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Taller práctico No. 1 - 5%

Trabajen en parejas!!
Escriban sus respuestas en un color diferente a negro
Evolución (21026)

Objetivos:
1. Adquirir experiencia navegando GenBank, usando BLAST, y obteniendo secuencias de ADN
2. Practicar el uso del portar CIPRES (www.phylo.org)
3. Alinear secuencias de ADN utilizando el programa Clustal
4. Visualizar matrices utilizando Mesquite (y software de texto)

Obtención de secuencias de ADN: GENBANK

Genbank es una base de datos de secuencias de ADN de libre acceso. Otra base de datos de secuencias de
ADN de libre acceso es BOLD (The Barcode of Life Data System, http://www.boldsystems.org), pero ésta
só lo tiene datos de có digos de barras (gen COI, ITS, rbcl, matK para diferentes grupos respectivamente!).

Para acceder a Genbank, entre en la pá gina del National Center for Biotechnology Information (NCBI) que
hospeda a GenBank: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y explore los diferentes recursos que ofrece el sitio de
acuerdo al tipo de datos y el objetivo de la bú squeda (menú de la izquierda). Genbank no es solo una fuente
de datos, sino que tiene una gran cantidad de herramientas/funciones para diferentes aná lisis. Ademá s tiene
instructivos para sacarle provecho a todas esas herramientas:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/tutorials/

Encuentre el link de GenBank y haga click en él. En la barra de GenBank es posible buscar por gen (e.g.,
ND4), nombre comú n en inglés (e.g., Blue poison-arrow frog) o científico de la especie (e.g., Anolis agassizi),
o por No. de accesió n (e.g., DQ502123.1), y ademá s es posible enfocar la bú squeda por tipo de datos (ie.
secuencias de ADN, proteínas, genomas, SNPs) y mucho má s--haga click en el menú donde dice Nucleotide
para ver todas las opciones.

Explore las siguientes búsquedas (deje el menú en Nucleotide), y revise el tipo de información
obtenida a partir de la búsqueda:
Busque: Mitu salvini
Responda: 1. # de resultados de la bú squeda: 10 ítems

2. Escriba cinco marcadores/genes que se han secuenciado para esta especie:

Haga click en cualquier ítem obtenido. Cada una de las secuencias de GenBank tiene una cantidad de
informació n asociada: La especie a la que pertenece la secuencia, la longitud de la secuencia, si contiene el
gen completo o es una secuencia parcial (CDS = coding DNA sequence), en que codó n empieza la secuencia,
artículo asociado a la informació n, etc. Revise en una 'ficha' de una accesió n toda la informació n disponible.
Para someter una secuencia de ADN se debe someter un mínimo de informació n asociada!

Busque: Three-toed sloth

Responda: 1. # de resultados de la bú squeda:

2. Nombre científico de la especie (del primer registro que obtiene):

Busque: KC773761.1 (éste es un nú mero de accesió n)
Responda: 1. De qué especie es ésta secuencia?

2. De cuá l marcador/gen es ésta secuencia?

3. En qué posició n de codó n (1, 2 o 3) empieza el gen?

4. Quién es el primer autor del artículo donde fueron publicadas estas secuencias?

5. Dó nde fueron publicadas las secuencias por primera vez (cita completa de la revista)?

(no cierre ésta última búsqueda)

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es una herramienta fantá stica que tiene el sitio de NCBI. Le
permite a uno comparar una secuencia determinada contra todas las secuencias disponibles en GenBank.
Por ejemplo, se utiliza para buscarle identidad a una muestra que se sospecha es contaminació n. En la
pá gina del Olinguito con nú mero de etiqueta QCAZ 8662 (QCAZ es el acró nimo del Museo de la Universidad
Cató lica de Ecuador en Quito), en el menú de la derecha haga click en Run BLAST.

En la ventana nueva que se ha abierto, el nú mero de accesió n aparece en la secció n Enter Query Sequence. En
ésta secció n se puede cortar y pegar secuencias de ADN o el no. de GenBank para buscar. Explore las
opciones de la bú squeda (secció n Choose Search Set) y explore las opciones en la secció n Program Selection.
Haga click en BLAST (con las opciones predeterminadas). Mirando la secció n de Program Selection,
responda: En qué situació n se le ocurre que pueden ser ú tiles las diferentes alternativas de bú squeda?

Haga click en Blast. Revise la tabla resultante.

Responda:
1. Cuá l especie es la má s cercana al Olinguito QCAZ 8662? (que no sea el mismo!)

2. Cuá l es el porcentaje de similaridad (% identity)?

3. Cuá l es el porcentaje de cobertura (query cover)?

Revise qué describen cada uno de los valores resultantes y las diferentes pestañas de Graphic
Summary, Alignments, y Taxonomy.

BLAST ofrece otras opciones, por ejemplo para buscar una proteína y encontrar secuencias de ADN y
viceversa. Aquí encuentran todas las posibilidades: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?
CMD=Web&PAGETYPE=BLASTHome

Vuelva al sitio de GenBank. Busque las secuencias del gen Beta fibrinogen que está n disponibles para el
clado Pipra. Revise las secuencias resultantes, y seleccione aquellas que corresponden al género Pipra y que
sean ADN y tienen menos de 2000pb (pares de bases en inglés). Descargue las 22 secuencias en formato
FASTA (arriba a la derecha encuentre Send To -> escoja: complete record -> choose destination: File ->
Format: FASTA). Revise el archivo de texto obtenido (en NotePad o cualquier lector de archivos .txt).

