SESIÓN 2 DE PRÁCTICAS DE

LABORATORIO. SEPARACIÓN DE LA
BIOMASA Y LAS VINAZAS.
SELECCIÓN DE ALTERNATIVAS
1. SEPARACIÓN DE INSOLUBLES

La separación y purificación de un producto biotecnológico es una parte crítica del proceso de

producción. En la fermentación, la recuperación y el procesado de la biomasa de levaduras (o
bacterias) de un cultivo, así como de los productos de la fermentación, son operaciones
esenciales del proceso de producción. Los caldos de fermentación son mezclas acuosas
complejas de células (insolubles), productos extracelulares solubles, productos intracelulares y
sustratos no convertidos. Las operaciones de separación (downstream processing) para la
recuperación del producto dependen de la localización del producto (intracelular o
extracelular), de las propiedades del mismo (tamaño, carga, solubilidad), así como de la escala
del proceso y el valor del producto. En nuestro caso el objetivo es la separación de material
insoluble (biomasa) de un caldo de fermentación en que la biomasa se encuentra en forma no
retenida o no inmovilizada mediante la aplicación de fuerzas. Las operaciones más utilizadas
para la separación de insolubles son la centrifugación y la filtración, aunque la sedimentación
gravitatoria y la floculación tienen una amplia aplicación, especialmente en instalaciones de
tratamiento biológico de aguas residuales. En general, los costes relativos al cosechado y
separación de la biomasa son elevados, constituyendo una parte importante del coste total de
producción (en algunos casos suponen el coste principal), por lo que la recuperación
económica de la biomasa es un reto y los costes se deben reducir hasta un nivel aceptable. En
general, las dificultades con el cosechado y la recuperación de la biomasa se asocian a diversos
factores: la naturaleza de las células, tales como tamaño, densidad, carga y morfología, que
dependen de la especie, las condiciones de crecimiento y la edad del cultivo; la relativamente
baja concentración de biomasa en cultivos a gran escala; y el elevado coste de los equipos.
Además, la concentración de los productos biotecnológicos en el medio de fermentación suele
ser baja, lo cual tiene una influencia directa en el coste del proceso de separación y en la
fracción de dicho coste en el precio final del producto.

El mayor reto es seleccionar una tecnología apropiada para la separación de la biomasa que
permita reducir los costes de operación. La selección de una u otra operación depende de la
escala de operación, la localización (intra- o extracelular) y la selectividad de los productos. La
floculación y la sedimentación se utilizan fundamentalmente en los procesos de depuración
biológica de aguas residuales y en la producción de proteína unicelular. En la práctica, se usan
con mayor frecuencia la centrifugación para recuperar productos intracelulares y la filtración
cuando el producto deseado es extracelular. Normalmente la densidad de la biomasa es del
orden de 1.05-1.10 kg/L, por lo que se diferencia muy poco del medio líquido. La facilidad de

1
separación también depende de la naturaleza del caldo de fermentación, pH y temperatura y,
en muchos casos, deben añadirse coadyuvantes de filtración, agentes floculantes, etc.

Debido a los requerimientos de procesado corriente abajo, la concentración de la biomasa

normalmente debe aumentarse con el fin de producir una suspensión concentrada, una pasta
o un sólido seco. La eficacia de un proceso de separación sólido-líquido se puede describir en
términos de la eficiencia de recuperación (RE, recovery efficiency) y del factor de concentración
(CF, concentration factor):

 La eficiencia de recuperación se define como la razón entre la masa de células

recuperadas en el producto final y la masa total de células en el cultivo inicial.
é
ó ( )= [1]
é

 El factor de concentración es la razón entre la concentración de biomasa en el

producto final y la concentración inicial de cultivo.
ó
ó ( ) = [2]
ó

Para el caso de las células de levaduras de esta práctica, se puede obtener la eficiencia de la
recuperación de biomasa η como:

ó
= ≈ [3]
ó

donde C0 es la concentración de células en el cultivo inicial y Ce es la concentración de células

de estado estacionario en el líquido clarificado procedente de la operación de separación.

Cualquier sistema de recuperación de biomasa en aplicaciones de fermentación debe ser capaz

de manejar volúmenes de cultivo elevados, ser fiable, tener bajos costes de adquisición y de
operación, ser fácil de manejar, y estar construido empleando materiales que sean
compatibles con el medio de cultivo. Además, debe permitir la reutilización de la biomasa.

FILTRACIÓN

La filtración convencional se utiliza para la separación de biomasa, precipitados amorfos o

productos cristalinos. Consiste en la separación de los sólidos contenidos en una suspensión
mediante una placa perforada (medio filtrante), que permite el paso del líquido y retiene las
partículas sólidas. La suspensión sólido-líquido que se alimenta al filtro se denomina jarabe y la
corriente líquida que atraviesa el medio filtrante y se obtiene como producto se conoce como
filtrado. Los sólidos retenidos forman un lecho o torta, cuyo espesor aumenta a lo largo de la
filtración. De esta forma, el medio filtrante actúa como soporte de la torta, que, a excepción
de los momentos iniciales, es la que realmente retiene las partículas sólidas. Por ello, aunque
podría parecer necesario que las perforaciones del medio filtrante debieran ser de menor
tamaño que las partículas que se quieren separar, en realidad no es así. Esto se debe a que
durante la formación de las primeras capas de la torta se forman puentes de partículas que
bloquean las perforaciones del material filtrante. La formación de estos puentes posibilita la
filtración de suspensiones que contengan sólidos de tamaño sensiblemente inferior al de las
perforaciones del medio filtrante, aunque el filtrado obtenido al principio debe recircularse a la

2
alimentación debido a su turbidez. Para vencer la resistencia que oponen la torta y el medio
filtrante a la circulación de la fase líquida ha de establecerse una diferencia de presiones entre
ambos lados del medio filtrante. Esta diferencia se puede conseguir mediante la aplicación de
presión, vacío o una fuerza centrífuga.

