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MÉTODOS SIMPLES

IDENTIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS:
MÉTODOS SIMPLES

PNT-MYCO-09

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio
Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha
Dra. Elena Urra 26/02/2004 Dr. Jorge Barrón 26/02/2004

EDICIÓN FECHA MODIFICACIONES

00 26/02/2004

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital de

Cruces (Barakaldo). La información en él contenida, no podrá reproducirse ni
total ni parcialmente sin la autorización del Jefe del Servicio.

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN

2. DOCUMENTOS DE CONSULTA

3. MUESTRAS

4. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

5. APARATOS Y MATERIAL

6. PROCEDIMIENTO

7. RESULTADOS

8. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

9. CONTROL DE CALIDAD

10. BIBLIOGRAFÍA

11. FORMULARIOS Y ANEXOS

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1. INTRODUCCIÓN
Las micobacterias deben identificarse hasta el nivel de especie siempre que
sea posible. Los métodos bacteriológicos simples comprenden una serie de
observaciones fáciles de realizar y que permiten clasificar la micobacteria
aislada como de rápido o lento crecimiento, y como foto, escoto o no
cromógeno.
Esta clasificación inicial, según la velocidad de crecimiento y la pigmentación,
es muy útil para una identificación posterior (diagramas 1 y 2).

2. DOCUMENTOS DE CONSULTA

 MT-MEDI: Manual de medios de cultivo y reactivos

 MT-MYCO: Manual de micobacterias
 PNT-MYCO-03: Tinciones para micobacterias
 PNT-MYCO-08: Procesamiento de los cultivos positivos

3. MUESTRAS
Un aislamiento puro en medio sólido.

4. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Medios de cultivo

 Medio de Lowenstein-Jensen (L-J)

Reactivos

 Reactivos para Tinción de Ziehl-Neelsen: consultar el Manual de medios de

cultivo y reactivos (MT-MEDI)

5. APARATOS Y MATERIAL
Aparatos

 Cabina de seguridad biológica

 Estufa 37ªC
 Microscopio de luz

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 Lámpara de 60 watios
 Estufas de atmósfera aerobia a 22 y 30ºC

Material

 Portaobjetos
 Guantes y mascarilla

6. PROCEDIMIENTO

Morfología y tinción de las micobacterias

 Teñir la colonia con tinción de Ziehl-Neelsen según PNT-MYCO-03 (no

auramina), para asegurarse de que no existe contaminación.
 M. tuberculosis: la forma típica es un bacilo teñido uniformemente y recto o
ligeramente curvado. Se presentan aislados o en pequeñas agrupaciones.
 En el caso de bacilos con morfología un poco distinta, se pueden tratar de
micobacterias no tuberculosas, o de una tuberculosis ya tratada.
 M. kansasii: suelen ser más largos, anchos y arrosariados.
 M. avium: suelen ser pequeños, en forma de coco.
 Anotar la morfología en la Hoja de trabajo.

Morfología de la colonia

 Se puede observar en el medio de L-J primario o de un subcultivo del medio

MGIT original a L-J.
 Observar si existe crecimiento de más de un tipo de colonia en el L-J:
rugosa, lisa, transparente, opaca, etc.
 La morfología de las especies más frecuentes es:
a. M. tuberculosis: rugosas, semejantes a migas de pan; no se adhieren al
medio.
M. bovis: pequeñas, lisas, pálidas, húmedas; se adhieren al medio.
M. bovis BCG: rugosas
M. avium: lisas, cremosas, pálidas
b. M. kansasii: lisas con tendencia a la rugosidad
c. M. fortuitum: colonias lisas o granulares
M. chelonae: colonias lisas con tendencia a la rugosidad

 Anotar la morfología en la Hoja de trabajo.

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Formación de cordones

 Para observar esta característica, se debe realizar una tinción de Ziehl-

Neelsen (PNT-MYCO-03) del medio MGIT original.
 La formación de cordones consiste en que los bacilos de M. tuberculosis
forman una especie de cordones, de longitud y espesor variable,
compuestos por microorganismos dispuestos unos junto a otros y unidos
por sus extremos en paralelo.
 La mayoría de las micobacterias no tuberculosas no presentan esta
característica, aunque hay algunas excepciones: M. kansasii forma
cordones, aunque no tan compactos y con BAAR arrosariados.
 Anotar la formación o no de cordones en la Hoja de trabajo.

Pigmentación de las colonias

Atendiendo a la pigmentación, se distinguen tres grandes grupos de

micobacterias:

a. Fotocromógenas: tras exposición a la luz y posterior incubación, adquieren

una pigmentación amarillo-naranja (M. kansasii y M. marinum)
- Exponer el cultivo en pleno crecimiento a la luz de una lámpara de 60 W
durante 60 minutos, a una distancia de 50 cm, y volver a incubarlo de
nuevo a 37ºC en aerobiosis durante 24-48 horas. Si el cultivo adquiere
pigmentación, es una fotoinducción positiva, y por tanto, una
micobacteria fotocromógena.
- La micobacteria fotocromógena más frecuente es M. kansasii.

b. Escotocromógenas: micobacterias que se pigmentan en la oscuridad, sin

necesidad de fotoinducción.
- Esto se comprueba envolviendo el tubo de cultivo en papel de aluminio
mientras se incuba, evitando la llegada de la luz.
- Las micobacterias escotocromógenas más frecuentes son: M.
scrofulaceum, M. gordonae, M. szulgai, M. flavescens, M. xenopi, M.
avium complex (algunas cepas).

c. No cromógenas: no producen pigmento. Las más frecuentes son: M.

tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. avium complex, M. xenopi, M.
fortuitum, M. abscessus, M. chelonae

 Anotar el tipo de pigmentación en la Hoja de trabajo.

