Centrifugacin ndice de tcnicas Mostrar el ndice de esta pgina La centrifugacin es una tcnica de sedimentacin, acelerada gracias al uso de fuerza

centrfuga. Se aplica al anlisis o a la separacin de mezclas de partculas, clulas, orgnulos o molculas. Teora de la centrifugacin y aspectos cuantitativos: vase Luque, p.123 o Freifelder, p.298. Instrumental 1. Tubos De vidrio o plstico. Resistentes qumicamente (disolventes, reactivos) y fsicamente (tensin a las velocidades elevadas que se emplean). Diversos tamaos y formas. Plsticos especiales para altas velocidades.

2. Centrfugas

Se puede regular velocidad, tiempo, temperatura. Elevadas velocidades (102-105 rpm). 3. Rotores Dos rotor rotor basculante

tipos :

angular o de ngulo fijo

Modalidades Segn la velocidad: Criterio aproximado: Centrifugacin a baja velocidad Centrifugacin a alta velocidad Ultracentrifugacin Segn el propsito: 1. Centrifugacin analtica Objetivo: medir las propiedades fsicas de las partculas que sedimentan, tales como su coeficiente de sedimentacin o su masa molecular. Especialmente en la variante ultracentrifugacin analtica. Las molculas se observan mediante un sistema ptico durante la centrifugacin. Los tubos de centrfuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y ultravioleta. Rotor basculante, observacin en vertical. 2. Centrifugacin preparativa De uso ms comn. Objetivo: aislar partculas, clulas o molculas para su anlisis o utilizacin posterior. En general, se emplea mayor cantidad de muestra que en la analtica. Segn el medio en el que se centrifuga y la forma como se aplica la muestra: 1. Centrifugacin diferencial (Tambin llamada de frontera mvil). El tubo se llena con muestra y se centrifuga. El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma, tamao, densidad y, lgicamente, de las condiciones de centrifugacin. Se obtienen slo 2 fracciones: sedimento y sobrenadante. [Nota: la palabra precipitado es ms adecuada para algo insoluble, que precipita por centrifugacin o por otros mecanismos (por ej., una reaccin qumica); sedimento es ms correcto para lo que se ha forzado a ir al menos de 10.000 rpm entre 10.000 y 20.000 rpm ms de 20.000 rpm

fondo pero seguira siendo soluble; pellet es una palabra inglesa para lo que queda compactado en el fondo como consecuencia de la centrifugacin] Una aplicacin tpica es el fraccionamiento subcelular (separacin de los distintos componentes de una clula, principalmente de los orgnulos) (vase Luque o Alberts) empleando sucesivas centrifugaciones a velocidad creciente.

2. Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin La muestra se aplica en una capa delgada sobre el medio de centrifugacin, que es un gradiente de densidad. Bajo la fuerza centrfuga, las partculas sedimentan a travs del gradiente concentrndose en zonas o bandas discretas. Su velocidad de avance (y, por tanto, el mecanismo de la separacin) depende de su tamao, forma y densidad; todos estos parmetros se combinan en el coeficiente de sedimentacin, Coeficiente de sedimentacin=s=velocidad de sedimentacinaceleracin centrfuga que se mide en unidades svedberg (1 S = 1013 segundos). La centrifugacin debe terminar antes de que alguna de las partculas separadas llegue al fondo del tubo. Los componentes separados se recogen individualmente aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas o, mejor, perforando el fondo del tubo y recogiendo en fracciones el lquido que cae. Puede verse una animacin de la separacin. El gradiente de densidad se crea mediante un gradiente de concentracin: concentraciones crecientes, al bajar en el tubo, de un componente adecuado. Se usan para ello sacarosa, cloruro de cesio, albmina, suero fetal bovino..., o medios comerciales como Ficoll un polisacrido sinttico , Percoll, metrizamida.... Se puede preparar: a) un gradiente discontinuo o escalonado, manualmente b) un gradiente continuo, empleando un dispositivo formador de

gradientes c) un gradiente continuo autoformado, si se crea mediante centrifugacin, normalmente a la vez que se fracciona la muestra

Centrifuga cin zonal. A) Preparacin de un gradiente continuo de densidad usando un mezclador. B) Aplicacin de la muestra sobre el gradiente. C) Colocacin de los tubos en un rotor basculante y centrifugaci n. D) Recogida en fracciones de los componente s

separados. Con esta tcnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares sanguneos, purificar espermatozoides viables, separar clulas viables y no viables de tejidos desagregados y muestras con clulas en suspensin, etc. 3. Centrifugacin isopcnica o de equilibrio de sedimentacin Se utiliza tambin un gradiente de densidad, pero en este caso el tiempo de centrifugacin es lo suficientemente largo (hasta 1 o 2 das) como para que se alcance el equilibrio de sedimentacin (entre la fuerza centrfuga, el empuje hidrosttico de la clula y su difusin). Para conseguirlo, se usan gradientes continuos que cubren todo el intervalo de densidades de los componentes de la muestra: en el fondo del tubo la densidad del medio ha de ser mayor que la del componente ms denso. De esta forma, independientemente del tiempo de centrifugacin, las partculas, clulas, etc. nunca sedimentarn en el fondo, sino que alcanzan una posicin estable intermedia en el gradiente, donde se concentran en una banda muy estrecha (mejor resolucin). Lo ms frecuente es mezclar la muestra con el material que formar el gradiente y generar un gradiente autoformado a la vez que se hace la separacin. Requiere velocidades muy altas (ultracentrifugacin) para que se forme el gradiente. Adems de la mayor resolucin, lo interesante de esta tcnica es que separa exclusivamente segn la densidad de los componentes de la muestra, que se sitan en la posicin del gradiente donde la densidad del medio es igual a la suya propia (isopcnica = de igual densidad, en griego). Comparacin e informacin adicional: Centrifugacin isopcnica o de equilibrio de sedimentacin (generalmente en (en gradiente preformado, gradiente preformado continuo o discontinuo) o auto-formado, continuo) Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin

