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Actividad antifúngica de los extractos

de orujo de oliva
Traducido de: Antifungal activity of olive cake extracts

Talal Aburjai

Phytopathologia Mediterranea

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Actividad antifúngica de los

extractos de orujo de oliva
Talal Aburjai

Phytopathologia Mediterranea

Original Paper 

Abstracto
Se extrajo torta de aceituna (Olea europaea) seca y en polvo con hexano, metanol y
butanol. Seis compuestos fenólicos, ácido cumárico, ácido ferúlico, oleuropeína, ácido
cafeico, ácido protocatequiico y ácido cinámico, fueron aislados de estos extractos después
del fraccionamiento. Se analizó la actividad antifúngica de las fracciones contra Verticillium
sp., Fusarium oxysporum, Rhizopus sp., Penicillium italicum, Rhizoctonia solani, Stemphylium
solani, Cladosporium sp., Mucor sp., Colletotrichum sp. y Pythium sp. La actividad más fuerte
se informó contra Fusarium oxysporum y Verticillium sp. No se observó ningún efecto contra
Alternaria sp.

Introducción
En Jordania, el olivo (Olea europaea L.) se considera oficialmente el cultivo nacional. La
cantidad de aceitunas producidas en 1998 fue de 177.000 toneladas, la mayor cosecha de
todos los árboles frutales en Jordania (Anónimo, 1999). Casi todas las casas, jardines y
aceras de Jordania tienen uno o más olivos.

El orujo virgen, o orujo, es el sólido obtenido del prensado de aceitunas, y está formado
por fragmentos de piel, pulpa, hueso y pepita. Retiene la grasa natural y la humedad de las
aceitunas. El orujo de prensa seca es el orujo del que se han eliminado las principales
partículas de hueso. La cantidad de orujo procedente de la elaboración mecánica varía según
el tipo de aceituna y el método de prensado y oscila entre el 25 y el 50 por ciento del peso de
aceituna prensada. Después de un año excepcionalmente seco, la cifra puede llegar al 70 por
ciento, pero el porcentaje habitual oscila entre el 35 y el 40 por ciento (Frezzotti et al.,
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1956;Al-Bana and Hijazi, 1987;Kivitsakis, 1990;Qalalweh, 1995) .

El valor comercial del orujo de aceituna depende de su contenido en agua y grasa. La

humedad suele representar entre el 20 y el 30 por ciento del peso, mientras que el contenido
de grasa varía desde un mínimo de alrededor del 2,5 por ciento del peso hasta el 10-12 por
ciento, y en algunos casos incluso más, según el proceso de extracción utilizado. Además de
su uso como alimento para animales, el residuo también se puede utilizar como fertilizante,
después de haber sido macerado adecuadamente para evitar la fermentación, que dañaría
las plantas (Al-Momany y Al-Saket, 1989). Los fragmentos de piedra obtenidos de las
cáscaras también son excelentes como combustible, desarrollando casi tantas calorías
como el coque. La ceniza excelente se obtiene de los orujos vírgenes quemados y de los
orujos agotados tras la extracción de la grasa y los fragmentos de hueso de aceituna. Esta
ceniza es un buen fertilizante por su contenido en fósforo, potasa y calcio (Frezzotti et al.,
1956; Mohammad et al., 1993).

Los estudios también han demostrado la importancia de los productos químicos

naturales como una posible fuente de plaguicidas alternativos no fitotóxicos, sistémicos y
fácilmente biodegradables (Fawcett y Spencer, 1970; Bye, 1978). Las encuestas han
demostrado que los extractos de muchas especies de plantas tienen actividades
antifúngicas (Osborn, 1943; Spencer et al., 1957; Dixit y Tripathi, 1975; Lapis y Dumancas,
1978; Franje, 1984; Guesin y Reveillere, 1984; Deans y Svoboda , 1990).

Los estudios sobre los efectos antifúngicos del orujo de aceituna son escasos. La
capacidad antimicrobiana de ocho compuestos fenólicos aislados de orujos e identificados
por Abo-Zaid et al. (1993) fue probado por Aziz et al. (1998) contra las bacterias patógenas
Escherichia coli, Klebsiella pneumonia y Bacillus cereus, y los hongos micotoxigénicos
Aspergillus flavus y A. parasiticus. La actividad antimicrobiana encontrada varió desde
ningún efecto hasta la inhibición completa del crecimiento. Algunos investigadores informan
que la mayoría de los derivados fenólicos tienen un espectro de acción bastante amplio que
es tanto bacteriostático como fungistático. Baranowski et al. informaron que estos derivados
inhibían a Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger y Trychophyton rubum. (1980) y por
Gourma et al. (1989). Varios productos alimenticios son susceptibles a la contaminación por
muchas especies de hongos, incluidos Aspergillus, Penicillium, Claviceps, Alternaria y Phoma
(Aziz, 1987). El efecto de los agentes antimicrobianos sobre el crecimiento y la producción de
aflatoxinas del grupo Aspergillus flavus fue evaluado por Uraih et al. (1977) y El-Far et al.
(1992). No se han realizado más investigaciones sobre el efecto de los extractos de orujo de
oliva en los hongos fitopatógenos. Por lo tanto, investigamos el posible efecto antifúngico de
ocho extractos de orujo de oliva en once de los hongos patógenos de plantas más
destructivos, frecuentemente aislados de cultivos y suelos en Jordania y en todo el mundo
(Tabla 1).
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Materiales y métodos

