcnicas para el estudio de la patologa

23.

CAPTULO 2

F. TEJIDOS NERVIOSOS
21.

13

14

SECCIN I

Filtros. Hay varios filtros que se usan entre la fuente de luz y el

objetivo: en primer lugar, el filtro que absorbe el calor; en segundo
lugar, el filtro que detiene la luz roja y en tercer lugar, el filtro excitador que slo permite el pasaje de la luz de la longitud de
onda deseada. Al atravesar la pieza, se rene tanto la luz excitadora como la que emite fluorescencia. La luz excitadora se elimina debido al pasaje por otro filtro llamado filtro barrera, ubicado entre el objetivo y el observador, que protege el ojo del
observador para que slo la luz fluorescente lo alcance.
Condensador. El condensador de campo oscuro se usa en el microscopio de fluorescencia para que la luz directa no caiga en el
objeto y, en cambio, se cree un fondo de contraste oscuro para
la fluorescencia.

Patologa general y tcnicas bsicas

TCNICAS. Hay dos tipos de tcnicas de fluorescencia, ambas

realizadas en cristatos sobre tejido no fijado, que se denominan directa e indirecta.
En la tcnica directa presentada por Coons (1941), quien realiz el estudio original sobre inmunofluorescencia, se dirige
un anticuerpo conjugado con un fluorocromo contra un antgeno, y luego, el tejido se examina bajo microscopia ptica.

Figura 2.5
Microscopio ptico binocular (Modelo E 400, Nikon, Japn). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt. Ltd., Nueva Delhi.

entre s. Se colocan dos discos o prismas en la trayectoria de la

luz: uno debajo del objeto denominado polarizador y otro en el
tubo denominado analizador. El disco inferior se rota para que
la luz quede polarizada en un plano.

INMUNOFLUORESCENCIA
La tcnica de inmunofluorescencia se emplea para localizar
molculas antignicas sobre las clulas en el examen microscpico. Este mtodo se lleva a cabo mediante anticuerpos especficos que actan contra la molcula antignica para formar el
complejo antgeno-anticuerpo en el sitio antignico especfico,
que se visualiza gracias al empleo de un fluorocromo, el cual
tiene la propiedad de absorber la radiacin en forma de luz ultravioleta, de manera que quede dentro del espectro de la luz
visible en el examen microscpico.
El mtodo de inmunofluorescencia posee los siguientes
componentes esenciales:
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. Se basa en el principio de que la radiacin que emite la luz ultravioleta de menor
longitud de onda 360 nm o la luz azul longitud de onda 400
nm causa fluorescencia en ciertas sustancias y luego vuelve a
emitir la luz con mayor longitud de onda.
Algunas sustancias tienen fluorescencia natural, que se denomina fluorescencia primaria o autofluorescencia; aunque se requiere luz ultravioleta para observarlas mejor, como por ejemplo la vitamina A, la porfirina y la clorofila.
La fluorescencia secundaria se emplea con mayor frecuencia
y es la produccin de fluorescencia a travs del agregado de colorantes o compuestos qumicos denominados fluorocromos.
Fuente de luz. El vapor de mercurio y las lmparas de gas xenn se usan como fuente de luz para la microscopia de fluorescencia.

En la tcnica indirecta, tambin denominada tcnica sndwich, se genera una interaccin entre un antgeno tisular y un
anticuerpo especfico, seguida por el lavado y luego por el agregado de un fluorocromo para completar la reaccin. La tcnica
de inmunofluorescencia indirecta se aplica para detectar autoanticuerpos en el suero del paciente.
APLICACIONES. Los mtodos de inmunofluorescencia se
aplican para realizar las siguientes tareas:
1. para la deteccin de autoanticuerpos en el suero, como los anticuerpos contra el msculo liso (SMA, por su sigla en ingls),
anticuerpos antinucleares (ANA, por su sigla en ingls), anticuerpos antimitocondriales (AMA, por su sigla en ingls), anticuerpo microsmico tiroideo, etctera;
2. en las enfermedades renales, para detectar depsitos de inmunoglobulinas, complemento y fibrina en varios tipos de enfermedades glomerulares mediante el corte por congelacin, como
se describir en el Captulo 22;
3. en enfermedades de la piel, para detectar depsitos de inmunoglobulina mediante el corte por congelacin; en particular, en
la unin dermoepidrmica y en la porcin superior de la dermis, por ejemplo en la dermatosis ampollar (Captulo 26);
4. para el estudio de los marcadores de superficie de la clula mononuclear con anticuerpos monoclonales;
5. y para el diagnstico especfico de enfermedades infecciosas,
p. ej., en la hepatitis viral.