Centrifugacin diferencial

Rotor angular, generalmente. Separacin en funcin principalmente del tamao, pero

Rotor basculante. Separacin en funcin del coeficiente de sedimentacin s, que depende de masa y

Rotor basculante. Separacin en funcin de la densidad. El gradiente evita la mezcla por

tambin del coeficiente forma. El gradiente evita de sedimentacin s, la mezcla por que depende de la conveccin/difusin: masa (tamao bandas bien separadas. densidad) y de la Se detiene la forma. (medido en centrifugacin antes de Svedbergs, 1S = 10- alcanzar el equilibrio. 13 segundos) Densidad mxima del Aplicacin: gradiente < densidad de separacin de tipos los componentes de la celulares, muestra. fraccionamiento Aplicacin: separacin subcelular (separacin de macromolculas, de de orgnulos), orgnulos similares, etc. separacin de asociaciones macromoleculares, etc. 4. Mtodos de barrera

conveccin/difusin: bandas bien separadas. El tiempo de centrifugacin es lo suficientemente largo como para que se alcance el equilibrio. Densidad mxima del gradiente > densidad de los componentes de la muestra. Aplicacin: separacin de molculas de cido nucleico, purificacin de cidos nucleicos, etc.

Mtodo rpido, tpico por ejemplo en la obtencin de leucocitos de sangre circulante libres del resto de clulas sanguneas. Se trata de una centrifugacin a travs de un medio de densidad constante (se podra considerar como un gradiente escalonado de una sola etapa). La densidad de este lecho debe ser intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios comerciales como Ficoll-Paque, Lymphoprep y otros muchos, formados generalmente por mezclas de Ficoll (un polisacrido sinttico) y metrizamida (un compuesto sinttico yodado). Se dispone de varios medios con densidades adecuadas para la separacin de tipos celulares concretos; por ej., Nycoprep 1.077 para clulas mononucleares, Nycoprep 1.068 para monocitos, Polymorhoprep para clulas polimorfonucleares, o Nycoprep 1.063 para plaquetas. Clculos Conversin de velocidad de giro (revoluciones por minuto, rpm) a aceleracin centrfuga (fuerza centrfuga relativa, FCR, sin unidades): Se conseguir una misma separacin en 2 centrfugas distintas cuando sea igual FCR, no si es igual la velocidad de giro (rpm). Es importante, por ello, dar las condiciones de centrifugacin en FCR, no en rpm.

La FCR es lo que coloquialmente se llama nmero de ges, porque se mide empleando como unidad la aceleracin de la gravedad, g. Se expresa as, por ej., una centrifugacin de 15 min a 20.000 g (o a 20.000 g ). La relacin entre ambas depende del radio del rotor (medido desde el eje de giro hasta la posicin de la muestra en el tubo) as: La separacin por centrifugacin depende de la masa celular (m), del radio de giro del tubo o radio del rotor donde se coloca la muestra (r) y de la velocidad alcanzada por la centrfuga ( o n): Fc=ma=mv2r=me2rt2=m2r2rt2=m2rt2=m2r= =m(2)2n2r=39,48mn2r Siendo: Fc = fuerza centrifuga m = masa de la clula a=v2r = aceleracin; si se trata de sedimentacin a gravedad unidad, a=g= 9,8 m/s2 = 980 cm/s2 v=et = velocidad lineal de la muestra en el tubo (cm/min) r = radio de giro, medido entre el punto medio del tubo de centrfuga y el eje de rotacin (cm) e = espacio lineal recorrido, si el movimiento fuese lineal (cm) t = tiempo de sedimentacin empleado al centrifugar (min) = ngulo recorrido en el movimiento de rotacin (radianes = ngulo cuyo arco es igual a r); =er =t = velocidad angular, pues el movimiento es de rotacin (rad/min = min1) n = velocidad de giro (revoluciones por segundo = rps, o revoluciones por minuto = rpm); =2 n Calculando la fuerza centrfuga relativa: FCR=FcFg=ag=39,48mn2rm980cms2=0,0403n2r cm1s2 Si separamos las unidades habituales (velocidad en rpm y radio en cm): n=(nrpm)rpm=(nrpm)1min=(nrpm)160s Tenemos: FCR=0,0403((nrpm)213600 s2)((rcm)cm)cm1s2=11,19106(nrpm)2(rcm) Que habitualmente se escribe como FCR=11,19106n2r o bien FCR=n2r89365 lo que presupone que n est en rpm y r en cm Como ejemplo, veamos un ejercicio resuelto: ; r=(rcm)cm

El n de g alcanzado en un rotor de centrfuga de 5 cm de radio, que gira a una velocidad de 10 000 rpm es: FCR=(10000)2589365=5600g Conviene saber manejar esta conversin. Clculo de FCR a partir de rpm, y viceversa, para distintos radios de giro del rotor.