INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL.

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO.

BIOQUÍMICA FARMACÉUTICA.

PRÁCTICA NO. 2:

Cuantificación de proteínas

3FV1

EQUIPO NO. 4
Aguilar Granados Arizbeth Michelle.
Almanza Trejo Clara Paulina.
Bermudez Ruiz Jessica Guadalupe.
Ferreyra Reyes Angélica

PROFESORES

Anastasio Cortes Mendoza

María Del Rosario León Reyes

14 de Febrero de 2017 21 de Febrero de 2017

1.- Objetivo
Se realizara una curva de calibración usando un método colorimétrico para la cuantificación de
proteína.

2.- Introducción

Cuantificación de Proteínas
Las proteínas son polímeros de aminoácidos, en los que cada residuo está unido al siguiente por
medio de un tipo especifico de enlace covalente. (Lehninger 2006)
Para macromoléculas como las proteínas, se definen cuatro niveles de estructura. La estructura
primaria es una descripción de enlaces covalentes, como lo son los enlaces peptídicos y puentes
disulfuro. La estructura secundaria se refiere a agrupaciones estables de los aminoácidos que
forman patrones repetitivos. La estructura terciaria describe todos los aspectos del plegamiento
tridimensional de un polipéptido. La estructura cuaternaria se denomina cuando una proteína posee
dos o mas subunidades poli peptídicas, tal como se muestra en la figura 1.1. (Lehninger 2006)

Figura 2.1 Niveles de estructura de las proteínas.

Para cuantificar la concentración de proteínas se hace uso de un espectrofotómetro que se basa

en la ley de Lambert Beer. Lehninger (2006) menciona que la medida de absorción de la luz
mediante un espectrofotómetro se utiliza para detectar e identificar moléculas y para medir su
concentración en solución. La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud
de onda determinada está relacionada con el espesor de la capa absorbente (paso óptico) y con la
concentración de la especie absorbente, a está relación se le conoce como la ley de Lambert-Beer
que se describe a continuación:
𝐼𝜊
𝑙𝑜𝑔 = 𝜀𝑐𝑙
𝐼
Donde 𝐼𝜊: intensidad de luz incidente
𝐼: intensidad de la luz transmitida
𝜀: coeficiente de absorción molar [Lmol/cm]
𝑐: Concentración de la especie absorbente [molL]
𝑙: paso óptico de la muestra que absorbe la luz [cm]

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 𝐼𝜊
Se denomina 𝑙𝑜𝑔 absorbancia y se denota con la letra A. Con una capa absorbente de peso
𝐼
óptico fijo la absorbancia A es directamente proporcional a la concentración del soluto absorbente.
El coeficiente de absorción molar varía con la saturación del compuesto absorbente, el disolvente
y la longitud de onda y también con el pH si la especie absorbente de luz está en equilibrio con un
estado de iluminación que tiene diferentes propiedades de absorbancia (Lehninger, 2006)

Figura 2.2 Componentes principales de un espectrofotómetro. Una fuente de luz emite luz a un amplio
espectro. El monocromador selecciona y transmite luz de una longitud de onda determinada. La luz del
monocromador pasa a través de la muestra situada en una cubeta de peso óptico y es absorbida por la muestra
en proporción a la concentración de la especie absorbente, la luz transmitida se mide mediante un detector.
Lehninger (2006)

Perez, (2017) menciona que un espectrómetro (también conocido como espectroscopio o

espectrógrafo) usado en el análisis químico es un instrumento óptico que se usa para medir las
propiedades de la luz sobre una porción específica del espectro electromagnético.
Utilización del espectrómetro:
Según Perez, (2017) se utiliza para la identificación de materiales e identificación de colorantes
alimenticios. Lobkowicz, F., Melissinos, A (1975) menciona que el espectrofotómetro se usa en el
laboratorio con el fin de determinar la concentración de una sustancia y microorganismos en una
solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos.
Dilución:
Es la preparación de una disolución menos concentrada por medio de una mas concentrada, en
otras palabras es añadir mas solvente. (Cedrón J, 2011)
Método de mínimos cuadrados:
Este método nos permite adaptar una línea recta optima a una muestra de datos u observaciones
tomadas y denotadas por las variables x, y es decir se deben encontrar los valores de los
parámetros que minimizan la suma de los valores al cuadrado, este método puede predecir puntos
en el fenómeno que se esta estudiando. (Lavacude, 2015)
¿Por qué se utiliza albumina para la cuantificación de proteínas?
De acuerdo a La principal razón por la que se emplea albumina sérica bovina (BSA) en diferentes
análisis, como en la estimación de proteínas para trazar curvas estándar es debido a que es
comercialmente fácil de adquirir y su costo es relativamente bajo., además de que es muy
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importante en la medicina, tiene inusuales propiedades de unión al marcador, es estable y los
resultados de todos los estudios son consistentes por el hecho de que la albumina de suero humano
y bovino son proteínas homologas.
Curva patrón:
Un marco de referencia que se construye atreves de cantidades conocidas de una sustancia (en el
caso del experimento se realizo con la albumina) que se utiliza para determinar la cantidad de
proteínas presente en una muestra incógnita. (Coto C,2017)
Curva de calibración:
Como lo menciona Osorno C. (2015) de los métodos más usados para determinar la concentración
de una muestra problema es el método de la curva de calibración. Esta curva es una gráfica que
relaciona la concentración de al menos cinco soluciones estándar de concentraciones conocidas,
con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max) (Fig. 1.3).