MICROSCOPIA ELECTRNICA
La microscopia electrnica, desarrollada en la dcada de
1930 en Alemania, experiment modificaciones debido al agregado de nuevos conocimientos para la comprensin de la estructura y la funcin de las clulas normales y enfermas en el
nivel de los orgnulos celulares. Sin embargo, en etapas ms recientes, la difusin de la inmunohistoqumica diagnstica en la
patologa quirrgica limit la aplicacin de la microscopia electrnica a las siguientes reas de la patologa diagnstica:
1. en las enfermedades renales, junto con la microscopia ptica y la inmunofluorescencia (Captulo 22);
2. en la ultraestructura de los tumores de histognesis incierta;

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

3. para el estudio subcelular de los macrfagos en enfermedades por depsito de sustancias;

4. y con fines de experimentacin.

Hay dos tipos principales de microscopia electrnica:

1. Microscopia electrnica de transmisin. Es la herramienta
de eleccin para el estudio de la ultraestructura de la clula y
sus orgnulos. Este estudio consiste en el pasaje de un haz de
electrones a travs de una seccin ultradelgada de tejido. La
magnificacin obtenida oscila entre 2.000 y 10.000 veces.

Generalidades de la inmunohistoqumica
La inmunohistoqumica surgi de los mtodos de inmunofluorescencia, en los cuales los anticuerpos marcados con compuestos fluorescentes podan localizar un antgeno especfico
en el corte con cristato.

Aspectos tcnicos

La necesidad de microscopia de fluorescencia se evit gracias al desarrollo subsiguiente de la tcnica de marcado enzimtico
con peroxidasa de rbano con algn sistema colorignico, en lugar
de un fluorocromo; de manera que el corte por congelacin con
un anticuerpo marcado se puede observar con microscopia ptica. Los cromgenos empleados con mayor frecuencia en la reaccin inmunohistoqumica son el tetracloruro de diaminobencidina (DAB, por su sigla en ingls) y el aminoetil carbazol (AEC,
por su sigla en ingls), ambos para producir un producto final
estable de color marrn oscuro.

A continuacin se mencionan algunas de las consideraciones

tcnicas principales relacionadas con la microscopia electrnica:
1. Fijacin. Siempre que se planee evaluar un tejido con microscopia electrnica, se debe fijar una lmina delgada y pequea de
tejido de no ms de 1 mm de espesor en glutaraldehdo amortiguado al 2% o al 4% o en una mezcla de formalina y glutaraldehdo. Despus de la fijacin, el tejido se fija en una solucin amortiguada de tetrxido de osmio para aumentar el contraste.
2. Inclusin. El tejido se incluye en resina, en una grilla.
3. Cortes semidelgados. En primer lugar, se realizan cortes semidelgados de un espesor de 1 m y se tien con azul de metileno o azul de toluidina. A veces, tambin se pueden cortar
bloques de parafina para su estudio con microscopia electrnica; pero, en general, no son bastante satisfactorios debido a la
existencia de numerosos artefactos. Los cortes semidelgados
guan el diagnstico diferencial y la seleccin del rea que se
debe analizar en los cortes ultradelgados.
4. Cortes ultradelgados. Para el examen ultraestructural, los
cortes ultradelgados se realizan con un bistur de diamante.
Con el fin de aumentar la densidad electrnica, los cortes delgados se pueden teir a travs de la inmersin de la grilla en
una solucin de citrato de plomo y de acetato de urinilo.

INMUNOHISTOQUMICA
La inmunohistoqumica es la aplicacin de tcnicas inmunolgicas a la patologa celular. La tcnica se emplea para detectar el estado y la localizacin de un antgeno especfico en las
clulas (membrana, citoplasma o ncleo) mediante el empleo
de anticuerpos especficos, que luego se observan con un cromgeno de color marrn. De esta manera, se contribuye a la determinacin del linaje celular especfico o se puede confirmar
una infeccin. La inmunohistoqumica revolucion la patologa
diagnstica conocida como la revolucin marrn y, en muchos laboratorios sofisticados, esta tcnica reemplaz a la histoqumica como procedimiento auxiliar. Adems de los principios subyacentes a la inmunohistoqumica y a la histoqumica,
estas dos tcnicas se diferencian en el resultado final: la histoqumica produce diversos colores para los distintos componentes teidos de acuerdo con la sustancia teida, mientras que la
inmunohistoqumica produce solamente en el sitio apropiado
de la clula su caracterstico color marrn como resultado final.
En la ltima dcada, se realizaron avances significativos en
las tcnicas inmunohistoqumicas. En la actualidad, es posible