La operación de los equipos de filtración se describe en términos de la Teoría General de

Filtración, en la que el caudal de filtrado por unidad de superficie transversal de filtro puede
expresarse como:

∆
= = [4]

donde A representa la superficie del medio filtrante, V el volumen de filtrado, t el tiempo, ∆P la

diferencia de presión entre ambos lados del medio filtrante, y RT y RM las resistencias de la
torta y del medio, respectivamente.

La resistencia ofrecida por la torta tiene la siguiente expresión:

= [5]

siendo μ la viscosidad del líquido, W la masa de sólidos retenidos en el filtro por unidad de
volumen de filtrado, y  la resistencia específica de la torta, parámetro representativo de la
dificultad para la circulación del fluido a través de ella, cuyas dimensiones son longitud/masa.

La resistencia ofrecida por el medio filtrante se asimila a la de una torta ficticia cuya resistencia
se expresa de la siguiente forma:

= [6]

siendo Ve el volumen de líquido claro que debería filtrarse para obtener una torta de
resistencia igual a la del medio filtrante real.

Sustituyendo las ecuaciones [5] y [6] en la ecuación [4] se obtiene:

∆
= [7]
( )

Si la filtración se realiza a presión constante entonces ∆P se mantiene constante durante el

proceso. La integración de la ecuación [7] a ∆P constante conduce a la siguiente expresión:

= + [8]
∆

que permite el cálculo del tiempo de filtración necesario para obtener un volumen de filtrado
determinado. Los valores de los parámetros  y Ve pueden obtenerse experimentalmente a
partir de un ensayo de filtración a ∆P constante, utilizando un filtro de superficie conocida.
Para ello, si se dividen los dos miembros de la ecuación [8] por V se obtiene:

= + [9]
∆

3
La ecuación [9] pone de manifiesto que la representación de los datos experimentales de la
forma t/V frente a V debe conducir a una línea recta cuya pendiente m y ordenada en el origen
b tienen las siguientes expresiones:

∆
= ∴ = [10]
∆

∆
= = ∴ = [11]
∆ ∆

Figura de F. Rodríguez, Ingeniería de la industria alimentaria, vol. 2, 2002.

Los caldos de fermentación y otras soluciones de origen biológico son difíciles de filtrar debido
a su elevada viscosidad aparente, así como al carácter altamente compresible de sus tortas de
filtración. Estas características son más pronunciadas en el caso de microorganismos que
forman micelio, aunque pueden aplicarse a caldos de fermentación bacterianos. Como
resultado de esto, suelen precisarse pretratamientos como la coagulación y floculación, o
adsorción sobre coadyuvantes de filtración.

Cuando se forman tortas compresibles la velocidad de filtración disminuye al irse

comprimiendo la torta. En este caso se relaciona la resistencia de la torta con la diferencia de
presión mediante expresiones del tipo:

= (∆ ) [12]

donde ' es una constante relacionada con el tamaño y forma de las partículas de la torta y el
exponente s es la compresibilidad de la torta, variando entre 0 (torta incompresible) y 1,
tomando usualmente valores, determinados experimentalmente, entre 0.1 y 0.8.

A la hora de plantear un sistema de filtración es necesario establecer cuál es el medio filtrante

más adecuado, si es o no necesaria la utilización de coadyuvantes, así como la cantidad de
líquido necesaria para el lavado de la torta. En la selección del medio filtrante pueden
considerarse alternativas muy variadas, desde materiales rígidos, como las placas cerámicas o
metálicas perforadas, hasta materiales flexibles, como las fibras naturales (algodón, seda...) y
sintéticas (papel, nylon...). La elección no suele ser sencilla, debiendo tenerse en cuenta
múltiples aspectos, entre los que se encuentran: mínima resistencia específica posible,
facilidad para desprender la torta una vez finalizado el proceso, resistencia mecánica
adecuada, coste, etc. Para los sólidos muy finos y fácilmente deformables, que forman tortas
prácticamente impermeables al líquido que pueden obturar el medio filtrante, se utilizan
coadyuvantes de filtración con el fin de aumentar artificialmente la porosidad de la torta para
conseguir caudales que hagan viable la separación. Como tales se usan materiales rígidos de

4
elevada porosidad que, por un lado, retienen las partículas más finas y, por otro lado, generan
una red de canales en la torta que facilita el paso del filtrado a su través. Otra manera de
utilizar los coadyuvantes es formar una capa protectora que evite la obturación del medio
filtrante, así como el escape de las partículas más finas durante los primeros momentos de la
filtración. Finalizada la filtración ha de realizarse un lavado de la torta con el fin de eliminar el
líquido retenido en la misma. Puede utilizarse cualquier disolvente miscible con el filtrado,
siendo el empleo de agua lo más habitual en la industria biotecnológica.

SEDIMENTACIÓN GRAVITATORIA

La sedimentación puede utilizarse como proceso de separación de biomasa cuando las células
tienden a agregarse (coagular) o a formar flóculos con la ayuda de cationes polivalentes o
polímeros extracelulares. Esta agregación proporciona un sistema de bajo coste de separación
de sólidos ampliamente utilizado en los sistemas de lodos activos para el tratamiento de aguas
residuales. También puede utilizarse la sedimentación en procesos que involucren levaduras
floculantes.

La fuerza impulsora de esta operación es la diferencia de densidades entre ambas fases, que
en muchas ocasiones es pequeña, por lo que es frecuente que esta operación sea desplazada
por la centrifugación, más costosa, pero de mayor efectividad para la separación.

Cuando se considera una partícula sólida que desciende por gravedad en el seno de un fluido,
sobre dicha partícula actúan una serie de fuerzas: gravedad, flotación y rozamiento. La
partícula sigue un movimiento descendente acelerado, es decir, la velocidad de caída aumenta
a lo largo del tiempo hasta un punto en el que la partícula desciende con velocidad constante,
que se denomina velocidad terminal de sedimentación gravitatoria, vtg. En la práctica se
considera que dicha velocidad se alcanza instantáneamente. El cálculo de vtg se realiza
igualando a cero la fuerza neta que actúa sobre la partícula, que, para una partícula sólida,
esférica y con un régimen laminar (Re < 1) de descenso en el seno de un fluido Newtoniano,
tiene la siguiente expresión:

= [13]

Esta ecuación se conoce como Ley de Stokes (todo en unidades SI), donde Dp es el diámetro de
partícula, ρp y ρf son las densidades de la partícula y del fluido, respectivamente, μ es la
viscosidad del fluido, y g es la aceleración de la gravedad. En este análisis no se han
considerado posibles interacciones entre diferentes partículas que sedimentan en el seno del
fluido por lo que la velocidad límite de sedimentación deducida se conoce como velocidad de
sedimentación libre.