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Velocidad de crecimiento

Se refiere al número de días necesarios para el crecimiento de la micobacteria

en subcultivo en medio sólido. Según la velocidad de crecimiento, se clasifican
en dos grupos:

a. Crecimiento rápido: crecimiento en 7 días o menos: M. fortuitum, M.

abscessus, M. chelonae, M. peregrinum, M. smegmatis, M. phei, M.
flavescens (tiempo de crecimiento intermedio), M. thermoresistibile

b. Crecimiento lento: crecimiento en más de 7 días: M. tuberculosis, M.

kansasii, M. avium, M. marinum, M. scrofulaceum, etc.

 Anotar el resultado en la Hoja de trabajo.

Temperatura óptima de crecimiento

 La mayoría de las cepas crecen bien a 37ºC, pero hay algunas que pueden
hacerlo a otra temperatura, lo que puede orientar en su diferenciación:

- A 30º C crecen: M. kansasii, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. fortuitum,

M. chelonae, M. marinum, M. ulcerans, M. haemophilum
- A 40º C crecen: M. scrofulaceum, M. gastri, M. terrae, M. xenopi, pero no
crece M. gordonae
- A 52ºC crece M. thermoresistibile
 Anotar el resultado en la Hoja de trabajo

7. RESULTADOS

Interpretación

Según las pruebas anteriores, las micobacterias más frecuentes se agrupan en:

1. Micobacterias de crecimiento lento:

- Fotocromógenas: M. kansasii
M. marinum (lento/rápido)
M. szulgai (a 28ºC)
- Escotocromógenas: M. gordonae
M. scrofulaceum
M. xenopi
M. szulgai (a 37ºC)
M. flavescens (lento/rápido)

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- No cromógenas: M. avium
M. intracellulare
M. tuberculosis
M. haemophilum
M. bovis
M. terrae
M. gastri

2. Micobacterias de crecimiento rápido:

- Fotocromógenas: M. marinum (rápido/lento)

- Escotocromógenas: M. thermoresistibile y otras micobacterias saprofitas
- No cromógenas: M. fortuitum
M. chelonae
M. abscessus
M. smegmatis
M. peregrinum
M. mucogenicum

Informe de resultados

 No se informará de la especie de micobacteria hasta realizar pruebas

definitivas de identificación (bioquímicas o sondas de DNA) según los
diagramas 1 y 2. Se informará de la siguiente forma:

1. Micobacteria de crecimiento lento no cromógena:

Cultivo: Positivo (P)
Microorganismo: Bacilos ácido-alcohol resistentes, pendientes de
identificación (BKPI)
- Validar provisionalmente e imprimir.

2. Micobacteria de crecimiento lento fotocromógena:

Cultivo: Positivo (P)
Microorganismo: Bacilos ácido-alcohol resistentes, pendientes de
identificación (BKPI)
- Si por el resultado de las pruebas anteriores se sospecha M. kansasii
pero aún no se ha realizado la identificación definitiva, se añade un
Comentario al cultivo:
Comentario: Probable M. kansasii, pendiente de identificación definitiva.

3. Otras micobacterias:
Cultivo: Positivo (P)
Microorganismo: Bacilos ácido-alcohol resistentes, pendientes de
identificación (BKPI)
Comentario: especie de micobacteria diferente a M. tuberculosis

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8. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

 Los métodos bacteriológicos simples sólo sirven para agrupar las

micobacterias y orientar hacia las pruebas a utilizar para la identificación de
especie.
 Para realizar la identificación de la especie se deben seguir las
instrucciones de los diagramas 1 y 2.
 Las micobacterias diferentes a M. tuberculosis, M. kansasii y M. avium, que
no se pueden identificar mediante pruebas bioquímicas o sondas de DNA,
se deben enviar al Centro de Referencia para la identificación (ver Manual
de Micobacterias).

9. CONTROL DE CALIDAD

No procede

10. BIBLIOGRAFÍA

1. Casal M. Tipificación de las micobacterias: técnicas de primera elección. En:

Casal M., editor. Microbiología clínica de las enfermedades por
micobacterias. Córdoba, 1990. p. 83-103.

11. FORMULARIOS Y ANEXOS

No procede

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Diagrama 1: Clave para micobacterias de crecimiento rápido

Cultivo primario o subcultivo en L-J a 35ºC

(<7 días)

Crecimiento rápido

No cromógenas Fotocromógenas Escotocromógenas

(posibles patógenos) (posible patógeno) (No patógenas)

M. fortuitum M. marinum
M. chelonae
M. abscessus
M. smegmatis
M. peregrinum
M. mucogenicum

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Diagrama 2: Clave para micobacterias de crecimiento lento

Cultivo primario o subcultivo en L-J a 35ºC

(>7 días)

Sin pigmentación Escotocromógenas

M. gordonae
M. scrofulaceum
M. xenopi
M. szulgai (a 37ºC)
Exponer a la luz (Fotoinducción) M. flavescens

Fotocromógenas (pigm amarillo) No cromógenas (sin pigmento)

Sonda de M. kansasii
Colonias rugosas, secas Colonias pequeñas, lisas

+ -
M. kansasii Otras Sondas de DNA para
Niacina M. avium

+ - + -
M. tuberculosis Otras M. avium Otras

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