Luego, se desarroll la tcnica de inmunoperoxidasa, que emplea el mtodo del anticuerpo marcado en cortes de parafina fijados
con formalina y que, en la actualidad, se emplea con frecuencia.
En la actualidad, los dos procedimientos empleados con
mayor frecuencia en la inmunohistoqumica son los siguientes.
i) Mtodo de peroxidasa-antiperoxidasa (PAP, por su sigla en ingls), que consiste en la generacin del reactivo PAP en inmunocomplejos estables para su reaccin con el anticuerpo primario mediante un anticuerpo intermedio.
ii) Tcnica inmunoenzimtica con el conjugado avidina-biotina
(ABC, por su sigla en ingls), que consiste en el empleo de un
anticuerpo secundario biotinilado para combinar el anticuerpo
primario con un complejo grande preformado de avidina, biotina y peroxidasa.
La seleccin del anticuerpo o los anticuerpos para la realizacin de tinciones inmunohistoqumicas se realiza tras el diagnstico diferencial en cortes con H & E. En general, se prefiere
un panel de anticuerpos sobre una sola prueba para evitar errores.
Los anticuerpos utilizados en inmunohistoqumica se producen con tcnicas monoclonales (hibridoma) y policlonales. La
primera se emplea, sobre todo, para producir anticuerpos con
afinidad elevada por un antgeno. En la actualidad, se dispone
de un gran nmero de anticuerpos contra los antgenos celulares para su empleo en la inmunohistoqumica, y el listado
tiende a aumentar de forma continua.
Las tinciones inmunohistoqumicas siempre se deben asociar con los controles positivos apropiados; es decir, es un tejido
que expresa un antgeno especfico y que acta como control, el
cual puede ser un control interno o de otro tejido. La tcnica del
bloque tisular en salchicha, que se considera muy econmica,
combina la tincin de mltiples tejidos en un solo portaobjetos
con un nico procedimiento de control.
Para la interpretacin de los resultados de las tinciones inmunohistoqumicas, es importante recordar que diferentes antgenos se localizan en distintos sitios de la clula (membrana, citoplasma,

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

Tcnicas para el estudio de la patologa

2. Microscopia electrnica de barrido. Evala la estructura

de la superficie celular y produce una imagen tridimensional.
Por ejemplo, para observar los podocitos en el glomrulo renal.

15

CAPTULO 2

TIPOS DE MICROSCOPIA ELECTRNICA

emplear de forma habitual bloques de tejido procesados incluidos en parafina para realizar la inmunohistoqumica, lo que influye de forma significativa sobre el desarrollo de la patologa
quirrgica diagnstica. En el pasado, la patologa quirrgica
diagnstica se sola considerar una ciencia subjetiva con variaciones entre los observadores en particular, en lesiones fronterizas y en lesiones de origen indeterminado pero, el uso de la
inmunohistoqumica agreg objetividad, especificidad y reproducibilidad al diagnstico patolgico quirrgico.

16

SECCIN I

ncleo) y, en consecuencia, la tincin positiva se observa y se interpreta en esos sitios, como por ejemplo, tincin membranosa
para el antgeno comn leucocitario, tincin nuclear para los receptores de estrgeno y progesterona (RE-RP), tincin citoplasmtica para la actina del msculo liso, entre otras.
Las tinciones inmunohistoqumicas no se pueden aplicar para
distinguir las lesiones neoplsicas de las no neoplsicas o los tumores benignos de los malignos. Estas distinciones se deben llevar
a cabo mediante mtodos tradicionales de patologa quirrgica.

Aplicaciones principales de la inmunohistoqumica

Patologa general y tcnicas bsicas

En la actualidad, las tinciones inmunohistoqumicas se emplean para los siguientes objetivos, que se enumeran en el orden de utilidad diagnstica:
1. Tumores de histognesis incierta. La inmunohistoqumica
gener una revolucin en el diagnstico de los tumores de origen
incierto, tanto primarios como metastsicos de un tumor primario
desconocido. Se elige un conjunto de anticuerpos para resolver estos problemas con el diagnstico; la seleccin de los anticuerpos
se basa en la historia clnica, las caractersticas morfolgicas y los
resultados de otras investigaciones importantes. Son de gran utilidad los colorantes de inmunohistoqumica para teir los filamentos intermedios expresados por las clulas tumorales (queratina, vimentina, desmina, neurofilamentos y protenas cidas
fibrilares gliales), adems de los enumerados en el Cuadro 2.2.
2. Marcadores de pronstico para el cncer. La segunda aplicacin de la inmunohistoqumica en importancia es la prediccin del pronstico de los tumores a travs de la identificacin
de las micrometstasis, las metstasis ocultas y con ciertas caractersticas adquiridas, de productos elaborados o genes expresados en exceso por las clulas malignas para establecer el

CUADRO 2.2: Tinciones inmunohistoqumicas usadas con mayor

frecuencia para los tumores de origen incierto.

