INDICE

I. MANTENIMIENTO GENERAL DEL EQUIPO 3

II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 4

III. CALIBRACIÓN DEL SISTEMA

A. CALIBRACIÓN AUTOMÁTICA 5

B. CALIBRACIÓN MANUAL 8

IV. ANÁLISIS AUTOMÁTICO 12

A. DETECCIÓN DE CULTIVOS MIXTOS 21

V. PROCEDIMIENTOS DE TRABAJO 24

VI. MANTENIMIENTO DE LA TARJETA METÁLICA 26

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 2

I. MANTENIMIENTO GENERAL DEL EQUIPO
1. Encendido del ordenador.
Tras encender el ordenador nos aparecerá una ventana pidiéndonos el usuario (user
name) y la contraseña (password)
User name: tof-user
Password: bruker12

2. El espectrómetro de masas debe estar siempre encendido.

3. Hay que limpiar la junta de goma de la tapa todos los días. Simplemente pasar un dedo por la
superficie de la junta. Precaución: no realizar con guantes en la mano.

4. El cajón porta-tarjetas debe estar siempre dentro del equipo y sin poder abrir la tapa. En el
display del instrumento aparecerá iluminado el indicador verde “Target Access”).

El movimiento del cajón porta-tarjetas se controla con el botón “IN/OUT”.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 3

 II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1. Etanol al 70% en botella de cristal estéril, preparar medio litro o un litro utilizando una probeta.
Se utiliza para la limpieza de la tarjeta.
Un litro: 700ml de Etanol absoluto y 300ml de agua.
Medio litro: 350ml de Etanol absoluto y 150ml de agua.

2. Trifluoracético (TFA) al 80%. Preparar 1ml en un tubo eppendorf de 1.5 ml.

Añadir:
- 800 µl de trifluoracético (TFA)
- 200 µl de Agua HPLC. Nota: no utilizar agua destilada estéril.
Agitar en vortex
Preparar 1 tubo eppendorf. Se utiliza para limpiar la tarjeta.
Se conserva a temperatura ambiente durante un mes.

3. Ácido Fórmico al 70%. Preparar 1ml. en un tubo eppendorf de 1.5 ml.

Añadir:
- 700 µl de Ácido Fórmico (FA). Nota: manejar con cuidado en campana y utilizar
guantes debido a que es corrosivo.
- 300 µl de Agua HPLC. Nota: no utilizar agua destilada estéril.
Agitar en vortex
Preparar 1 tubo eppendorf. Se utiliza para la extracción con etanol/ácido fórmico.
Se conserva a temperatura ambiente durante un mes.

4. Solvente orgánico: 2.5% Tri-fluor-acético, 50% Acetonitrilo.

Preparar 1 ml de solvente orgánico (OS) en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
Añadir:
- 475 µl de Agua HPLC. Nota: no utilizar agua destilada estéril.
- 500 µl de Acetonitrilo. Nota: manejar con cuidado en campana y utilizar guantes
debido a que es corrosivo.
- 25 µl de Trifluoroacético (TFA). Nota: manejar con cuidado en campana y utilizar
guantes debido a que es corrosivo.
Agitar en vortex.
Preparar 1 tubo eppendorf de solvente orgánico. Se utiliza para reconstituir tanto la Matriz (HCCA)
como el patrón (BTS). Se conserva a temperatura ambiente durante una semana.

Nota: los viales de Matriz cuando llegan al laboratorio hay que conservarlos de 2 a 8ºC y los
viales del patrón BTS a -20 ºC.

5. Solución de MATRIZ (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) (tapón rojo).

Añadir a un tubo de MATRIZ liofilizada (tapón rojo) 250 µl de solvente orgánico (OS). Agitar bien
en vortex durante 2-3 minutos hasta su completa disolución. Comprobar que no haya precipitados
ni cristales. Si los hay, seguir agitando en vortex.

La solución reconstituida se conserva a temperatura ambiente durante una semana y en un

lugar oscuro. Proteger con papel de aluminio para protegerlo de la luz.

6. Solución Bruker Bacterial Test Standard (BTS) (tapón amarillo).

Añadir a un tubo de Bacterial Standard (tapón amarillo) 50 µl de solvente orgánico (OS) y pipetear
arriba y abajo 20 veces.
Incubar 5 minutos a temperatura ambiente con el tubo cerrado y volver a pipetear arriba y abajo
20 veces a temperatura ambiente. Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm a temperatura ambiente.

