Facultad de Ciencias. Licenciatura en biología Universidad Nacional Autónoma de México.

Elaboración de Curva Estándar

Equipo #4: Castillo Neri Yolotzin, Condes Lechuga Rodrigo, Huerta Salinas Ricardo, Rodríguez Bobadilla
Francisco Javier. Zúñiga González Liliana.

Abstrac: Se lleva a cabo la elaboración de la curva estándar con la que se logre determinar la
concentración de dos soluciones proteicas desconocidas (solución A y B) a través del uso de
instrumentos como el espectrofotómetro para su cuantificación, en la cual, se esperaría que a
medida que aumentan los volúmenes, mayor la concentración; dicho valor se determina a partir
de una curva estándar con 𝑅 2 = 0.95, hecha a partir de una solución conocida más fácil de medir.
En la cual, de acuerdo con las observaciones y los cálculos realizados, se encuentra una correlación
lineal positiva entre la absorbancia y la concentración de una solución, determinando así de
manera aproximada su valoración proteica
Palabras clave: Curva estándar, reactivo de Bradford, Solución desconocida, espectrometría,
absorbancia, transmitancia.

Introducción conocida como densidad óptica (Laboratorio Eyco.,

La cuantificación de proteínas presentes en una 2022). Nos permite cuantificar proteínas, azúcares,

muestra biológica es de carácter fundamental en etc (Mendoza von der Borch et al., 2020).

estudios de carácter clínico, ya que puede proveer La transmitancia es la fracción o porcentaje de

información acerca de determinados estados radiación que atraviesa la muestra, permite saber si

patológicos. La absorbancia (capacidad de absorber un material transmite o no la radiación

luz de una determinada longitud de onda), es electromagnética (Laboratorio Eyco., 2022).

aprovechada por la técnica de espectrofotometría En esta prueba proteica, utilizamos el Método de

UV-visible, para ayudar a la averiguación de la Bradford, el cual se basa en una reacción

concentración de proteínas presentes en colorimétrica de proteínas con un tinte, Coomassie

determinadas muestras. Azul Brillante G-250. Las proteínas se unen al tinte

La curva estándar representa la relación entre dos en un ambiente ácido, e inducen un cambio

cantidades, utilizada para determinar el valor de espectral del color marrón al azul. Las interacciones

una sustancia desconocida a partir de una que es hidrófobas e iónicas con las proteínas de la muestra

más fácil medir (Delong & Zhou., 2015). estabilizan la forma aniónica del tinte., provocando

Por otro lado, la espectrofotometría es una serie de un cambio de color visible. El color azul que se

técnicas que se basan en la capacidad de las desarrolla es, por tanto, proporcional al contenido

moléculas de absorber, transmitir o reflejar la de proteínas y se puede medir

radiación electromagnética de una longitud de espectrofotométricamente. Construyendo una

onda en específico, específicamente en la relación curva de calibración utilizando concentraciones

que hay entre absorción de luz de un compuesto y conocidas de proteínas utilizadas como estándar es

su concentración. posible descubrir la concentración de proteína

La absorbancia por su parte es la cantidad de desconocida de una solución, basado en la

radiación absorbida por un material, también absorbancia de la solución después de agregar el

tinte.
Finalmente, para la elaboración de la curva
estándar necesitaremos de la ecuación de la recta:
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏
(Ecuación 1)
Donde;
y es la absorbancia,
x es la concentración de proteínas,
b es la ordenada al origen que debe ser cercana a
0,
m es la pendiente de la recta (Mendoza von der
Borch et al., 2020).
Podemos confiar en nuestros resultados si 𝑅 2 es
mayor o igual a 0.9. Para determinar la
concentración de proteína problema se debe
sustituir el valor de la absorbancia obtenida
experimentalmente y despejar la concentración de
la proteína problema (Mendoza von der Borch et
al., 2020). Para obtener la concentración de
proteína problema se debe seguir la siguiente
ecuación. Es importante que las absorbancias de
nuestros tubos problemas se encuentren dentro
del intervalo de la curva estándar, pues en caso
contrario estos no serán confiables (Mendoza von
der Borch et al., 2020).