En la realidad industrial, la concentración de partículas sólidas en las suspensiones puede ser lo

suficientemente elevada para que no puedan despreciarse las interacciones entre ellas, lo que
conlleva a un notable aumento del rozamiento. En este tipo de sedimentación, conocida como
sedimentación impedida, la velocidad de descenso puede ser considerablemente inferior a la
predicha por la expresión de sedimentación libre. Las expresiones empíricas que existen para
la sedimentación impedida se deben utilizar con precaución ya que la velocidad de
sedimentación puede variar mucho con la forma de las partículas y con la distribución de

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tamaños de las mismas. Por ello, el diseño de sistemas industriales de sedimentación es
conveniente hacerlo a partir de datos experimentales con la misma suspensión con la que se
va a trabajar, utilizando probetas de vidrio en las que se determina visualmente la velocidad de
sedimentación. El tratamiento de los datos experimentales de este tipo no se incluye en la
presente guía.

En la sedimentación discontinua se introduce en el sedimentador cilíndrico la suspensión,

dejándola sedimentar durante un cierto período de tiempo. Estos sedimentadores no son
habituales a escala industrial, pero resultan didácticos para analizar la evolución del proceso a
lo largo del tiempo. Al comenzar el proceso, en el tanque se aprecia una única zona, en la que
la concentración de sólidos es igual a la concentración inicial de la suspensión. A partir de este
momento las partículas comienzan a sedimentar, estableciéndose diferentes zonas: en la zona
superior (A) aparece líquido claro; en la zona inmediatamente inferior (B) está la zona de
concentración constante, en la que la concentración de sólidos se mantiene en un valor similar
al de la concentración inicial de la suspensión y de ella han desaparecido las partículas de
mayor tamaño, que sedimentan a mayor velocidad. La zona denominada zona de
concentración variable (C) contiene sólidos de diferentes tamaños y en ella la concentración de
partículas aumenta con la profundidad. Finalmente, la zona más profunda es la zona de
compresión (D), constituida mayoritariamente por las partículas sólidas de mayor tamaño que
han alcanzado el fondo de la probeta y se van compactando a lo largo del proceso. Conforme
avanza la sedimentación las zonas "A" y "D" aumentan continuamente de espesor, mientras
que el espesor de "B" disminuye, llegando a desaparecer. La altura de la zona "C" inicialmente
aumenta, pero luego disminuye hasta desparecer. Cuando desparece la zona "C" queda una
única interfase "A-D", y a partir de ese momento la sedimentación transcurre de forma muy
lenta, comprimiendo el sólido y desplazando el líquido a la zona "A". La siguiente figura
representa esta evolución.

Figura de F. Rodríguez, Ingeniería de la industria alimentaria, vol. 2, 2002.

COAGULACIÓN Y FLOCULACIÓN

La coagulación y la floculación son dos unidades de proceso bien diferenciadas. La coagulación

implica la adición de una sustancia química coagulante con el fin de acondicionar la materia en
suspensión, coloidal y disuelta, desestabilizándola mediante la neutralización de sus cargas
electrostáticas, haciendo que las partículas tiendan a unirse entre sí, lo que se conoce como
floculación. Los coagulantes tradicionales como el cloruro férrico, el sulfato férrico y el sulfato
de aluminio, se hidrolizan rápidamente en agua, formando precipitados insolubles que se
adsorben a las partículas presentes en el agua, reduciendo o neutralizando sus cargas y
permitiendo la subsiguiente formación de puentes entre partículas. La concentración de
partículas en suspensión y del coagulante afectan de manera importante a la química del

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proceso de coagulación. Por otro lado, la floculación implica la agregación de partículas
desestabilizadas y de los productos de precipitación formados por uno o más coagulantes,
para dar lugar a partículas de mayor tamaño conocidas como partículas floculantes o flóculos.
Los flóculos resultantes son más fáciles de recuperar mediante los métodos tradicionales de
separación sólido-líquido, por ejemplo, sedimentan mejor, ya que la aglomeración de
partículas desestabilizadas da lugar a microflóculos, y después a flóculos más grandes que
tienden a depositarse en el fondo de los recipientes sedimentadores. El proceso de
coagulación generalmente es más rápido que el de floculación, del orden de menos de 10 s
para el primero y del orden de 20-45 min para el segundo.

La coagulación y la floculación pueden iniciarse mediante el uso de coagulantes inorgánicos,

orgánicos (generalmente polímeros) o mediante procedimientos de autofloculación,
biofloculación, ultrasonidos y electrocoagulación. Los coagulantes más empleados, por
ejemplo, en los procesos de depuración de aguas, son las sales de aluminio y de hierro. El
sulfato férrico, el cloruro férrico y el sulfato de aluminio están disponibles comercialmente y
son baratos y muy eficaces en la recuperación de partículas coloidales (tablas 10.1 y 10.2). La
extensión de la coagulación, la recuperación de partículas en suspensión y el coste dependen
en último término de la especie de microorganismo y de su concentración inicial, de la carga
inicial de la superficie de las células de microorganismo, del coagulante o coagulantes
empleados, de la dosis de coagulante, del grado de mezcla y de parámetros del cultivo como
alcalinidad, fuerza iónica, pH y temperatura. La dosis óptima depende del sistema y se debe
determinar para cada caso individualmente. Las dosis óptimas de coagulante se pueden
obtener a partir de ensayos en discontinuo en jarras, del mismo modo que los ensayos de
sedimentación en discontinuo.