Tumor

comportamiento biolgico del tumor. A modo de ejemplo, se

pueden mencionar los protooncogenes, como la expresin excesiva de HER-2/neu (carcinoma de mama), genes supresores
tumorales o antioncogenes (p. ej., gen Rb, p53), receptores de
factores de crecimiento (p. ej., receptor de factor de crecimiento
epidrmico o EGFR) y marcadores de la proliferacin de las clulas tumorales (p. ej., ki67, antgeno de proliferacin nuclear
celular PCNA). El anlisis de los tumores mediante estos mtodos representa un avance significativo en el manejo con respecto a los mtodos convencionales para definir el pronstico
basados en la estadificacin clnica y el grado histolgico.
3. Prediccin de la respuesta al tratamiento. La inmunohistoqumica se emplea de forma amplia para predecir la respuesta
teraputica en dos tumores importantes: carcinoma de mama y
de prstata. El crecimiento de ambos tumores est regulado por
hormonas: estrgenos y andrgenos, respectivamente. Los receptores especficos para estas hormonas que regulan el crecimiento se localizan sobre las clulas tumorales respectivas. Los
tumores con alta positividad del receptor responden de manera
favorable a la eliminacin de la fuente endgena de estas hormonas ooforectoma en el cncer de mama positivo para estrgeno y orquiectoma en el carcinoma de prstata positivo
para los andrgenos. Tambin se administra tratamiento hormonal para reducir sus niveles: estrogenoterapia, para el cncer
de prstata, y androgenoterapia, para el cncer de mama. Los
resultados de los receptores de estrgenos y de progesterona en
el cncer de mama presentan una correlacin pronstica significativa, aunque la utilidad pronstica de los niveles de receptores de andrgenos en el cncer de prstata es limitada.
4. Infecciones. Las tinciones inmunohistoqumicas se aplican
en la actualidad para confirmar agentes infecciosos en los tejidos mediante el uso de anticuerpos especficos contra el DNA o
el RNA microbiano, como la deteccin de virus HBV, CMV,
HPV, herpesvirus, bacterias p. ej., Helicobacter pylori y parsitos Pneumocystis carinii, etctera.

Inmunotincin

1. Tumores epiteliales
(carcinomas)

i) Panqueratina (fracciones: queratinas de

alto y bajo peso molecular, HMW-K,
LMW-K)
ii) Antgeno de la membrana epitelial (EMA)
iii) Antgeno carcinoembrionario (CEA)
iv) Enolasa neuronoespecfica (NSE)

2. Tumores
mesenquimticos
(sarcomas)

i) Vimentina (mesnquima en general)

ii) Desmina (miognico en generales)
iii) Actina muscular especfica (miognico
en generales)
iv) Mioglobina (miognicos esquelticos)
v) 1-anti-quimiotripsina (para el
histiocitoma fibroso maligno)
vi) Factor VIII (para los tumores vasculares)
vii) CD34 (marcador endotelial

3. Grupos especiales
a) Melanoma

i) HMB-45 (ms especfico)

ii) Vimentina
iii) S-100
i)
ii)
iii)
iv)

b) Linfoma

c) Tumores
neurales y
neuroendocrinos

i)
ii)
iii)
iv)

Antgeno comn leucocitario (LCA/CD45)

Pan-B (inmunoglobulinas, CD20)
Pan-T (CD3)
CD15, CD30 (marcador de las clulas
RS para la enfermedad de Hodgkin)

Neurofilamentos (NF)
NSE
GFAP (para los tumores gliales)
Cromogranina (para los
neuroendocrinos)
v) Sinaptofisina

CITOGENTICA
En el Captulo 10 se describirn los aspectos aplicados de la
citogentica. En este captulo el comentario se centrar en breves consideraciones tcnicas.
Las clulas somticas humanas son diploides y contienen 46
cromosomas: 22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales (XX en las mujeres y XY en los varones). Los gametos (espermatozoides y vulos) contienen 23 cromosomas y se denominan clulas haploides. Todos los vulos contienen 23 cromosomas
(el sexual es X), mientras que los espermatozoides contienen 23
cromosomas (el sexual puede ser X o Y). En consecuencia, el sexo
de la descendencia depende de la contribucin cromosmica paterna, lo que implica que el vulo fertilizado por un espermatozoide con un cromosoma X da como resultado un cigoto femenino, mientras que el vulo fertilizado por un espermatozoide
con un cromosoma Y produce un cigoto masculino.

Cariotipo
El cariotipo se define como la secuencia de cromosomas alineados de acuerdo con su tamao, la localizacin del centrmero y el patrn de bandas. En el Captulo 3, se describir la estructura de los cromosomas.
La determinacin del cariotipo de un individuo es una herramienta importante para el anlisis citogentico. A continuacin, se mencionan las caractersticas principales del cariotipo:

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

3. Tincin/bandeo. Cuando se tien, los cromosomas forman

bandas oscuras y claras alternadas. Para lograr este efecto, el
preparado fijado en metafase se tie con una de las siguientes
tcnicas de bandeo:
a) Bandeo con Giemsa o bandeo G, es empleado con mayor frecuencia.
b) Bandeo con quinacrina o bandeo Q, empleado para mostrar las
bandas a lo largo de los cromosomas.
c) Bandeo constitutivo o bandeo C, se usa para mostrar la heterocromatina constitutiva.
d) Bandeo por tincin de Giemsa inversa (o bandeo R), produce un
patrn opuesto al obtenido con el bandeo G.
4. Anlisis microscpico. Luego, los cromosomas se fotografan a travs del examen microscpico del preparado. En la fotografa, los cromosomas se cortan y se organizan de acuerdo
con su tamao, su localizacin centromrica y sus patrones de
bandeo. Los pares de cromosomas se identifican de acuerdo
con la longitud del brazo de los cromosomas. El centrmero divide los cromosomas en un brazo superior corto denominado
brazo p (la p, por petit, pequeo) y un brazo inferior largo denominado brazo q (la letra q es la que sigue a la p).
En la actualidad, se puede llevar a cabo el anlisis citogentico molecular y la caracterizacin de los cromosomas a travs
de la tcnica revolucionaria de hibridacin in situ con fluorescencia multicolor (FISH, por su sigla en ingls) (vase ms adelante en la seccin de Patologa molecular).

