Métodos de preservación de

espermatozoides. Refrigeración

MVZ FERNANDO BENAVIDES MANRIQUE

TERIOGENOLOGIA 2022
 • MENOR ESTRÉS EN ANIMALES
TRANSPORTE • PERMITIR EL USO DE DONADORAS DE DIFERENTES
LUGARES PARA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
DE SEMEN • DIFUSION DE MATERIAL GENETICO
• EVITAR TRANSMISION DE ENFERMEDADES
DESVENTAJAS DEL SEMEN
CONSERVADO

• LOGISTICA Y COSTO DE TRANSPORTE

• ANIMALES SUB FERTILES NO RESISTEN
• PROCESAMIENTO INADECUADO DEL
SEMEN
DILUTORES PARA CRIOPRESERVACION
Los dilutores poseen compuestos preservantes y criopreservantes.

Cada compuesto tiene diferentes roles.

Funciones:

a) Aportan nutrimentos como fuente de energia

b) Protegen contra el efecto nocivo del enfriamiento rapido

c) Impiden cambios perjudiciales en el pH al formarse Ac. Lactico

d) Mantienen la presion osmotica apropiada y balance electrolitico

adecuado

e) Inhiben la proliferaciòn bacteriana

f) Incrementan el volumen del semen

CARACTERISTICAS DE UN DILUTOR

Un dilutor emplea:
• Fuente de energía: azucares
• Buffer para mantener pH: Tris, citrato de Na, bicarbonato de sodio.
• Fuente de lipoproteina: yema de huevo, leche, protegen del enfriamiento.
• Crioprotector: glicerol

OJO: Existe una proporción entre semen y diluyente que guardan un

equilibrio para la viabilidad celular. Pero la composición del semen muchas
veces varía. Opción: centrifugar el semen, retirar el sobrenadante y agregar
el dilutor.
Los compuestos mas comunes que se combinan en un dilutor son los siguientes:

Fructosa, Glucosa y Manosa: Se usan como fuente de energía

Leche de vaca UHT descremada: Protege contra el choque térmico del

enfriamiento hasta los 5 °C. También nutren los espermatozoides.

La Yema de huevo:
Esta presente en casi todos los diluyentes.
Contiene fosfolípidos, lecitina y cefalina – Para el choque térmico
La lecitina – Impide el flujo y acumulación de Ca2+ intracelular lo cual protege el
gasto de energía
Previenen el daño peroxidativo e integridad de la membrana.
Tiene la capacidad de mantener el pH neutro. Nutren a la célula.

El pH tiende a acidificarse por lo que se usan compuestos para mantener el pH

neutro: Bicarbonato de Na, TRIS, Citrato de Na.
TRIS: Hidroximetil – aminometano

• Capta el hidrogeno de los ácidos y forma soluciones acuosas, regulando el ph y la

osmolaridad.

• Se usa en combinacion con el ac. Citrico para mantener el pH neutro.

• Muy inocuo. Neutraliza el ac. Lactico.

• Otros agentes amortiguadores: Tricien, TES, MES, HEPES

Agentes crioprotectores propiamente tal:

Sustancias ricas en solutos.

Disminuyen el punto EUTECTICO del semen diluido. Es decir, que para que se
congele la solución requiere menor temperatura y darà tiempo para que se
deshidraten las celulas y no se dañen por los cristales de hielo o por el efecto
mecánico de la salida de agua desde el interior de la célula.
Los crioprotectores se clasifican en si penetran o no a la celula:

Penetrantes:
Glicerol, Dimetilsulfoxido (DMSO), Etilenglicol (EG) y 1,2-Propanodiol.
La permeabilidad no es tan alta como la del agua.
Ingresan a la célula, se mesclan con el agua y vuelven la célula mas
concentrada; evitando que la deshidratación sea muy grande, ni formen
cristales de hielo intracelular.

Glicerol: El mas conocido. Además de lo ya mencionado, tiene efecto toxico en

la membrana plasmática y necesita ser eliminado rápidamente post
descongelación.

No penetrantes:
Sacarosa, Glucosa, Lactosa, Rafinosa, Dextrosa, Polietilen-glicol, Polivinil-
pirrolidona.
Producen una rapida deshidratacion celular. Suelen ser usados en combinacion
con los penetrantes.
ACCIÓN DE LOS CRIOPROTECTORES PENETRANTES

Criopreservante penetrante

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.. . .