Tablas de S.L. Pahl et al, Harvesting, thickening and dewatering microalgae biomass, Algae for biofuels and energy, 2013.

Los principales inconvenientes en el uso de coagulantes inorgánicos para la recuperación de

biomasa son los elevados costes de operación, ya que aumenta la cantidad de lodos, quedan
sales metálicas disueltas residuales en el medio de cultivo y se incorporan sales metálicas a la
biomasa recuperada, lo cual imposibilita su reutilización en la industria alimentaria.

CENTRIFUGACIÓN

Se engloban en la centrifugación todas aquellas separaciones que utilizan la fuerza centrífuga

para incrementar la velocidad de separación. Se habla de centrifugación de tipo sedimentación

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(o simplemente centrifugación) cuando se aprovecha la diferencia de densidad entre las
partículas sólidas y el fluido, como en el caso de la sedimentación, pero acelerando el proceso
en un campo centrífugo, mientras que la filtración centrífuga consiste en una filtración
impulsada por una fuerza centrífuga. La centrifugación es una alternativa a los procesos
convencionales de sedimentación gravitatoria y filtración, aunque debe tenerse en cuenta su
elevado coste y realizar un estudio económico de las diferentes posibilidades. De forma
general, la centrifugación puede resultar una alternativa viable en los siguientes casos:

 Procesos en los que se manejan partículas de pequeño tamaño.

 Cuando la diferencia de densidades entre las dos fases sea pequeña.
 Cuando el espacio disponible sea escaso, ya que las centrífugas son más compactas.
 En el caso de productos de alto valor añadido.

Los separadores centrífugos más empleados en procesos biotecnológicos incluyen la centrífuga

tubular, de disco y de cesta (perforada). La tubular puede conducir a elevadas fuerzas
centrífugas a pesar de su sencillez. Las de disco pueden operar con descarga intermitente o
continua de sólidos. Para la filtración centrífuga se usan las de cesta.

Una partícula sólida que sedimenta bajo la acción de la gravedad se acelera hasta una
velocidad final de sedimentación independiente de la concentración, dada por la Ley de
Stokes. Cuando se considera que esa misma partícula sedimenta por acción de la fuerza
centrífuga, sobre ella actúan también las fuerzas de rozamiento y de desplazamiento de
Arquímedes consideradas para la sedimentación gravitatoria. Por ello, al igual que entonces, la
partícula alcanzará una velocidad terminal, cuya expresión se obtiene sustituyendo la
aceleración de la gravedad, g, por la aceleración centrífuga, ω2r:

= [14]

siendo ω la velocidad angular de giro (rad/s) y r la distancia de la partícula al eje de rotación

(m). La ecuación [14] pone de manifiesto que en el caso de la centrifugación la velocidad
terminal es función del radio, es decir, la velocidad con que sedimenta la partícula aumenta al
distanciarse del eje de giro. Además, esta relación indica un hecho muy simple, y es que la
velocidad de sedimentación en una centrífuga es igual a la velocidad terminal en el campo
gravitatorio incrementada en un factor adimensional variable (RCF, cuya definición se dará
más adelante).

Figura de F. Rodríguez, Ingeniería de la industria alimentaria, vol. 2, 2002.

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En la figura se esquematiza una clarificadora centrífuga, consistente en una cámara cilíndrica
simple que gira alrededor de su eje, a la que se alimenta continuamente la suspensión que se
desea separar. Las partículas sólidas suspendidas en el alimento alcanzan la superficie de radio
r1, comenzando a sedimentar con una velocidad terminal que es función de su diámetro y del
radio a que se encuentren, siendo simultáneamente arrastradas por el movimiento de fluido
hacia la salida del equipo. Las partículas de mayor tamaño alcanzan la pared de la centrífuga
antes de salir, pero las partículas más pequeñas no tendrán tiempo de sedimentar sobre la
pared y saldrán con el efluente de la centrífuga. Por lo que, si se desea separar partículas de un
tamaño superior a uno fijado, Dp, el tiempo de residencia de la suspensión en el interior de la
centrífuga, tr, debe ser suficiente para permitir su sedimentación. Dicho tiempo de residencia
será el cociente entre el volumen útil de la centrífuga, V, y el caudal volumétrico de
suspensión, QV:

= = [15]

La velocidad a la que sedimentan las partículas en cada momento será:

= ∴ = [16]

Tomando un criterio conservador, se supone que todas las partículas se encuentran

inicialmente en un radio r1 y que el espesor de la torta, e, es despreciable en todo momento.
Con estas condiciones los límites de integración son t = 0: r = r1, y t = tR: r = r2, cuya solución
conduce a la expresión representativa del tiempo de residencia necesario para que
sedimenten las partículas de tamaño superior a Dp:

= [17]

Igualando las ecuaciones [15] y [17], y despejando el caudal volumétrico de suspensión, se

obtiene:

= [18]

que, multiplicando y dividiendo por la aceleración de la gravedad, proporciona la expresión:

= [19]

Si definimos el parámetro Σ como:

= [20]

entonces, se obtiene la siguiente expresión para el cálculo del caudal de suspensión que es
capaz de tratar una centrífuga si se desea sedimentar partículas de diámetro superior a Dp:

= [21]

9
Esta expresión se refiere a una eficacia de recuperación para las partículas de diámetro mayor
a un determinado diámetro del 100%, pero se puede introducir en la misma un factor de
eficacia para considerar porcentajes de recuperación inferiores (η definido en ecuación [3]):

= [22]

El parámetro Σ (m2), conocido como factor de capacidad, representa la superficie de un

sedimentador gravitatorio que tuviera la misma capacidad de separación de sólidos que la
centrífuga. Este parámetro sólo depende de las características geométricas de la centrífuga y
su velocidad de giro, por lo que también se conoce como área equivalente o característica de
la centrífuga.

Conviene resaltar que:

 vtg es una función de la partícula y del fluido (tamaño de partícula, densidades y

viscosidad).
 Σ es una función de la centrífuga (longitud, radios, ángulo, distancias, revoluciones).
 QV es el caudal equivalente de un sedimentador por gravedad que separa partículas
que sedimentan en una superficie igual a Σ (m2) a una velocidad vtg (m/s).