Aplicaciones
El campo de la citogentica posee amplias aplicaciones en
patologa diagnstica (Captulo 10). En resumen, el cariotipo se
emplea para los siguientes fines:
i) Anomalas cromosmicas numricas, p. ej., sndrome de Down
(trisoma del autosoma 21), sndrome de Klinefelter (trisoma 46),
sndrome de Turner (monosoma 45, XO), abortos espontneos.
ii) Anomalas cromosmicas estructurales, como traslocaciones
(p. ej., cromosoma Philadelphia t(9;22), sndrome de cri-duchat, 5p, abortos espontneos recurrentes), deleciones, inserciones, isocromosoma y formacin de cromosoma anular.
iii) El cncer se caracteriza por mltiples anomalas cromosmicas complejas, como deleciones, amplificaciones, inversiones, traslocaciones, en especial en leucemias y linfomas, tumores de clulas germinales y algunos sarcomas.

Durante el ltimo cuarto del siglo XX, se realizaron grandes

avances en el campo de la biologa molecular. Como consecuencia, las tcnicas moleculares, que en el pasado slo se empleaban con fines experimentales, ahora estn disponibles para
el diagnstico. Estas tcnicas sirven para detectar anomalas en
el DNA o el RNA celular.
Por lo general, todas las tcnicas moleculares basadas en el
DNA o el RNA emplean la hibridacin basada en la tecnologa recombinante. Una regin especfica de DNA o RNA se detecta mediante su marcado con una sonda (la sonda es una cadena de nucletidos formada por un nmero conocido de pares de bases). Las
sondas poseen distintos tamaos y orgenes, y son las siguientes.
1. Las sondas genmicas provienen de una regin del DNA de
las clulas.
2. La sonda de cDNA se forma a partir de RNA mediante transcripcin inversa.
3. La sonda de oligonucletidos es una sonda sinttica contraria
al DNA genmico y a la sonda de cDNA, ambas derivadas
de material celular.
4. Las ribosondas se preparan mediante un sistema de transcripcin in vitro.
MTODOS MOLECULARES
A continuacin, se presenta una descripcin breve de las
tcnicas moleculares disponibles como herramienta de diagnstico en la patologa quirrgica:
1. HIBRIDACIN IN SITU. La hibridacin in situ es una tcnica de hibridacin molecular que permite la localizacin de una
secuencia de cido nucleico en forma directa en la clula intacta (o
sea, in situ) sin la extraccin del DNA, a diferencia de otras tcnicas basadas en hibridacin, que se describirn ms adelante. Esta
tcnica consiste en la hibridacin especfica de una sola cadena de
una sonda marcada de cido nucleico con una sola cadena de un
DNA o un RNA complementario de un tejido que se desea detectar. El producto final de la hibridacin se identifica con una sonda
radiactiva (32P, 125I) o no radiactiva (biotina, digoxigenina).
Aplicaciones. La hibridacin in situ se usa en las siguientes
aplicaciones:
i) en infecciones virales (p. ej., HPV, EBV, HIV, CMV. HCV, etc.),
ii) en tumores humanos para la deteccin de la expresin de genes y oncogenes.
iii) en trastornos cromosmicos, en particular, mediante el uso de
hibridacin in situ por fluorescencia (FISH).
2. HIBRIDACIN CON FILTRO. Este mtodo consiste en la
extraccin del DNA o del RNA evaluado del tejido, que puede
ser fresco, congelado no fijado, o fijado en formalina e incluido
en parafina. El DNA o el RNA extrado se inmoviliza en un filtro de nitrocelulosa o nailon. A continuacin, se hibrida el DNA
buscado con la sonda marcada. El anlisis del DNA con hibridacin por filtro se realiza a travs de los siguientes mtodos:
i) Ensayos de transferencia por manchas (dot) y por ranuras (slot),
en los cuales la muestra de DNA se une de forma directa con el
filtro sin reduccin del tamao del cido nucleico.
ii) Southern blot (electroinmunotransferencia o inmunotransferencia); es similar a la anterior, pero difiere en el fraccionamiento
previo del DNA mediante electroforesis en gel (se denomina
Southern blot, debido al cientfico E. M. Southern, que describi
esta tcnica por primera vez).

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

17

Tcnicas para el estudio de la patologa

2. Cultivo celular. La muestra obtenida de esta manera se cultiva en un medio mitgeno. Un mitgeno es una sustancia que
induce la mitosis en las clulas, como PPD, fitohemaglutinina
(PHA, por su sigla en ingls), el mitgeno de la hierba carmn
(PWM), ster forbol, etc. Luego, las clulas que se dividen, se
detienen en metafase por el agregado de colchicina o colcemida: ambos son inhibidores de la formacin de los microtbulos. A continuacin, las clulas se destruyen por el agregado de
una solucin hipotnica.
Luego, las clulas en metafase se fijan en una mezcla de metanol y cido actico glacial.