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.. .. . .
Antibacterianos: Penicilina, Estreptomicina, Polimixina B y combinaciones

Entre las lesiones espermáticas producidas por congelación, las más

recurrentes son: alteraciones de la membrana plasmática, daño a nivel
mitocondrial, deterioro en la integridad del ADN, aumento en la producción
de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y alteraciones del citoesqueleto,
produciendo efectos negativos en la viabilidad y motilidad espermática,
funciones espermaticas esenciales para la fecundación.
REFRIGERACIÓN DE
SEMEN
REFRIGERACION

Mas usado en equinos, porcinos y caninos

Usan diluyentes similares a los de congelación pero sin el crioprotector.

Menor tasa metabólica de los espermatozoides, permitiendo extender su

supervivencia por periodos cortos.

En caninos y equinos se mantienen a 4°C. En cerdos a 15°C.

Conclusiones:

El potencial fecundante de los espermatozoides expuestos a bajas

temperaturas, depende fundamentalmente de la resistencia de la membrana
plasmática.

Los diluyentes seminales tienen como principal función la protección de la

integridad y funcionalidad de la membrana plasmática.

Los diluyentes proveen de sustratos energéticos y permiten la mantención de

condiciones estables de pH y osmolaridad en el medio extracelular
PRINCIPIOS DE LA REFRIGERACION DE SEMEN
SEMEN T° AMBIENTE SEMEN REFRIGERADO

METAB + BACT = ROS REDUCCIÓN DE METAB

BAJA PH + PEROX LIPID BAJA POCO PH Y PEROX LIPID

DAÑO CELULAR AUMENTA LONGEVIDAD

POR CADA 10 GRADOS MENOS DE TEMPERATURA EL METABOLISMO CELULAR SE REDUCE EN UN 50%

PRINCIPIOS DE LA • ADITIVOS PARA AUMENTAR LA FLUIDEZ DE MEMBRANA
REFRIGERACION • DISMINUCIÓN LENTA DE T° - FASE CRÍTICA (EQUINOS 8 A 15°C)
• TRANSICIÓN DE MEMBRANA FLUIDA A GEL
DE SEMEN
REFRIGERACION DE
SEMEN EN CANINOS
 PROCEDIMIENTO
• Únicamente fracción espermática.
• Evaluación espermática
• Entre semen y diluyente → 1:3 o 1:4.
• A 4 °C o 15°C
• Tasas de preñez aceptables → 24-48 h.
• Lentamente temperatura ambiente
• Longevidad mayor a 4º C que a 22º C., a pesar de
esto no se observaron diferencias significativas
cuando se conservó a 4º C o 15º C.
• Diluyentes:
- Los trisacáridos han sido (Tris-Base (TB)) →
estabilizar las membranas mediante el
efecto tampon.

• La yema de huevo es el componente más

efectivo para proteger al espermatozoide
del shock de frío.
• Leche descremada UHT
• Las mejores tasas de preñez obtenidas con
diluyentes realizados con tris/yema de
huevo (62,5 %) y yema de huevo/crema
(51,1 %) (25). (A. Stornelli, 2001)
• Diluyente en base a yema de huevo (EYT):
- TRIS (3.025 g)
- ácido cítrico (1.7 g)
- glucosa (1.25 g)
- Penicilina benzatínica (100 mg),
- Sulfato de estreptomicina (100 mg)
- Yema de huevo (20%)
- Agua destilada (100 ml).
• Base de leche descremada (LD):
- leche descremada fluida UHT (0.5%
materia grasa)
- Sulfato de estreptomicina (50
mg/100ml)
- Penicilina benzatínica (50 mg/100ml).

El pH y la osmolaridad fueron de 6.8 y 272

mOsm/kg, respectivamente. Se preparó el
día de la recolección de semen y fue
entibiado a 37 ºC antes del uso.
 “El empleo de leche descremada fluida UHT (0.5%
materia grasa), sin incorporación de sustancias buffer y
azúcar, como diluyente para la conservación de semen
canino a 4 ºC, proporciona resultados de motilidad
progresiva e integridad de membrana espermática que
permitirían su utilización en inseminación artificial
hasta por 96 horas de refrigeración, restando aún la
realización de estudios de fertilidad real para semen
canino conservado bajo estas condiciones.” (ev.
investig. vet. Perú v.17 n.1 Lima ene./jun. 2006)
• La refrigeración del semen condiciona una menor tasa
metabólica de los espermatozoides.
- Semen utilizado a 05 días de refrigeración:
• La tasa de preñez: 50-60% (W. Edward, 1992)
• La tasa de parición: 45.1% (Forsberg, 2000)
• Tamaño de camada: 5.8 +/-3 (Forsberg, 2000)
VENTAJAS
• Bajo costo
• Mínima disposición de material y equipos
• Practicidad
• Transportación
• Dosificación