Realizar alícuotas de 10 µl y congelar a -18º C.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 4

 111. CALIBRACIÓN DEL SISTEMA

Sobre la calibración

Esta tarea se realizará cada vez que se reconstituya una nueva matriz. Su función es confirmar la
corrección de los parámetros del equipo, los cuales son una condición previa para obtener
espectros de calidad. Se utiliza un Patrón Estándar, el Bruker Bacteria! Test Standard (BTS), el
cual contiene una mezcla de proteínas conocidas.

Procedimiento de calibración

A. Calibración Automática

1. Añadir 1 1-11 de BTS a una posición de la tarjeta y dejar secar a temperatura ambiente.
Nota: una vez que se haya secad, no dejar más de 5 minutos sin añadir la matriz.

2. Añadir 1 1-11 de Matriz encima, sobre la misma posición encima de donde tenemos el BTS y
dejar secar a temperatura ambiente.

3. Introducir la tarjeta en el espectrómetro.

4. Si no está abierto el programa FlexControl, abrirlo haciendo doble click en el icono

del programa:

E -

.l
5. En el programa FlexControl, en la parte de abajo la izquierda, cada vez que metemos una
tarjeta comenzaran a aparecer diferentes mensajes.
a. The TOF device is being evacuated and has rough vacuum.
b. High voltage is still disable
c. High voltage is disabled
d. High voltage is ramping
e. Laser is standby
f. For Help, Press F1

6. En el programa FlexControl, en la parte de abajo a la derecha aparecen dos mensajes

(PALABRAS) en amarillo o en verde. El de la izquierda hace referencia al estado del
espectrómetro y el de la derecha hace referencia a la tarjeta.

El mensaje (PALABRA) de izquierda puede estar:

a. en amarillo con la palabra PREPARING (el equipo se está preparando)
b. en verde con la palabra (el equipo está preparado)

El mensaje (PALABRA) de la derecha puede estar:

a. En verde con la palabra • (cajón dentro) o con la palabra .
(cajón fuera)
b. En amarillo con la palabra DOCKING o INITIALIZING (el cajón está
saliendo o entrando).

Esperar a que en los mensajes de abajo a la derecha del programa FlexControl aparezca
Guía rápida MALDI Biotyper Pági na S
 PREPARING o - a la izquierda e • a la derecha y en la parte de abajo a
la izquierda del programa FlexControl aparezca Laser standby o for Help, Press F1.

Guía rápida MALDI Biotyper Pági na S

 7. La pantalla del FlexControl contiene una representación de la tarjeta. Cuando
introducimos una tarjeta en el espectrómetro, por defecto va a la posición A12, con lo cual,
debemos seleccionar la posición en la que hemos puesto la preparación con el
patrón (BTS). A continuación, el equipo se irá a la posición seleccionada y quedará
rodeada por un cuadrado azul.

(Ejemplo de posición en la que hemos colocado el BTS)

8. Pulsamos sobre el botón Calibrate y se realiza de forma automática la asignación de picos

del patrón de proteínas conocidas (BTS) y su evaluación (aceptación o rechazo de la
calibración), mostrando un mensaje sobre el resultado de la calibración.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 6

 9. Los parámetros por defecto de la calibración automática son los siguientes. Nota: estos
valores no deben cambiarse sin el consentimiento expreso del Servicio Técnico.

10. Quitar el sumatorio del buffer seleccionando el botón Display sum buffer.

11. Comprobar que los dos checks de la gráfica están seleccionados.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 7

 B. Calibración Manual

En el caso de tener problemas con la calibración automática podremos realizar el mismo

proceso de calibración de forma manual.

1. Realizar los pasos 1 al 7 de la Calibración Automática.

2. En la pestaña AutoXecute comprobar que está seleccionado el método adecuado

(MBT_AutoX) y si es así hacer click sobre el botón Run method on current spot

3. El programa FlexControl comenzará a disparar sobre la muestra y adquiere 240 espectros

de forma automática y muestra el correspondiente patrón de picos para el BTS.

4. Cambiar al sumatorio del buffer seleccionando una vez el botón Display sum buffer para
trabajar con los 240 espectros.

5. Quitar el single buffer seleccionando el botón Display single buffer para trabajar con los
240 espectros y no con los 40 últimos espectros.

6. Seleccionar suavizar el espectro en el sumatorio del buffer seleccionando una vez el botón
Smooth spectrum in sum buffer.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 8

 7. Ir a la pestaña de Calibración y comprobar que en Mass Control List el método
seleccionado es el correcto (MBT_Standard).

8. La correcta calibración de los picos se selecciona automáticamente utilizando el botón

Automatic Assign.