PATOLOGA DIAGNSTICA MOLECULAR

CAPTULO 2

1. Seleccin de la clula. Las clulas capaces de crecer y dividirse son las seleccionadas para el anlisis citogentico, como
las clulas del lquido amnitico, las de una biopsia de vellosidades corinicas, los linfocitos de la sangre perifrica, las clulas de la mdula sea, de ganglios linfticos, tumores slidos,
etctera.

18

SECCIN I
Patologa general y tcnicas bsicas

iii) Northern blot; es similar a la anterior, pero con fraccionamiento del RNA. (En este caso se la ha llamado Northern como
opuesta a la anterior, no corresponde a un apellido)
iv) Western blot (electroinmunotransferencia de protenas); es anloga a los dos mtodos anteriores, pero para el fraccionamiento
de protenas; en este mtodo, se usan anticuerpos como sondas.
Aplicaciones. Debido al nivel elevado de especificidad y sensibilidad de las tcnicas de hibridacin molecular, estos mtodos
se aplican de forma amplia en la patologa diagnstica.
i) En las neoplasias, tanto en las hematolgicas como en las no
hematolgicas.
ii) En las enfermedades infecciosas, para el diagnstico del agente
causal, en estudios epidemiolgicos y para la identificacin de
nuevos agentes infecciosos.
iii) En las enfermedades genticas hereditarias, para detectar a portadores de mutaciones, para el diagnstico prenatal y para el
diagnstico directo de las enfermedades genticas.
iii) En la determinacin de la identidad, para el trasplante de tejidos, en patologa forense y para la evaluacin del parentesco.
3. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla en ingls)
es una tcnica revolucionaria para la evaluacin gentica molecular con aplicaciones amplias en el diagnstico y la investigacin. La tcnica se fundamenta en el principio de que una cadena de DNA posee una capacidad ilimitada para duplicarse a
s misma y as formar millones de copias. En la PCR, una sola
cadena de DNA genera otra por la accin de la DNA polimerasa
con un fragmento corto de DNA complementario y con el uso
de un cebador, que acta como molde para iniciar la reaccin.
Un ciclo de la PCR consta de tres pasos:
i) Desnaturalizacin del DNA con calor (a 94 C durante 60 a 90
segundos).
ii) Hibridacin de los cebadores con sus secuencias complementarias (a 55 C durante entre 30 y 120 segundos).
iii) Extensin de los cebadores hibridados con DNA polimerasa
(a 72 C durante entre 60 y 180 segundos).
Los ciclos se pueden realizar en un ciclador trmico automtico, el cual produce una gran acumulacin de la secuencia
evaluada, dado que cada nuevo producto generado acta como
molde para el siguiente ciclo.
Aplicaciones. El anlisis por PCR posee las mismas aplicaciones que las tcnicas de hibridacin con filtro, pero con muchos
beneficios sobre ellas porque es ms rpido, se pueden automatizar con cicladores trmicos y requiere mucho menos DNA
inicial. Sin embargo, la PCR se puede contaminar; en consecuencia, se requiere precaucin extrema durante la implementacin de esta tcnica.

OTRAS HERRAMIENTAS MODERNAS

PARA LA PATOLOGA DIAGNSTICA
LA CITOMETRA DE FLUJO
La citometra de flujo es una herramienta moderna que se
usa para el estudio de las propiedades de las clulas suspendidas en una corriente en movimiento. Por ende, la citometra de
flujo supera el problema de la subjetividad asociada con el examen microscpico de las clulas y tejidos en la histopatologa y
en la citopatologa.
El citmetro de flujo posee una fuente con luz lser para emitir fluorescencia, un sistema de transporte celular en una sola