Tómese varios minutos para explorar qué información hay disponible de los potenciales grupos a
analizar en su proyecto final. NO CIERRE SU BUSQUEDA DEL BETA FIBRINOGEN EN Pipra.

Plataforma CIPRES.
Para analizar nuestros datos es ú til tener los programas grabados en nuestro computador, pero no es
necesario, y a veces realmente no es viable! Afortunadamente existen plataformas gratis online que nos
permiten correr aná lisis pequeñ os sin ningú n problema. CIPRES es una de ellas! Entre a la plataforma,
https://www.phylo.org/ y regístrese. Abran dos cuentas (una por cada estudiante del grupo), pero solo
utilicen una para hacer los ejercicios de la clase! La otra cuenta ‘guá rdenla’ para el proyecto final. La
plataforma cobra para aná lisis que requieran un mayor tiempo del que nosotros necesitamos. Explore las
diferentes pestañ as (CIPRES share es ú til para compartir datos con otros usuarios--esto lo pueden usar para
su proyecto!, Toolkit, Help, How to Cite...).

Alineamiento de secuencias de ADN: Clustal X, W, O

Cada una de las secuencias descargadas de Genbank son independientes entre sí. Algunas contienen el gen
de interés completo, algunas solo un fragmento. Es muy probable que cada una inicie y termine en una
posició n diferente. Có mo hacemos para analizarlas todas al tiempo y asegurarnos que estamos comparando
sitios homó logos? (Se acuerdan qué es homología?) Para eso se realiza el alineamiento de las secuencias:
Hacemos hipótesis primarias de homología. En el alineamiento, un algoritmo se encarga de comparar las
secuencias e hipotetizar si dos posiciones son equivalentes a partir de varios pará metros. El objetivo es
alinear todas las secuencias que tengamos disponibles de la mejor manera. El resultado/output de un
alineamiento es una Matriz.

Clustal es uno de muchos programas disponibles para alinear secuencias de ADN. Otros ampliamente
utilizados son MAFFT, T-COFFEE, y MUSCLE. Clustal X tiene la ventaja de tener GUI (Graphical User Interface
o Interface Grá fica para Usuarios), que hace el proceso má s fá cil cuando se está empezando. Los otros tres
funcionan directamente en el Terminal, i.e., por medio de la línea de comando (Si alguien quiere
experimentar con esto, fantá stico!).
Vaya a la pá gina www.phylo.org y regístrese! Cree una carpeta con el nombre 'Taller1'. Aparecerá n
automá ticamente Data y Tasks. Ahora armemos la matriz que queremos analizar.
1. Entre a Data y suba su archivo FASTA que acaba de crear de Genbank.
2. Luego entre a Task y cree un New Task. Dele un nombre corto y descriptivo.
3. Seleccione los datos (su archivo FASTA),
4. Seleccione la herramienta que quiere usar (aquí aparecerá n todas las herramientas disponibles, la misma
informació n que encontró el Toolkit). Seleccione ClustalW
5. Note que en el ítem Input Parameters, automá ticamente aparece 41 Paramenter Set, que indica todos los
pará metros de la herramienta escogida. Entre a esta opció n, revise todas las opciones que tiene Clustal
(haga click en Advanced Parameters para ver todas las opciones), y cambie el formato de output a NEXUS.

Tome nota de los valores por defecto de los pará metros 'Gap Opening' y 'Gap Extension'.
Costo Gap Opening:
Costo Gap Extension:

Deje lo demá s en los valores por defecto. Haga click en Save Parameters. Le deben quedar 21 pará metros.

Pensando en el objetivo final del alineamiento (que es armar una matriz), para qué servirán estos
valores? Escriba la función que usted cree estos cumplen durante el proceso de alineamiento.

6. Haga click en Save and Run Task

Mientras salen los resultados, cree otro Task nuevo, pero esta vez cambiando los valores de Gap Opening a
30 y Gap Extension a 0.05. A partir de los nuevos valores--y lo que considera es su función, qué
esperaría que cambiara en su alineamiento? Qué efecto tendrían los nuevos valores?

Realice nuevamente el alineamiento (cree un Task nuevo). Ahora cambiando el valor de Gap Opening a 1, y el
valor de Gap Extension a 8. A partir de los nuevos valores--y lo que considera es su función, qué
esperaría que cambiara en su alineamiento? Qué efecto tendrían los nuevos valores?
Ya deben estar listos todos los alineamientos. Entre a su carpeta de Tasks y revise los links View Output.
Explore con View que contienen los diferentes archivos disponibles. Revíse/Busque el que termina .nex y
descá rguelo. En su computador, cá mbiele el nombre a su archivo para que no sobreescriba y sepa
exactamente a qué aná lisis corresponde.

Utilice wordPad, TextEdit, Notepad, o cualquier otro editor de texto que tenga disponible para revisar sus
alineamientos (pó ngalos uno al lado del otro). Intente descargar el programa Mesquite
(www.mesquiteproject.org) para visualizar su matriz. Si Mesquite no le funciona, utilice la herramienta
Wasabi (www.was.bi) para visualizar sus alineamientos. Qué cambió en los resultados--cómo quedaron
sus alineamientos? Tienen el mismo tamaño? Cómo es la distribución de sus gaps? Se cumplieron sus
predicciones? Cuál sería para usted el 'mejor' alineamiento y porqué?