DESVENTAJAS
• Menor tiempo viable en utero y
vagina
Transportador semen refrigerado
REFRIGERACION
• CANI PLUS CHILL 10: MANTIENE SEMEN REFRIGERADO HASTA POR 10
DIAS
• 1ML DE SEMEN + 1 ML DILUTOR: MINIMO
• TODO A 37°C
• PONER EN AGUA A 37°C Y LLEVAR A LA REFRIGERADORA EN BAÑO
MARIA
• A LAS 2 HORAS LLEVAR A BOTUFLEX O MANTENER EN REFRI A 5°C
• BOTUFLEX HASTA 40HRS A 5°C
• DOSIS 150 MILLONES DE ESP MOT/DOSIS – IA IV O IU
REFRIGERACION
• EL DILUTOR SE AGREGA AL SEMEN Y NO AL REVEZ: MUY DESPACIO
POR LA PARED DEL TUBO GOTA A GOTA
• POST REFRIGERACION DEBE TENER MAS DEL 60% DE MOTILIDAD
• DESREFRIGERAR A 37°C O INSEMINAR DIRECTAMENTE EN HEMBRA
• REVISAR CONCENTRACIÓN, VIGOR, MOTILIDAD Y HOST DESPUES DE
REFRIGERAR
REFRIGERACION DE
SEMEN EN EQUINOS
EQUINOS
• ANIMALES SENSIBLES A LA PRESERVACIÓN
• ATLETAS
• BAJA CALIDAD DE SEMEN
• SE USAN ANIMALES JOVENES, VIEJOS Y CON BAJA FERTILIDAD
• ANIMALES SE REPRODUCEN ASI TENGAN DEFECTOS REPRODUCTIVOS
HEREDABLES (PERMITE CRIPTORQUIDEO EN ¼ DE MILLA Y PSC)
• LA PRESERVACION ES PRINCIPALMENTE POR SEMEN REFRIGERADO
• SEMEN REFRIGERADO DURA 12 HRS
• DIFICIL SINCRONIZAR POR CELO LARGO
 TASA DE
DILUCIÓN DE
SEMEN
REFRIGERADO
EQUINO

SEMEN FRESCO
NORMALMENTE: 80 A 200
MILL/ML

DILUCION PARA REFRIGERACION

25 A 50 MILL/ML

DILUTORES DEBEN PROTEGER

MAS LA MEMBRANA QUE OTRAS
ESPECIES
REFRIGERACION DE SEMEN DE EQUINOS
• REMOVER GEL CON FILTRO DE NYLON
• DILUYENTE MEJOR SI TIENEN TAURINA Y GLICINA
• PROTEINAS PLASMATICAS REMUEVEN COLESTEROL: CAPACITACION
PRECOZ Y DESORGANIZA LÍPIDOS DE MEMBRANA
• CASEINA SE LIGAN A PROTEINAS QUE DESORGANIZAN LA
MEMBRANA
• DILUTORES DEBEN TENER COLESTEROL Y CASEINA
MANJUNATH, 2012
COMPOSICION BASICA DE LOS DILUYENYES
DE SEMEN EQUINO
• LECHE: FUENTE DE FOSFOLÍPIDOS Y LACTOSA: ESTABILIZA
MEMBRANA Y ENERGIA
• CASEINA
• COLESTEROL
• AZUCARES: GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA
• AMINOACIDOS: GLICINA Y TAURINA: ANTIOXIDANTES Y
CRIOPROTECTORES
• ANTIBIOTICOS: AMIKACINA CON GENTAMICINA, PENICILINA
• AGUA DESTILADA
MANEJO DE LA DILUCION DE SEMEN EQUINO
• AGREGAR DILUYENTE EN BASE A LECHE DE INMEDIATO
• MANTENER A 25 - 30°C
• DILUYENTE PREPARADO DURA MAXIMO 3 DIAS
• CONSIDERAR QUE LA DOSIS TOTAL ES DE 1000 MILLONES DE
ESPERMATOZOIDES PARA QUE HAYAN 500 MILLONES MOTILES (DOSIS
INSEMINANTE)
• DILUIR 20 A 50 MILL/ML
• MÍNIMA DILUCION (2:1, IDEAL 3:1)
• POCAS BURBUJAS
• MANTENER ENTRE 5 – 15 °C EN REFRIGERACION
• CALENTAR UNA PEQUEÑA FRACCIÓN POR 3 A 5 MIN A 37°C PARA VER
MOTILIDAD
• NO ES NECESARIO CALENTAR EL SEMEN PARA INSEMINAR
• INSEMINAR MAX 24 HORAS DE REFRIGERADO