La ecuación [17] se ha desarrollado a partir de la expresión del tiempo de residencia para la

centrífuga sencilla esquematizada en la figura, siendo válida exclusivamente para este tipo de
configuración. Las expresiones que relacionan Σ con las dimensiones y velocidad de giro de las
centrífugas son diferentes para los distintos tipos de centrífugas. En la siguiente tabla se
recogen valores de Σ para tres tipos de clarificadoras centrífugas.

Tabla de Perry y Green, Perry's Chemical Engineer's handbook, 1999.

A pesar de que la centrifugación es una tecnología más que probada en su rapidez y eficacia
para el cosechado de biomasa, su uso y los elevados costes de inversión y de operación se
deben de tener en cuenta en conjunción con el escalado y el valor del producto. El
rendimiento de la centrífuga está muy sujeto al diseño, por lo que la selección de la centrífuga
para un proceso determinado se debe basar en ensayos y consultas con el fabricante.

10
Escalado de la centrifugación

En el diseño y operación de centrífugas se utilizan datos de laboratorio para predecir el

comportamiento de centrífugas comerciales. Los datos de laboratorio conducen, a menudo, a
una separación ideal entre un sobrenadante claro y sólidos empacados que se eliminan
manualmente. Esta separación ideal no se consigue en centrífugas continuas.

En el escalado de datos de laboratorio se utilizan varios criterios para obtener información y

comparar diversas centrífugas:

1) El rendimiento en la sedimentación debe mantenerse si se mantiene el mismo valor del

cociente Σ/QV en los dos equipos. Por tanto, el parámetro Σ sirve de base para establecer un
sencillo criterio de cambio de escala en sedimentación centrífuga. De acuerdo con la ecuación
[20], para que dos centrífugas del mismo tipo, pero de diferente tamaño sean capaces de
separar partículas del mismo tamaño ha de permanecer constante el cociente Σ/QV, es decir,
ha de cumplirse:

( )
( )
= [23]

Partiendo de esta ecuación, conocidos el valor de y el caudal de una centrífuga 1 (de la que
se dispone de datos), puede estimarse el valor de que debe tener otra centrífuga 2 para
tratar un caudal diferente de la suspensión. Este criterio es bastante seguro si se comparan
centrífugas de geometría similar y patrones de circulación de fluido que dan lugar a una
aceleración centrífuga similar. Sin embargo, resulta muy poco fiable utilizar este criterio de
cambio de escala en centrífugas de diferente configuración o cuando la aceleración
desarrollada difiere en un factor de más de 2. La razón es que en el concepto de Σ se asume
que el patrón de circulación del fluido es ideal y que la sedimentación de las partículas no está
impedida y tiene lugar a la velocidad de Stokes de sedimentación.

Se podría obtener una comparación más eficaz si se multiplica Σ por un factor corrector o de
eficacia, cuyo valor sea característico del tipo de centrífuga (tabla 18-13). Se estima que el
factor es de casi el 100% para centrífugas de laboratorio de botella (bottle centrifuge),
aproximadamente un 80% para las centrífugas tubulares operando a velocidades bajas, y
menos de un 55% para centrífugas de discos. El rendimiento de una centrífuga se puede
desviar del teórico debido a factores tales como la distribución por tamaños de las partículas,
la forma de las partículas, la desaglomeración de flóculos en la alimentación, la reaglomeración
de flóculos dentro de la centrífuga, mala distribución del flujo en la centrífuga, y efectos de
sedimentación impedida debido a cambios de concentración de los sólidos que sedimentan.
Los ajustes necesarios para estos factores de escalado sólo se pueden conseguir mediante
ensayos adicionales.

2) Otro criterio de comparación empleado en el escalado consiste en mantener constante la

magnitud de la fuerza centrífuga relativa (RCF, relative centrifugal force, o G), también llamada
fuerza de sedimentación relativa o aceleración relativa. La fuerza centrífuga relativa
proporciona una medida del poder separador de una centrífuga y viene dada por el cociente
entre la fuerza que actúa sobre una partícula en el campo centrífugo y la correspondiente en el
gravitatorio, de forma que esta expresión hace referencia a la aceleración centrífuga en

11
términos de aceleración de la gravedad, g, es decir, se describe la aceleración centrífuga en
términos del número de gs:

= [24]

donde r es el radio externo de la centrífuga (m), y la velocidad angular (rad/s) es:

= [25]

donde N es la velocidad rotacional o de giro (rpm). También se puede expresar RCF como:

= = 11.18 × 10 [26]

3) Un tercer criterio de comparación entre diferentes centrífugas es el tiempo equivalente, que

es el producto RCF×t. El tiempo equivalente estima la dificultad de una separación
determinada. Cuando se ha determinado el valor de RCF×t necesario para obtener una
separación determinada, se considera una centrífuga con un valor similar como primera
aproximación.

Figura de Woon-Fong Leung, Centrifugal Separations in Biotechnology, 2007.

2. PREPARACIÓN PREVIA

Antes de comenzar el procedimiento experimental es necesario establecer la metodología de

mediciones que se va a seguir. Por limitación de tiempo en las sesiones de laboratorio esta
sección no se incluye en el procedimiento experimental, sino que los datos presentados se han
obtenido con antelación.

MEDIDAS DE EFICACIA DE RECUPERACIÓN DE BIOMASA

Las medidas de eficacia de recuperación de biomasa se basan en las medidas de la

concentración de biomasa (ecuación [3]), que no es una variable medida directamente, sino
que se obtiene a partir de medidas de absorbancia de la suspensión a una longitud de onda

12
determinada. En esta sección se establece la longitud de onda de medida y se presenta la recta
de calibrado para obtener la concentración de biomasa a partir de la absorbancia.

1. Curva espectral y selección de longitud de onda. Se ha obtenido la curva espectral de una

suspensión de S. cerevisiae de 5 g/L, midiendo su absorbancia en un espectrofotómetro UV-
visible desde 450 hasta 750 nm. Como blanco se ha usado agua del grifo. Se ha seleccionado la
longitud de onda de 710 nm para preparar la curva de calibrado.