corriente, filtros monocromticos, lentes, espejos y un ordenador para el anlisis de los datos. El citmetro de flujo acta
como clasificador de clulas, ya que distribuye en forma fsica
las clulas presentes en la suspensin lquida, que fluyen en
una sola hilera. La citometra de flujo requiere suspensiones
unicelulares; y sus aplicaciones se limitan a la evaluacin de lquidos, como por ejemplo leucocitos, eritrocitos y sus precursores, lquidos corporales y, en ocasiones, tejidos slidos homogeneizados para crear suspensiones celulares.
Aplicaciones. El anlisis por citometra de flujo se emplea en
la prctica clnica para los siguientes casos.
1. Inmunofenotipo, a travs del anlisis antignico detallado de
varias neoplasias hematopoyticas, como por ejemplo leucemias agudas y crnicas, linfomas (Hodgkin y no Hodgkin) y
neoplasias de clulas plasmticas.
2. Medicin de los antgenos asociados con la proliferacin, como
por ejemplo Ki67, PCNA.
3. Medicin del contenido de cido nucleico, por ejemplo a travs
de la medicin del contenido de RNA en los reticulocitos, la
cuantificacin del contenido de DNA y el recuento de la ploida
del DNA en varios tipos de cnceres.
4. Diagnstico y pronstico de la inmunodeficiencia, como por
ejemplo en el sndrome de inmunodeficiencia humana o sida, a
travs del recuento de CD4 y de los linfocitos T. Los pacientes
con recuentos de CD4 y linfocitos T menores de 500/mL requieren tratamiento antiviral.
5. Para diagnosticar la causa del rechazo del aloinjerto en un trasplante renal, en caso de nefropata terminal a travs del recuento
de CD3 y linfocitos T. Los pacientes con recuentos de CD3 y linfocitos T menores de 100 a 200/mL tienen menor riesgo de experimentar un rechazo del injerto.
6. Diagnstico de autoanticuerpos en la prpura trombocitopnica
idioptica y en la neutropenia autoinmunitaria.
MTODOS PARA EL ANLISIS DE LA PROLIFERACIN
CELULAR
Adems de la citometra de flujo, el grado de proliferacin
de las clulas en los tumores se puede determinar a travs de
varios otros mtodos, que se mencionan a continuacin:
1. Recuento mittico. Es el mtodo ms antiguo, pero an se
utiliza para el diagnstico anatomopatolgico sistemtico. Se
cuenta el nmero de clulas en mitosis por campo de gran aumento, como por ejemplo para clasificar varios tipos de tumores del msculo liso.
2. Autorradiografa. Este mtodo consiste en el marcado in
vitro con timidina de las clulas en vas de proliferacin para
despus procesarlas para su inclusin en parafina. Las clulas
marcadas con timidina (que corresponden a la fase S) se cuentan cada 2.000 ncleos de clulas tumorales y se expresan mediante el ndice de marcacin con timidina. El mtodo se emplea como marcador pronstico en el carcinoma de mama.
3. Anlisis microespectrofotomtrico. El fragmento se tie
con la reaccin de Feulgen para revelar el contenido de DNA en
la clula y medir este contenido con un microespectrofotmetro. El mtodo es tedioso y su aplicacin es limitada.
4. Inmunohistoqumica. El antgeno nuclear especfico para
el crecimiento y la divisin celular se tie con inmunohistoqumica y luego se cuentan las clulas positivas con el microscopio
o con un analizador de imgenes. Los marcadores de la proliferacin, evaluados con este mtodo, son Ki-67, PCNA y ciclinas.

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

ORDENADORES EN EL LABORATORIO DE PATOLOGA

APLICACIONES. El analizador de imgenes se puede usar con

diversos objetivos, que se mencionan a continuacin.
1. Estudio morfomtrico de las clulas tumorales a travs de la medicin de las caractersticas estructurales, celulares y nucleares.
2. Medicin cuantitativa de la ploida del DNA nuclear.
3. Valuacin cuantitativa de la tincin inmunohistoqumica.

Un laboratorio de patologa debe comunicar gran cantidad de

informacin a los mdicos. El patlogo tambin debe poder acceder a los datos del paciente antes de informar los resultados de las
muestras recibidas. En consecuencia, resulta fundamental que el
laboratorio de patologa moderno posea un sistema informtico
que est conectado con el sistema informtico hospitalario.
Asimismo, el personal del laboratorio y los mdicos deben
conocer los sistemas utilizados.
El empleo de ordenadores en el laboratorio posee dos objetivos principales:
para registrar los resultados de los pacientes y
para informar los resultados de las pruebas en formato numrico, narrativo y grfico.
Aplicaciones. La aplicacin de ordenadores en el laboratorio de
patologa posee varias ventajas que se describen a continuacin.
1. El personal del laboratorio y del hospital tienen acceso a la
informacin del paciente, lo que ayuda a mejorar su atencin.
2. El tiempo entre la obtencin de la muestra y el informe de los resultados se abrevia.
3. Mejora la productividad del personal del laboratorio en todos
los niveles, y este personal se puede utilizar en otras tareas.
4. Codificacin y clasificacin de los resultados y los datos de las
distintas pruebas.
5. Con fines de experimentacin y de acreditacin, para obtener
becas para la investigacin, se requieren datos computarizados
de los resultados.
6. Almacenamiento y recuperacin de los datos del laboratorio para
ahorrar el tiempo y el espacio ocupado por los archivos.
SISTEMA DE RECONOCIMIENTO DE VOZ. En la actualidad, hay sistemas computarizados que pueden reconocer la voz
y transformar en texto las descripciones macroscpicas y
microscpicas verbales de los informes a travs de un dictfono,
sin que intervenga un secretario.
ANALIZADOR DE LA IMAGEN Y DE LA MORFOMETRA
La patologa es una disciplina muy visual; por lo tanto, el anlisis de las imgenes microscpicas representa el elemento principal para su estudio. Existe la necesidad y el deseo de impartir mayor objetividad a los informes de histopatologa, ya que stos
solan ser bastante subjetivos. En la actualidad, mediante los avances en las tcnicas de computacin, se lograron mediciones objetivas de las caractersticas microscpicas cuantitativas para permitir la reproducibilidad de las observaciones histopatolgicas.
El analizador de imgenes es un sistema que se utiliza para
definir las caractersticas estructurales, celulares y nucleares de
las clulas. En forma sucinta, el analizador de imgenes consiste en las siguientes partes:
1. microscopio ptico convencional con una cmara de vdeo
montada sobre l.