2 12.5 87.5
Métodos y Materiales 3 25 75
Para la curva estándar se preparan 6 tubos (figura
4 50 50
1.1) en el que se utiliza una solución de 0.2 mg/mL
5 75 25
de BSA (Albúmina, sérica bovina).
6 100 0

Tabla 2. Volúmenes de solución problema A y agua,

asociados a los tubos.
Tubo Sol. Problema A μL de 𝐻2 𝑂
(μL)

(Figura 1.1 preparación de tubos) 7 10 90

Para los tubos problemas A (tubos 7-9) y B (tubos 8 20 80
10-12) se utilizó una solución proteínica
9 40 60
desconocida. Posteriormente se adicionaron con
micropipeta los siguientes volúmenes de Agua
Tabla 3. Volúmenes de solución problema B y agua,
destilada y BSA para la curva estándar (Tabla 1), y asociados a los tubos.
para la solución problema A (Tabla 2) y B (Tabla 3). Tubo Sol. Problema B μL de 𝐻2 𝑂
(μL)

Tabla 1. Volúmenes de BSA y agua, asociados a los 1 10 90

tubos.
2 20 80
Tubo μL de BSA μL de 𝐻2 𝑂
(0.2mg/mL) 3 40 60

1 0 100
Una vez añadidos los volúmenes (figura 1.2) se Resultados
procedió a homogeneizar cada uno de los tubos con Tabla 4. Absorbancia de BSA (concentración de
un agitador (figura 1.3) , adicionar 1 mL de reactivo 0.2mg/mL)
Absorbancia (595
de Bradford y homogeneizar nuevamente, realizar Tubo Concentración (μg) nm)
la medición de la absorbancia de cada uno de los 1 0 0
2 2,5 0,04
tubos en el espectrofotómetro (figura 1.4) a 595 nm
3 5 0,163
(no fue necesario lavar las celdas después de cada 4 10 0,229
medición), se recopiló datos, se desechó el reactivo 5 15 0,301

de Bradford en su contenedor y se lavó el material 6 20 0,376

de cristalería utilizado, finalmente, para calcular la

concentración de las soluciones problema, se
sustituye la absorbancia en la ecuación (ecuación 1)
de la recta obtenida, de la curva estándar.

Gráfica de curva estándar de la absorbancia de proteína BSA a 595 nm.

Con ecuación y=mx+b donde “y” es la absorbancia. De acuerdo con los
datos de la curva la ecuación es “[Abs 595NM]= 1,86x10-3 (mg) + 0,0217”
con un índice R2 = 0,959

Tabla 5. Microgramos y absorbancias de la solución

problema A.
Solución
problema
Sol. (Concentració
(figura 1.2 añadido de volúmenes con micropipeta)
Problema Absorbancia Concentración n promedio
Tubos A (μL) (595 nm) (μg) mg/mL)
7 10 0.074 28.12
3.1mg/mL

8 20 0.157 72.74
9 40 0.229 111.5

Tabla 6. Microgramos y absorbancias de la solución

(figura 1.3 homogeneización de tubos con agitador bortex)
problema B.
Solución problema
Sol. (Concentra
Problema B Absorbancia Concentración ción promedio
Tubos (μL) (595 nm) (μg) mg/mL)

10 10 0.025 1.8

11 20 0.078 30.3 1.06 mg/mL

12 40 0.129 57.7

(figura 1.4 medición de absorbancia con espectrofotómetro)

Conclusiones https://cellculture.altervista.org/the-

La alta sensibilidad observada en el método de bradford-method-to-quantify-cell-

Bradford resulta un buen indicador al poder protein/?lang=es&doing_wp_cron=166261

proporcionar la detección de una respuesta 7795.6954290866851806640625

(absorbancia) a concentraciones de proteína • Delong, R. K., & Zhou, Q. (2015).

bastante reducidas, lo cual es conveniente al Hexokinase and G6PDH Catalyzed

momento de querer optimizar los reactivos Reactions of Glucose Measurement.

utilizados en el laboratorio, además de ofrecer Introductory Experiments on Biomolecules

una metodología que resulta conveniente en el and their Interactions, 45-57.

hecho de que puede describir un comportamiento. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-

Al provocar la tinción de la proteína de los reactivos 800969-7.00005-0

A y B, permite que se establezca una relación • Laboratorios Eyco. (2022, 11 julio). Ensayos

proporcional entre la absorbancia en el de espectrofotometría. Laboratorios EYCO.

espectrofotómetro, a luz visible y la cantidad de Recuperado 8 de septiembre de 2022, de

proteína que logró reaccionar con los reactivos, https://www.laboratorioseyco.com/portfo

confirmado que, a mayor concentración, mayor el lio/ensayos-de-

valor de la absorbancia. espectrofotometria/#:%7E:text=Por%20otr

a%20parte%2C%20la%20cantidad,onda%2
0dadas%20se%20denomina%20transmita
Discusión (anexadas)
ncia.
• Mendoza von der Borch, A. P., Valencia
Referencias
Turcotte, L. G., Alba Lois, L., & García
Álvarez, J. A. (2020). Elaboración de curvas
• The Bradford method to quantify protein
estándar. En: Manual de prácticas de
(indirect cell quntitation). (2022, 8 febrero).
biología molecular de la célula II. La prensa
Cultivo de células. Recuperado 8 de
de ciencias. 33-39.
septiembre de 2022, de