9. En la ventana aparecen los picos de referencia para la calibración y debemos comprobar

que en la columna Err/ppm, la desviación máxima no es superior a 300 ppm *, en al
menos 5 picos. En caso contrario, repetir el procedimiento de medición (pasos 7 a 9), para
volver a adquirir 240 espectros del BTS y continuar con la calibración (pasos 10 en
adelante).

En el caso de que la desviación de alguno de los picos sea superior a 300 ppm debemos
seleccionarlo en la tabla y eliminarlo haciendo un click con el botón derecho del ratón.

En el caso de que en alguno de los picos no aparezca el Err/ppm podemos intentar

seleccionarlo manualmente como se indica en paso 19.

10. Si la desviación máxima no es superior a 300 ppm en al menos 5 picos, pulsar en el botón

Apply y a continuación seleccionar el botón Save method as situado en la

parte de arriba a la izquierda.

Guía rá pi da MALDI Bi otyper Pá gi na 9

 11. Aparece la siguiente ventana donde debemos guardar los nuevos valores de calibración.
Seleccionar el método MBT_FC.par y seleccionar el botón Save (Guardar).

12. Confirmar el reemplazo del archivo (MBT_FC.par) seleccionando "Yes" (Sí).

13. Si la asignación automática de todos o de alguno de los picos no funciona, los picos se
pueden seleccionar manualmente. En este caso, los picos deben ser marcados y
confirmados.

En la tabla de picos pulsamos sobre el

primero de ellos.

En la gráfica superior aparecerá una

línea marcando el pico teórico
correspondiente.

Con el ratón posicionarse en el lado

izquierdo del pico que está señalado y
hacer “click” con el botón izquierdo. La
línea, inicialmente roja, pasa a color
verde en el caso de que se pueda
seleccionar.

Proceder del mismo modo con el resto

de picos no asignados de la lista.

Seguir instrucciones del paso 9 en

adelante sobre aplicación de cambios.

14. Quitar el sumatorio del buffer seleccionando el botón Display sum buffer.

Guía rápida MA LDI Página

Biotyper 10
 15. Comprobar que los dos checks de la gráfica están seleccionados.

16. Volver a dejar el programa FlexControl en la pestaña AutoXecute.

Espectro de masas del BTS utilizando la matriz HCCA.

Listado de masas esperadas del BTS y su desviació

Guía rápida MA LDI Página

Biotyper 11
 IV. ANÁLISIS AUTOMÁTICO
Comprobar si el programa FlexControl se está ejecutando. Para comprobarlo, ver la barra de
herramientas y comprobar si está minimizado. Si no se está ejecutando abrir el programa
haciendo doble click en el icono del escritorio:

Una vez que tenemos las muestras preparadas en la tarjeta para su análisis, pulsar el botón
IN/OUT del espectrómetro. En el equipo microflex se encenderá una luz naranja indicando tarjeta
en progreso (TARGET: IN PROGRESS).

Esperar hasta que en el equipo microflex aparezca una luz verde indicando TARGET: ACCESS.
Abrir la tapa e introducir la tarjeta. Comprobar que la tarjeta está correctamente insertada y no
está inclinada.

Pulsar el botón IN/OUT para desplazar la tarjeta hasta su posición dentro del espectrómetro para
la realización de su análisis. En el equipo microflex se encenderá una luz naranja indicando tarjeta
en progreso (TARGET: IN PROGRESS).
Esperar hasta que en el equipo microflex aparezca una luz verde indicando TARGET: ACCESS

Hacer doble click en el icono de la aplicación MALDI Biotyper Automation Control para abrirla.

Aparece la siguiente ventana inicial.

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A 00000000000
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E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -
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H O O O O O O O O O O O O zo;•oectrum.oo<c•l
,;"' '

8 (!] Hide ldentified 1 Validation: set verified •

10 Name Position Chip Oetected Species Seo<o Convnonl

Connecting to flexControl successful Server: localhost Port:8080

Guía rápida MA LDI Página

Biotyper 12
Para crear un nuevo proyecto, seleccionar el icono de nueva identificación. (Archivo -> Nueva
identificación)

Aparece la siguiente ventana donde tenemos que seleccionar el botón Nuevo para crear un nuevo
proyecto.
Tras pulsar en Nuevo se abrirá una nueva ventana ponemos el nombre del proyecto: es
importante mantener el siguiente formato, añomesdia-nombredelproyecto-nombre
(AAAAMMDD-nombredelproyecto). Pulsamos sobre el botón OK.

Una vez se ha completado el nombre del proyecto, seleccionamos el botón Siguiente.

Se abre una ventana donde vemos una representación de la tarjeta donde debemos seleccionar
en la imagen de la tarjeta la posición de la primera muestra de la tarjeta con el botón izquierdo del
ratón de tal forma que quedará rodeada por un cuadrado azul.