Extracción y purificación de compuestos activos

El orujo de aceituna (7 kg) se obtuvo en 1998 de una almazara local (área de Zobia, 70
km al noroeste de Amman, Jordania) y se percoló con etanol al 96 % (11 l). El solvente se
evaporó para dejar un extracto (754 g) que se disolvió en agua (1 l) y luego se extrajo tres
veces con 500 ml de hexano, cloroformo y butanol respectivamente. El extracto butanólico
(E1=100 g) se cromatografió en columna de gel de sílice (350 g, 5x90 cm). Las fracciones se
recogieron y se eluyeron con un gradiente de CHCl 3 -metanol (100-30%). Se combinaron las
fracciones que eran similares según el análisis TLC utilizando éter de petróleo:acetato de
etilo (7:3) como sistema disolvente. El compuesto fenólico detectado en el extracto de n-
hexano (E2=2,6 g) se purificó por cromatografía en columna (125 g, 2,5x90 cm) utilizando
éter de petróleo:CHCl 3 (100:70 v/v). El extracto de CHCl3 (E8) se analizó por TLC (gel de
sílice, eluyente como antes). La estructura de las fracciones puras se estableció por 1 H-
NMR, 13 C-NMR, MS y por comparación directa con muestras auténticas.

Actividad antifúngica
Los hongos utilizados en este estudio se recolectaron en varios lugares de Jordania
(Tabla 1). Todos los hongos aislados se identificaron a nivel de especie o género y se
depositaron en el banco de colección de hongos del Departamento de Biotecnología de la
Universidad Aplicada Al-Balqa', Al-Salt, Jordania.

Los aislamientos fúngicos se mantuvieron en agar papa dextrosa (PDA, Difco

Laboratories, Detroit, MI, EE. UU.), y los cultivos se almacenaron a temperatura ambiente y se
subcultivaron una vez al mes (Deans y Svoboda, 1990). El medio (15 ml por placa) se
dispensó en placas de Petri estériles y se dejó enfriar antes de su uso. Se permitió que los
aislamientos crecieran durante 7 a 10 días antes de que se usaran en los estudios
microbianos.

Tres extractos crudos de orujo (E1, E2 y E8) y cinco fracciones butanólicas (E3-E7)
(Tabla 2) se diluyeron con agua destilada estéril (SDW) para dar una concentración final de
1000 ppm cada uno (Carter, 1968). Cada solución de extracto se distribuyó uniformemente
en PDA en las placas de Petri designadas a razón de 2 ml de solución por placa. Las placas
de control recibieron 2 ml de SDW cada una. Las placas se dejaron durante la noche para que
las soluciones se absorbieran a través del medio. Se colocó un tapón de inóculo del margen
en crecimiento activo de un cultivo de placa de Petri de cada aislado fúngico (Tabla 1) boca
abajo en el centro de cada placa de Petri usando un émbolo de resorte de 10 cm de largo y 5
mm de diámetro. Cada aislamiento de cada extracto se inoculó en cuatro placas y se incubó
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durante 9 días a temperatura ambiente (~22 °C). Se corrieron cuatro placas de control que
recibieron solo SDW a lo largo de cada aislado fúngico y extracto crudo, siguiendo el mismo
procedimiento que en las muestras.

Comenzando dos días después de la inoculación, se registró el crecimiento radial

diariamente durante 7 días, o hasta que las placas crecieron demasiado. El porcentaje de
inhibición del crecimiento fúngico causado por cada extracto crudo se calculó de la siguiente
manera: porcentaje de inhibición = [(crecimiento en control - crecimiento en muestra)/
(crecimiento en control)

x 100] donde el crecimiento se midió en mm como diámetro de colonia (Daouk et al.,

1995). Los valores informados para el porcentaje de inhibición fueron las medias de cuatro
determinaciones cada uno. Los errores estándar se calcularon y se muestran.

Resultados y discusión
Del extracto de butanol se aislaron cinco compuestos conocidos y se establecieron sus
estructuras como ácido protocatequiico (de la fracción E4 a E6), ácido cumárico (E3), ácido
ferúlico (E5), ácido cinámico (E6) y oleuropeína (E4). La fracción E7 reveló una mezcla de
compuestos que no han sido identificados. El extracto de hexano (E2 = 2,6 g) reveló
principalmente ácido cafeico. La inspección del extracto de CHCl 3 (E8) con TLC reveló
diferentes flavonoides. Ninguno de estos flavonoides fue purificado debido a su escasez.