2. Curva de calibrado para la concentración de biomasa. Se ha obtenido una recta de calibrado

a partir de una suspensión de S. cerevisiae de 6 g/L (suspensión madre) preparando, mediante
dilución de la suspensión madre con agua de grifo, 10 suspensiones de levadura de
concentraciones desde 0.6 hasta 6 g/L y midiendo su absorbancia a 710 nm en un
espectrofotómetro UV-visible de haz simple (UNICAM Helios Epsilon). Nuestra recta de
calibrado se basa en el cumplimiento de la Ley de Beer, por lo que se debe seleccionar el
tramo de la curva de calibrado que es lineal para obtener la ecuación de la recta de calibrado.
El tramo recto corresponde a los cuatro primeros puntos (ver gráfica). La expresión de la recta
de calibrado así obtenida es: Abs710 nm  0.336  C b g L , válida para valores de absorbancia
de hasta 0.8 (nunca superiores) y empleando el mismo equipo óptico.

Recta de calibrado Cb-Abs S. cerevisiae

0.9
0.8
0.7
Absorbancia 710 nm

0.6
0.5 y = 0.336x
0.4 R² = 0.982
0.3
0.2
0.1
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Concentración de biomasa, g/L

3. PROCEDIMIENTO

A) FILTRACIÓN

1. Prepara una suspensión de levadura que servirá como caldo de fermentación simulado:

1.1. Pesa la cantidad de levadura fresca que se precisa para preparar una suspensión
de levadura fresca de 10 g/L en un matraz aforado de 2 L.

1.2. Coloca esta cantidad en un vaso de precipitados y agrega lentamente agua del
grifo, agitando hasta formar una suspensión completamente homogénea.

1.3. Vierte la suspensión en un matraz aforado de 2 L y etiquétalo.

1.4. Completa con agua del grifo hasta el enrase de 2 L.

1.5. Asegura bien el tapón, agita vigorosamente el matraz, y toma una muestra de la
suspensión para medir la absorbancia y determinar la concentración de biomasa inicial.

13
Recuerda que si la absorbancia medida supera el valor de 0.8 será necesario diluir la muestra
con agua del grifo y repetir la medida de la absorbancia, anotando la dilución de la siguiente
forma: factor de dilución (FD) = volumen total/volumen de muestra; por ejemplo, si se toman
2 mL de muestra y se diluye hasta un volumen total de 10 mL (añadiendo 8 mL de agua del
grifo), el FD se expresa como 10/2 = 5.

2. Realiza ensayos de filtración a vacío (presión constante):

2.1. Coloca uno de los tres tipos de filtro disponibles en el embudo Büchner y
humedécelo con ayuda de un frasco lavador. Desecha el agua de lavado del matraz Kitasato y
colócalo de nuevo, comprobando que el equipo de filtración esté listo para usarse. La
profesora supervisará que el equipo está listo para filtrar antes de comenzar el primer ensayo.

2.2. Agita vigorosamente de nuevo el matraz aforado de 2 L que contiene la

suspensión y toma, con una probeta, un volumen de 450 mL de suspensión.

2.3. Vierte de forma continua (a demanda, según la capacidad del equipo de filtración)
la muestra de 450 mL y simultáneamente anota el volumen filtrado frente al tiempo de
filtración a lo largo del ensayo. No olvides anotar también la presión diferencial que marca la
bomba de vacío durante el ensayo.

2.4. Al final del ensayo toma una muestra del filtrado, mide su absorbancia y
determina la concentración de biomasa en el filtrado (igual que antes, sigue el protocolo
explicado arriba en lo referente a no superar el valor de 0.8 de absorbancia).

2.5. Repite desde el paso 2.1 para cada uno de los dos filtros restantes.

B) SEDIMENTACIÓN

1. Prepara una suspensión de levadura que servirá como caldo de fermentación simulado, con
y sin coagulantes:

Sin coagulantes:

1.1. Pesa las cantidades de levadura fresca que se precisan para preparar dos
suspensiones de 1 L, con concentraciones de levadura fresca de 10 g/L y 30 g/L.

1.2. Coloca estas cantidades en vasos de precipitados y agrega lentamente agua del
grifo, agitando hasta formar una suspensión completamente homogénea.

1.3. Vierte las suspensiones en matraces aforados de 1 L, etiquetando cada matraz.

1.4. Completa hasta el enrase con agua del grifo.

Con coagulantes:

1.5. Pesa las cantidades de sulfato ferroso y cloruro férrico que se precisan para
preparar dos disoluciones (por coagulante) de 1 L de volumen, una de concentración 100
mg/L y otra de 250 mg/L (por coagulante).

1.6. Coloca estas cantidades en vasos de precipitados y agrega lentamente agua del
grifo, disolviendo las sales por completo. En este paso utiliza la menor cantidad de agua
posible.

1.7. Pesa las cantidades de levadura fresca que se precisan para preparar cuatro
suspensiones de 1 L, de concentración 10 g/L cada una.

14
 1.8. Coloca estas cantidades en vasos de precipitados y agrega lentamente agua del
grifo, agitando hasta formar suspensiones completamente homogéneas. En este paso utiliza la
menor cantidad de agua posible.

1.9. Vierte las suspensiones de levadura en matraces aforados de 1 L.

1.10. Agrega una disolución de coagulante a cada una de las suspensiones de levadura
en los matraces aforados, etiquetando cada matraz.

1.11. Completa los volúmenes hasta el enrase de 1 L con agua del grifo.

1.12. Asegura los tapones y agita vigorosamente.

2. Realiza ensayos de sedimentación en probetas para determinar las curvas de sedimentación

en los procesos de coagulación-floculación y sedimentación:

2.1. Tras agitar vigorosamente los matraces, transfiere aproximadamente la mitad de

cada suspensión desde el matraz aforado a una probeta graduada de 500 mL con escala de
graduación (en mm) para la altura, de forma que se pueda medir la altura del líquido con dicha
escala milimetrada, es decir, que la altura inicial del líquido en la probeta se pueda medir en
todo momento con la escala milimetrada y no quede por encima del máximo valor marcado.