Con el puntero del ratón sobre la posición de la primera muestra de la tarjeta, hacer click con el
botón derecho del ratón y seleccionar Sequential Insert Mode con el botón izquierdo del ratón.
Al seleccionar Sequential Insert Mode, podemos introducir el número de muestra situado en la
primera posición en el campo ID.

Tras introducir el número de muestra, si pulsamos la tecla enter del teclado aparece la siguiente
línea, con la siguiente posición para poder introducir el siguiente número de muestra.

Añadir los números de muestra de forma secuencial. Después de introducir los números de
muestra del proyecto podemos seleccionar Siguiente o Finalizar.
NOTA: Antes de seleccionar Finalizar, comprobar que tenemos la placa preparada con las
muestras y la matriz evaporada dentro del espectrómetro y que en el espectrómetro Microflex
aparezca una luz verde indicando TARGET: ACCESS.

Si dejamos la última posición en blanco (sin número de muestra) debido a que le hemos dado a la
tecla enter, al seleccionar Siguiente o Finalizar nos preguntará si queremos eliminar las
posiciones en blanco (sin número de muestra). Seleccionamos Sí.

En el caso de haber seleccionado Finalizar, comprobando previamente que la placa está lista
para ser leída, el sistema comenzará el análisis de las muestras.

Si seleccionamos Siguiente, aparecerá una nueva ventana con información de la base de datos
que se utilizará. Por defecto emplearemos las opciones que aparecen marcadas en la siguiente
imagen y pulsaremos sobre el botón Siguiente.
La siguiente ventana de resumen, deberemos comprobar que tenemos la placa preparada con
las muestras y la matriz ya evaporada dentro del espectrómetro. En el caso de que la placa
no esté dentro del espectrómetro, introducirla y esperar a que en el espectrómetro Microflex
aparezca una luz verde indicando TARGET: ACCESS.

Si la placa preparada está dentro, seleccionar Finalizar para que comience el análisis e
identificación de forma automática.

En el espectrómetro se encenderá una luz en SYSTEM: AUTOMODE. El análisis y la

identificación comenzarán de forma automática.
Aparece la siguiente ventana donde podemos ir viendo tanto el análisis de las muestras como su
identificación a tiempo real.

En esta ventana podemos ver que todas las muestras han sido analizadas.
En esta otra ventana podemos ver que ya ha identificado la primera de las muestras, en este caso
el BTS.

Podemos ver los resultados y sus detalles mientras sigue analizando o identificando las muestras.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 20

Finalmente, en esta ventana vemos todos los resultados de las muestras ya analizadas e
identificadas.

Para ver e imprimir el informe de resultados seleccionamos el botón View y pulsamos sobre
Results.

Una vez que hemos visto todos los resultados y/o los hemos impreso, pulsar el botón IN/OUT. En
el equipo microflex se encenderá una luz naranja indicando tarjeta en progreso (TARGET: IN
PROGRESS).

Esperar hasta que en el equipo microflex aparezca una luz verde indicando TARGET: ACCESS.

Abrir la tapa y sacar la tarjeta. Volver a cerrar la tapa y pulsar el botón IN/OUT para desplazar el
cajón hasta su posición dentro del equipo microflex para que se quede realizando el vacío en las
correctas condiciones para el siguiente análisis.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 21

A. DETECCION DE CULTIVOS MIXTOS POTENCIALES

Cuando creamos un proyecto, al llegar a la ventana de selección de métodos (Ver página 17),
podemos seleccionar en la opción MSP Identification Method una de las dos opciones:

MALDI Biotyper MSP Identification Standard Method (Método habitual)

MALDI Biotyper MSP Identification Mixture Method (Método de identificación de cultivos mixtos
potenciales)

Nota: siempre el último método seleccionado es el que se quedará para el siguiente proyecto que
vayamos a realizar. Si queremos cambiar el método lo deberemos hacer en esta misma ventana.

Cuando tenemos seleccionada la opción MALDI Biotyper MSP Identification Mixture Method, en el
caso de que se detecte un cultivo mixto potencial aparecerá en la tabla de resultados el siguiente

símbolo .

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 22

En el detalle de los 10 mejores resultados aparecerá el símbolo indicando cultivo puro o el
símbolo indicando cultivo potencialmente mixto.

En el informe de resultados aparece el símbolo .