Los ensayos de actividad antifúngica (Tabla 2) indicaron claramente que estos

compuestos fenólicos tenían una buena actividad antifúngica.

Con la excepción de Alternaria sp., todos los hongos probados mostraron varios grados
de sensibilidad a cinco o más de los extractos probados. Hubo una inhibición total del
crecimiento de Verticillium sp. cuando las placas de PDA fueron fortificadas con los
extractos E1 (extracto crudo de butanol), E3 (ácido cumárico), E4 (ácido protocatequiico) o
E6 (ácido cinámico) (Cuadro 2). El porcentaje de inhibición con otros extractos osciló entre
11,4 % y 65,7 %. Con Fusarium oxysporum, los extractos E1, E2 (ácido cafeico), E3, E6 y E8
(flavonoides no identificados) causaron una inhibición total del crecimiento. Solo E5 (ácido
ferúlico) no tuvo efecto sobre el crecimiento de F. oxysporum. El porcentaje de inhibición de
F. oxysporum con E4 y E7 (mezcla de compuestos) fue de 69,4±4,9 y 38,1±4,8
respectivamente.

Para Rhizopus sp., el 85 % del crecimiento fúngico se inhibió con E1, seguido de E5 (78,4
%), E4 (75 %), E8 (66,3 %) y E2 (54,2 %). E3, E6 y E7 tuvieron un efecto antifúngico más débil
contra Rhizopus sp. Aproximadamente el 70% del crecimiento de Penicillium italicum se
inhibió cuando el medio se fortificó con E5. E1, E3, E4 y E6 inhibieron el crecimiento entre
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55,9 y 59,4%. E7 tuvo una actividad de inhibición baja y E2 y E8 no tuvieron efecto. Contra
Rhizoctonia solani E5 no fue efectivo, E2, E4 y E8 mostraron actividad inhibitoria leve, E1 y E7
actividad moderada, mientras que E6 fue el más efectivo (88,2%) seguido de E3 (70,5%). Se
observó actividad antifúngica moderada cuando se utilizaron las muestras E1 y E7, mientras
que se observó actividad baja con E2, E4 y E8. Todos los extractos mostraron una actividad
antifúngica muy baja contra Stemphylium solani y Cladosporium sp. Inhibición moderada del
crecimiento de Mucor sp. se observó cuando se agregaron los extractos E1, E3 y E6 al medio
de cultivo; con los demás extractos se obtuvo una inhibición más baja, que osciló entre 7,5 y
35%. E5 y E8 fueron moderadamente efectivos contra Colletotrichum sp., los otros extractos
lo fueron menos, con una inhibición del crecimiento que varió de 7.5 a 31.5%. Se obtuvo
actividad de inhibición moderada (47,6%) contra Pythium sp. cuando se añadió E8 al medio,
menor actividad (10,7-35,8%) con E2, E5, E6 y E7, y no se obtuvo actividad con E1, E3 y E4.

La importancia de los productos autóctonos para el control de enfermedades de las

plantas se ha investigado en otros estudios y se informan resultados alentadores (Misra y
Dixit, 1976;Chaudhuri, 1982;Mahmood, 1985;Akhtar et al., 1986;Asthana et al., 1986;
Chaturvedi et al., 1987; Al-Abed et al., 1993). Sin embargo, este es el primer trabajo sobre la
actividad antifúngica de los extractos de orujo frente a hongos fitopatógenos.

Los orujos utilizados como fertilizantes también potencian el efecto del hongo
micorrícico Glomus fasciculatum inoculado en plántulas de olivo. Cuando se añadieron
diferentes cantidades de orujos a plántulas de olivo inoculadas con G. fasciculatum para
estudiar su efecto sobre el crecimiento de la planta durante 1,5 años en condiciones de
invernadero, se encontró no solo que las plántulas de olivo micorrizadas crecieron mejor que
las plantas no micorrizadas (Al -Momany y Al-Saket, 1989), pero que la adición de orujos a
las plantas inoculadas al 10 o 20% del peso del suelo supuso una mejora adicional en el
crecimiento.

Los hallazgos indican que los orujos utilizados como fertilizante también controlan el
crecimiento de hongos (Cuadro 2). Esto podría tener un impacto muy significativo en el
cultivo del olivo al reducir la necesidad de pesticidas y, en consecuencia, reducir los costos.
Desde el punto de vista ambiental, se reduciría el efecto adverso de los pesticidas químicos
sobre el medio ambiente al transformar el orujo, que actualmente es un desecho que se deja
en grandes cantidades en las estaciones de almazara, en un eficaz y económico agente
fertilizante y antifúngico. Los hallazgos de este estudio están de acuerdo con las notas y los
resultados informados por Frezzotti et al. (1956) y Mohammad et al. (1993).

Literatura citada
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compuestos fenólicos extraídos de los orujos. Revista egipcia de ciencias aplicadas 6, 719-
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