2.2. Tapa las probetas con Parafilm, sujeta firmemente, invierte cada probeta una vez,
y colócala delante del foco de una lámpara. Haz esta operación simultáneamente para todas
las probetas.

2.3. Inmediatamente, pon en marcha el cronómetro. Haz esto para todos los
cronómetros simultáneamente, o bien usa un único cronómetro para todas las probetas.

2.4. Anota la altura inicial del líquido y anota la altura de la interfase del lodo a lo largo
del tiempo para cada probeta.

2.5. Se puede espaciar la frecuencia de toma de medidas de altura-tiempo en función

de la velocidad de sedimentación observada. Mide la altura de la interfase durante los
próximos 30 a 45 minutos, si es posible y se producen cambios apreciables.

2.6. Agita de nuevo los matraces que contienen los volúmenes sobrantes de las
suspensiones vertidas en las probetas y toma una muestra de cada matraz para medir la
absorbancia y determinar la concentración de biomasa inicial de cada suspensión. Recuerda
que si la absorbancia medida supera el valor de 0.8 será necesario diluir la muestra con agua
del grifo y repetir la medida de la absorbancia, anotando la dilución de la siguiente forma:
factor de dilución (FD) = volumen total/volumen de muestra; por ejemplo, si se toman 2 mL
de muestra y se diluye hasta un volumen total de 10 mL (añadiendo 8 mL de agua del grifo), el
FD se expresa como 10/2 = 5.

2.7. Al finalizar los ensayos en las probetas, retira las tapas de Parafilm (sin mover las
probetas para no perturbar los sedimentos formados) y, con ayuda de una pipeta volumétrica
o de una pipeta Pasteur, toma una muestra del sobrenadante de cada probeta, evitando
succionar materia de la interfase y de la zona del lodo. Mide la absorbancia de cada muestra y
determina la concentración de biomasa en el clarificado de cada probeta (igual que antes,
sigue el protocolo explicado arriba en lo referente a no superar el valor de 0.8 de absorbancia).

C) CENTRIFUGACIÓN

1. Prepara una suspensión de levadura que servirá como caldo de fermentación simulado:

15
 1.1. Pesa las cantidades de levadura fresca que se precisan para preparar dos
suspensiones de 500 mL, con concentraciones de levadura fresca de 10 g/L y 30 g/L,
respectivamente.

1.2. Coloca estas cantidades en vasos de precipitados y agrega lentamente agua del
grifo, agitando hasta formar suspensiones completamente homogéneas.

1.3. Vierte las suspensiones en matraces aforados de 500 mL, etiquetando cada
matraz.

1.4. Completa hasta el enrase con agua del grifo.

1.5. Asegura los tapones, agita vigorosamente los matraces, y toma una muestra de
cada suspensión para medir la absorbancia y determinar la concentración de biomasa inicial.
Recuerda que si la absorbancia medida supera el valor de 0.8 será necesario diluir la muestra
con agua del grifo y repetir la medida de la absorbancia, anotando la dilución de la siguiente
forma: factor de dilución (FD) = volumen total/volumen de muestra; por ejemplo, si se toman
2 mL de muestra y se diluye hasta un volumen total de 10 mL (añadiendo 8 mL de agua del
grifo), el FD se expresa como 10/2 = 5.

2. Realiza los ensayos en la centrífuga de laboratorio para determinar la velocidad terminal de

sedimentación gravitatoria:

2.1. Agita vigorosamente (de nuevo, si es necesario) los matraces con las suspensiones
y toma muestras de 10 mL de cada suspensión, colocándolas en los tubos de ensayo con
tapón.

2.2. Coloca los tubos de ensayo en una centrífuga de laboratorio de tubos (spintube),
de tipo cónica de ángulo fijo (HERAEUS Labofuge 200), de radios interno y externo de 3.5 y 8.0
cm, respectivamente, siguiendo las explicaciones de la profesora y bajo su supervisión.

2.3. Atiende a las explicaciones de la profesora sobre el funcionamiento del equipo y, a

continuación, completa las siguientes condiciones de ensayo (siempre empleando muestra
fresca para cada ensayo): velocidades de giro de 1600, 2000, 3000 y 4000 rpm, y para cada
velocidad de giro se usarán tiempos de centrifugación de 1, 2, 3, y 5 minutos.

2.4. Inmediatamente tras cada centrifugación, extrae los tubos de ensayo de la

centrífuga, evitando realizar movimientos bruscos para no perturbar los sedimentos formados
en el fondo de los tubos. Con ayuda de una pipeta volumétrica o de una pipeta Pasteur toma
una muestra del sobrenadante de cada tubo, evitando succionar materia del fondo para no
perturbar el sedimento. Mide la absorbancia de cada muestra y determina la concentración de
biomasa en el clarificado de cada tubo (igual que antes, sigue el protocolo explicado arriba en
lo referente a no superar el valor de 0.8 de absorbancia).

4. RESULTADOS Y TRATAMIENTO DE DATOS

Específicamente, el tratamiento de datos debe incluir los siguientes contenidos:

A) FILTRACIÓN

1. Obtén los parámetros de la Teoría General de Filtración (ecuaciones [9], [10] y [11]) a partir
de los datos obtenidos en los ensayos con cada filtro y analiza los resultados.
2. Calcula la eficiencia de la recuperación de biomasa para cada ensayo con la ecuación [3].
3. Compara los distintos filtros empleados atendiendo a la eficiencia de la recuperación.

