DISEÑO DE PRIMERS

En cualquier laboratorio de genética se realizan frecuentemente PCRs. Nos sirven para

confirmar las mutaciones puntuales que observamos con otras técnicas y para hacer estudios
familiares de mutaciones ya conocidas. Pero… ¿pensáis que en los laboratorios tenemos
primers para todos los exones de todos los genes que hay? No. Para cada situación que
necesitamos, los diseñamos online, y el diseño se envía a grandes empresas que los producen
y nos los mandan.

Para el diseño online de los primers, que es lo que a nosotros nos interesa, hay que seguir una
serie de pasos, teniendo en cuanta que la información de la que partimos es el nombre de un
gen, y la variante en estudio:

1. Sacar la secuencia de interés:

• Utilizaremos la web OMIM para encontrar la patología con la que está relacionada ese
gen www.omim.org
• Para encontrar la secuencia del gen buscamos en http://www.ensembl.org. Nos
aseguramos de seleccionar la “especie humana” y buscamos el gen de interés. En esta
web nos sale información del gen, del tránscrito, de variantes etc. Pulsamos en Human
Gene.

• Luego pinchamos en “Show transcript table” y en el “ID transcript” de nuestro

tránscrito, que suele ser el primero.
• Una vez ahí, en la columna de la izquierda nos deja elegir en Sequence lo que
queramos ver de ese tránscrito, y pulsamos en “exons”. Y en la parte de abajo se
despliega toda la secuencia del gen con los exones en gris y los intrones en azul.
• Dentro de esta página, otra vez en la columna de la izquierda, elegimos “Configure this
page” y la ponemos de la siguiente manera:

Y pulsamos el tic de arriba para que se cumpla.

• Ahora tenemos que encontrar nuestro exón de interés, es decir, en cuál está la
variante encontrada. Como le hemos dicho a la página que nos numere según la
secuencia codificante, solo tenemos ver por qué número empieza nuestro exón, y que
sea el más cercano a la variante encontrada.
• Abrimos una hoja de Word, previamente identificada con el nombre del gen y la
patología, y entonces copio el exón de interés y el intrón anterior y posterior. Una vez
copiado, lo selecciono y reemplazo los espacios (reemplazar, espacios por nada) y
damos a reemplazar todo. Para reemplazar los enter, buscamos es reemplazar, escribo
^p y pulsamos reemplazar todo.
• Después en la web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, ponemos el gen y pinchamos en
“blast human”, metemos la secuencia. Este paso nos ayuda a confirmar que no haya
habido ningún error, debemos confirmar que nos salan los siguientes datos:
Expect 0%
Gaps 0%
Identification 100%

Una vez confirmados estos, seguimos.

• En mi Word coloco corchetes a unos 50 pb del exón por delante y por detrás,
porque las primeras y las últimas pb salen sucias cuando se secuencia,
entonces es mejor dejar un margen hasta el exón.
2. Generar los primers
• Entramos en la web http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/, esta es la que nos
ayuda a diseñar los primers (dejamos las condiciones que vienen por defecto
en la página).
• Pego toda la secuencia en el recuadro (con los corchetes incluidos para que
delimiten el exon) y selecciono “pick left primer” y “pick right primer”. Pincho
en Pick primers y me aparecen forward y reverse. IMPORTANTE:
- Fijarnos en las Tm (melting temperature) que no varíen más de 1-2 grados
entre los dos. Que no sean muy bajas (57-58ºC) hace que sean
inespecíficos y se peguen a más zonas o entre sí, cuanto más alta la Tm
menos probable es que esto ocurra (Tm mínima 60, óptima 63, máxima
65).
- Mirar el porcentaje de GC, este no debe superar el 60% porque puede
dificultar la separación de los primers del DNA.
- En cuanto al tamaño de los primers, el mínimo en 20pb, óptimo en 22 y
máximo 25.
- Los dos primers aparecen en dirección 5’3’.
• Selecciono el forward (left) tal cual y voy a mi Word, lo busco en la secuencia y lo
pongo de otro color. Para el reverse (right), CUIDADO, en el Word sólo tenemos la
hebra 5’-3’, y el que me aparece en la web es el 5’3’ pero en la hebra contraria.

Para sacar la secuencia del primer reverse, utilizamos la herramienta informática

https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html , pegamos ahí el reverse y el
resultado que nos da, lo buscamos en el Word y lo pintamos también de amarillo.
• Ahora hay que chequear los primers:
https://secure.ngrl.org.uk/SNPCheck/snpcheck.htm
Para ello escribimos, EJEMPLO:

COL6A1_2 agccttaggaaggtttaaa gccccgggaaattttt 15

Nombre del gen_exón, espacio y pego el Forward (5’-3’) espacio y pego el reverse (5’-
3’) y el número de cromosoma.

Después pinchamos en SNPcheck

Con esto comprobamos si en la zona de los primers hay descrito algún polimorfismo,
en caso de que lo hubiese, deberíamos buscar otros primers, o cogemos los
alternativos que nos sugiere el programa, o modificamos la posición del corchete para
que nos sugiera otros primers. Porque si hay polimorfismos descritos en esa zona,
dependiendo del paciente, puede que funcionen o no y los primers se peguen o no.