En el detalle de los 10 mejores resultados aparecerán las dos especies encontradas.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 23

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 24
 V. PROCEDIMIENTOS DE TRABAJO

Flujo de trabajo con IVD MALDI Biotyper

Cultivo de
la muestra microbiana

Placa MALDI limpia Método de transferencia

directa para preparación
de muestras
Preparación matriz

El IVD MALDI
Instrumento operativo Biotyper para
identificación

Identificación Si
probable? Fin

No

Placa MALDI limpia Método de extracción etanol/ ácido

fórmico para preparación de
Preparación matriz muestras

El IVD MALDI
Instrumento operativo Biotyper para
identificación

Si
Identificación
Fin
probable?

No

Analizar la muestra con un método diferente.

Guía rá pida MALDI Biotyper Pá gina 25

1. Transferencia directa

Transferir la colonia al correspondiente punto (círculo) de la tarjeta de metal realizando una fina
extensión con una punta de pipeta de 200 µl. Se necesita muy poco material (es mejor usar poco
material que demasiado). Con un poco de material visible es suficiente para realizar la medición.

Añadir 1 µl de la solución de matriz y dejar secar.

Consejos:
Al principio realizar este método por duplicado de la siguientes formas:
A) Picar en el primer punto y después en el siguiente. Extender en el primero y extender en el segundo. En el
segundo habrá menos material.
B) Picar y extender en el primer punto y seguidamente picar y extender en el segundo punto. En el segundo habrá
menos material.

Mantener tapado el tubo de la matriz mientras la vamos dispensando para evitar su evaporación y la formación de
cristales.
Si vamos a realizar varias filas, cuando hayamos realizado la extensión de una fila, añadir la matriz y cerrar el tubo de la
matriz mientras extendemos la segunda fila para evitar la evaporación de la matriz.

2. Extracción con Etanol/Ácido Fórmico

1. Poner en un tubo eppendorf 300 µl de agua grado HPLC.

2. Utilizar un asa de siembra de 1 µl y pasarla por el cultivo hasta tapar la luz del asa por
ambos lados (proceder primero en un sentido y luego en el contrario).
3. Resuspender el asa con la muestra en el tubo con agua.
4. Repetir los pasos 2 y 3.
5. Agitar en vortex hasta tener una suspensión homogénea.
6. Añadir 900 µl de Etanol absoluto
7. Agitar en vortex hasta tener una suspensión homogénea.
8. Centrifugar 1-2 minutos a máxima velocidad (13000 rpm)

Del sedimento obtenido se calculará la cantidad necesaria de Ácido Fórmico (rango de

variación entre 1 microlitros y 100 microlitros). Para la cantidad de muestra obtenida según
los puntos 2 a 4 se emplearán 25 microlitros.

9. Decantar el sobrenadante volcando el tubo eppendorf para quedarnos con el pellet.

10. Centrifugar 1 minuto a máxima velocidad (13000) para eliminar restos de etanol.
11. Quitar el sobrenadante (resto de etanol) con la pipeta de 200 µl. (IMPORTANTE)
12. Repetir pasos 10 y 11 si es necesario.
13. En caso necesario, dejar el tapón con el tubo abierto un mínimo de 15 minutos para que se
seque completamente el sedimento.
14. Añadir 25 µl de Ácido fórmico al 70%. Resuspender el sedimento con una pipeta hasta
completa disolución (IMPORTANTE) y después agitando en vortex.
15. Añadir 25 µl de Acetonitrolo (AN). NOTA: poner siempre el mismo volumen de Ácido
Fórmico y Acetonitrilo por muestra.
16. Centrifugar 1 minuto a máxima velocidad (13000 rpm).
17. Transferir 1 µl del sobrenadante al punto de la tarjeta de metal.
18. Dejar secar.
19. Añadir 1 µl de la solución de Matriz.
20. Dejar secar.
21. Realizar la lectura.
 VI. MANTENIMIENTO DE LA TARJETA
METÁLICA
1. Cubrir la tarjeta metálica con etanol al 70%. Se prepara 1 litro o 1h litro en una
botella de cristal a partir de etanol absoluto y agua. Utilizar una probeta.

2. Dejar incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

3. Limpiar la tarjeta metálica frotando con un papel bajo el grifo.

4. Cubrir la tarjeta metálica con etanol al 70%.

5. Dejar incubar 5 minutos a temperatura ambiente.

6. Limpiar la tarjeta metálica frotando con un papel bajo el grifo y secar la tarjeta.

7. Dispensar 100 !JI de Trifluoracético al 80% (TFA) en la tarjeta de metal y frotar

con un papel por toda la superficie de forma intensa para limpiar la tarjeta.
Realizar esta operación con guantes, bajo papeles de filtro y no tocar el TFA ni el
papel impregnado con TFA.

8. Dejar secar la tarjeta metálica al menos 15 minutos a temperatura ambiente.