LAS MICROMATRICES DEL DNA

La micromatriz del DNA es la aplicacin ms nueva de la
tecnologa con chips de siliconas para el anlisis simultneo de
grandes volmenes de datos de genes humanos, como por
ejemplo para la deteccin y la cuantificacin de mutaciones
puntuales y pleomorfismos de un nucletido nico. El mtodo
elimina el uso de sondas de DNA. En su lugar, se usa el marcado fluorescente de un fragmento de DNA (cDNA o complementario), para la hibridacin de la muestra en estudio. Se utilizan escneres lser de alta resolucin para la deteccin de las
seales fluorescentes emitidas, mientras que el nivel de expresin de genes y el genotipo de las muestras biolgicas se determinan a travs de la aplicacin de la bioinformtica.
APLICACIONES. Las micromatrices de DNA se usan para obtener perfiles moleculares de los tumores que ayudan a arribar a
diagnsticos histogenticos especficos y a establecer el pronstico.
MICRODISECCIN CON LSER
La microdiseccin con lser es otra tcnica nueva en la patologa quirrgica diagnstica que permite definir el perfil molecular del material tisular. Consiste en la diseccin de una sola
clula o parte de una clula p. ej., cromosomas a travs de tecnologa lser y soporte informtico apropiado para el procedimiento. Luego, el material aislado se puede usar para realizar
las pruebas moleculares disponibles.
LA TELEPATOLOGA Y LA MICROSCOPIA VIRTUAL
La telepatologa se define como la prctica de la patologa
diagnstica a cargo de un patlogo presente en otro sitio a travs de imgenes de las muestras tisulares transmitidas mediante una red de telecomunicaciones. Los componentes principales de un sistema de telepatologa son los siguientes:
microscopia ptica convencional;
mtodo para la captura de la imagen; en general, una cmara montada sobre el microscopio ptico;
conexin de telecomunicaciones entre el lado emisor y el
receptor;
y una base operativa en el extremo receptor con un monitor de alta calidad.
De acuerdo con la necesidad y el presupuesto, el sistema de
telepatologa puede ser de dos tipos:
Esttico (almacenamiento y transmisin, telepatologa pasiva):
consiste en la captura de imgenes especficas, su almacena-

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana

19

Tcnicas para el estudio de la patologa

2. un sistema computarizado (CPU, monitor, teclado, mouse,

etc.) conectado con el microscopio.
3. un equipo de captura de imgenes que convierte las imgenes de vdeo del monitor en imgenes digitales y las almacena
en la CPU.
4. soporte informtico para el anlisis de las imgenes instalado en el ordenador de acuerdo con las necesidades del usuario para realizar las mediciones y los clculos.

CAPTULO 2

5. Regin organizadora del nucleolo (NOR, por su sigla en

ingls). El nucleolo contiene componentes ribosmicos que se
forman en regiones de los cromosomas con DNA denominadas
NOR. Estas reas revelan afinidad por el metal plata. Esta
propiedad se usa para la tincin del fragmento con plata (tcnica AgNOR). Las NOR se presentan como manchas intranucleares de color negro, mientras que el fondo se tie de amarillo-amarronado.

20

SECCIN I

miento y su transmisin a travs de un correo electrnico, un

protocolo de transferencia de archivos, un sitio web o CDROM. El mtodo es bastante econmico y se usa con mayor frecuencia, pero tiene la desventaja de que el emisor es el que selecciona las imgenes transmitidas.
Dinmico (telepatologa interactiva con robot): consiste en imgenes transmitidas en tiempo real desde un microscopio distante. El movimiento robtico del microscopio se controla a distancia, se adjuntan las imgenes y los campos elegidos
procedentes de un servidor a distancia o local. En consecuencia,
este mtodo casi duplica la perfeccin del examen de los portaobjetos bajo el microscopio; se denomina microscopia virtual. Sin

embargo, la calidad de la imagen y la velocidad de Internet

pueden ser obstculos importantes.
La era de la patologa digital en el siglo XXI alcanz su cenit con
la disponibilidad de la tecnologa para preparar piezas de patologa
virtuales con equipos de alta velocidad y con el almacenamiento
de datos en ordenadores con gran capacidad de memoria. Estas
piezas almacenadas en la memoria del ordenador se pueden examinar e informar sin la necesidad de usar un microscopio. No
obstante, la pregunta principal es si los patlogos actuales, acostumbrados a la microscopia convencional, lograrn la misma percepcin en el monitor. En la actualidad, esta tecnologa es til para
la enseanza, las reuniones clnicas y el control de calidad.

Patologa general y tcnicas bsicas

Patologa + Resumen y preguntas de autoevaluacin 2012. Editorial Mdica Panamericana