16
4. Discute brevemente los resultados de esta operación.
B) SEDIMENTACIÓN

1. Si dispones de muy pocos puntos experimentales de altura-tiempo y/o las medidas de altura
se repiten (es decir, no hubo cambio en la altura de la interfase o éste ocurrió de forma súbita
y no se pudieron recoger datos), no se tratarán estos datos de la forma habitual (Coe y
Clevenger, etc.) sino que será suficiente con describir lo observado.
2. Calcula la eficiencia de la recuperación de biomasa en cada probeta con la ecuación [3].
3. Compara los dos coagulantes atendiendo a la eficiencia de la recuperación.
4. Discute brevemente los resultados de esta operación.
C) CENTRIFUGACIÓN

1. Calcula la eficiencia de la recuperación de biomasa para cada tubo (ecuación [3]) y

representa gráficamente los datos en función del tiempo de centrifugación t (un único gráfico
para la concentración de biomasa de 10 g/L y otro para la de 30 g/L, identificando cada serie
de datos mediante la velocidad de giro, N).
2. Calcula la fuerza centrífuga relativa RCF (ecuación [24] o [26]) y representa gráficamente los
datos de eficiencia de recuperación de biomasa en función del tiempo equivalente, RCF×t (un
único gráfico, identificando cada serie de datos según su concentración de biomasa, 10 o 30
g/L).
3. A partir de las representaciones anteriores selecciona t, RCF y RCF×t óptimos.
4. Determina la velocidad terminal de sedimentación gravitatoria, vtg. Para ello, ten en cuenta
que la ecuación [17] se puede reescribir, dividiendo y multiplicando por g, sustituyendo vtg
según la ecuación [13], y reordenado para vtg:

= ∙ ∴ = ∴ = [27]

Considera que r1 es el radio interno de la centrífuga de laboratorio y que r2 es el radio externo

de la misma. Si dudas entre diferentes combinaciones de t y ω, la opción a elegir será la más
conservativa, que en este caso es la que proporcione el valor de vtg más bajo.
5. Discute brevemente los resultados de esta operación.
SELECCIÓN DE LA OPERACIÓN DE SEPARACIÓN Y CÁLCULOS DE ESCALADO

Nota importante: el escalado de la operación de separación se llevará a cabo en la sesión

número 4 de la práctica, pero los cálculos para prepararlo se basan en los resultados obtenidos
en esta sesión número 2, por lo que los mismos se incluirán aquí (sesión 2).
1. Compara las tres operaciones de separación estudiadas y discute cuál es la más adecuada
atendiendo a los objetivos fijados.
2. Se pretende llevar a cabo la centrifugación del cultivo de una fermentación alcohólica a
mayor escala empleando una clarificadora centrífuga de cámara sólida RINA. Para dicha
clarificadora, calcula el área equivalente o característica mediante la ecuación [20]. Las
dimensiones de la clarificadora centrífuga de cámara sólida RINA son: r1 = 7.5 cm, r2 = 10 cm y
h = 10 cm. El valor de la velocidad angular para sustituir en la ecuación debe obtenerse
siguiendo el mismo criterio indicado en las instrucciones de cálculo del siguiente apartado (RCF
= 1505.5).

17
3. Realiza los cálculos para escalar la operación de centrifugación. La clarificadora centrífuga
RINA es semicontinua, ya que opera en modo continuo para el líquido y en modo discontinuo
para los sólidos, por lo que el objetivo del escalado de esta etapa es determinar el caudal
volumétrico máximo de suspensión alimentada que permita obtener una eficiencia de
recuperación de biomasa determinada. Lo ideal sería utilizar uno de los criterios de escalado
presentados antes, por ejemplo, el basado en igualar el valor de RCF en ambas centrífugas
(el valor de RCF seleccionado como óptimo en la centrífuga de laboratorio se iguala al valor de
RCF al que debería operar la centrífuga semicontinua RINA) para determinar el caudal QV
máximo teórico en la RINA. En lugar de eso, vamos a seguir un criterio distinto, que consiste
en establecer un valor de RCF conservativo, de forma que todos los grupos realicen los
mismos cálculos. El valor de RCF a usar para los cálculos de escalado es 1505.5. Utiliza las
ecuaciones [24] (o [26]), [22] y [20] para los cálculos. El valor de vtg es el obtenido previamente
en el tratamiento de datos de los ensayos en la centrífuga de laboratorio. La eficiencia de
recuperación de biomasa teórica se fijará en 0.95 (95%).

4. Una vez obtenido el caudal volumétrico QV máximo teórico para el escalado de la

centrifugación, se le aplica un factor de seguridad (FS) del 60% con el fin de obtener un caudal
de operación menos arriesgado para llevar a cabo los ensayos en continuo (en próximas
semanas) y no comprometer la eficiencia real que se obtenga en los mismos. Esto significa
que el caudal de operación será QVoperación = 0.6·QVmáximoteórico

18
TABLAS DE DATOS EXPERIMENTALES (hay que completar las tablas por duplicado en cada GT)
Tabla 1.- Datos experimentales de los ensayos de filtración.

Volumen de Tiempo, s
filtrado, mL
Filtro 1 Filtro 2 Filtro 3
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450

Filtro 1 Filtro 2 Filtro 3

Abs710 nm
inicial
FD
(VT/Vmuestra)
Abs710 nm
filtrado
FD
(VT/Vmuestra)

Filtro 1 Filtro 2 Filtro 3

ΔP, cm Hg
Diámetro, cm

19
Tabla 2.- Datos experimentales de los ensayos de sedimentación.

Tiempo, min h, cm
SC SC C CF C CF C SF C SF
10 g/L 30 g/L 100 mg/L 250 mg/L 100 mg/L 250 mg/L
0

SC SC C CF C CF C SF C SF
10 g/L 30 g/L 100 mg/L 250 mg/L 100 mg/L 250 mg/L
Abs710 nm
inicial
FD
(VT/Vmuestra)
Abs710 nm
sobrenadante
FD
(VT/Vmuestra)

20
Tabla 3.- Datos experimentales de los ensayos de centrifugación.

Tiempo, min Abs710 Abs710 FD Abs710 Abs710 FD

1600 rpm
10 g/L 30 g/L
1
2
3
5
2000 rpm
10 g/L 30 g/L
1
2
3
5
3000 rpm
10 g/L 30 g/L
1
2
3
5
4000 rpm
10 g/L 30 g/L
1
2
3
5

10 g/L 30 g/L
Abs710 nm
muestra sin centrifugar
FD
(VT/Vmuestra)

21