Figura 1.3: Gráfica de la curva de calibración (absorbancia vs concentración). (Osorno C. 2015)

Según Osorno C. (2015) una vez que se obtuvo la gráfica se determina la función matemática que
representa la recta a través de la aplicación del método estadístico de regresión lineal, el cual
relaciona la absorbancia y la concentración de un analito. La ecuación matemática que corresponde
a dicha función es:
A=mc+n
Dónde:
A: Absorbancia.
m: Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la muestra y el
espesor b de la cubeta.
n: Intercepto de la recta
Posteriormente se mide la absorbancia de la solución problema y se interpola su valor en la gráfica
o se sustituye en la ecuación, para obtener el valor de concentración del analito. La concentración
de la solución problema debe estar comprendida en el rango de concentración que comprende la
curva de calibración. Si la concentración de la solución problema es menor que la concentración
del estándar más diluido, debe usarse el método de adición estándar, que consiste en añadir un

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volumen determinado de un estándar concentrado a la solución problema, antes de realizar la
lectura que permitirá que esta lectura este dentro de las obtenidas por la curva de calibración. En
el caso contrario, si la concentración del analito es mayor que la concentración del estándar más
concentrado la solución problema deberá ser diluida. (Osorno C. 2015) .

Figura 1.4: Interpolación gráfica (absorbancia de la muestra vs concentración de la muestra). (Osorno C. 2015)

Al realizar la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de máxima absorbancia

(λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente y así tener mayor sensibilidad y precisión
al hacer las mediciones. La medición de la absorbancia de la solución problema debe hacerse a la
misma longitud de onda en la que fue hecha la curva de calibración. (Osorno C. 2015) .
Que significa R2 en la regresión:
Según García M, (2017) Es la medida estadística de la fiabilidad del modelo estimado a los datos,
es decir es el porcentaje de variación de la variable de respuesta que explica su relación con una
o más variables predictoras.

Linealidad del sistema de medición:

La linealidad es indispensable en la práctica de un análisis químico cuando se realizan curvas de
calibración; ésta no se cuantifica pero se observa por inspección o mediante pruebas de no
linealidad. (Miller J. 2002)
Para demostrar la linealidad se requieren cumplir ciertos criterios de aceptación en los que
estadísticamente se puede justificar esa linealidad; para ello es necesario calcular: la pendiente
(m), la ordenada al origen (b), el coeficiente de correlación (R 2). Para aceptar la linealidad a partir
de una curva de calibración se considera una R2>0.98 (Miller J. 2002)
Sensibilidad:
Como lo mencionan Danzer K & Lloyd C, (1998) la sensibilidad de método mide su capacidad para
discriminar entre pequeñas diferencias en la concentración del analito. Existen dos factores que
limitan la sensibilidad: la pendiente de la curva de calibración y la precisión del sistema de medida.
Para dos métodos que tengan igual precisión, el más sensible será el que tenga mayor pendiente;
hay que puntualizar que para determinar la pendiente de la curva se considera únicamente el
intervalo lineal de la misma debido a que cuando la curva pierde su linealidad, la pendiente también
es diferente. (Danzer K & Lloyd C, 1998)

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Es importante mencionar que la pendiente de la curva puede ser distinta para matrices diferentes;
es decir que la pendiente de la curva depende de todas las condiciones de medida y que éstas
deben ser iguales (o muy parecidas) para los estándares y la muestra problema. (Danzer K & Lloyd
C, 1998)
Límite de detección (LD):
Se define como la mínima concentración del analito detectable por el método. Su determinación es
importante particularmente para el análisis de trazas; su determinación más aceptable es el de la
concentración que corresponde a la medida del "promedio del blanco+ 3s". El blanco es la señal
emitida por el instrumento con una disolución que contiene las mismas especies que la muestra
problema (sin el analito). Para fines válidos se considera que deben hacerse 10 mediciones de
blancos independientes. El valor de 3s se refiere a tres veces la desviación estándar al realizar la
medición de estos blancos. (Dosal, M & Villanueva, M 2008).
Límite de cuantificación (LC):
También llamado límite de determinación, se define como la más pequeña concentración del analito
que puede ser determinada con un nivel de exactitud y precisión aceptables. Dependiendo del
convenio utilizado se considera como la concentración de analito que corresponde al valor del
promedio blanco mas 5, 6 o 10 veces la desviación estándar del mismo (esta última es la más
común). (Dosal, M &Villanueva, M 2008)
Es importante hacer notar que ni LD ni el LC representan niveles a los cuales sea imposible la
cuantificación del analito; el significado es que el LC representa la mínima concentración del analito
que puede ser determinada con un aceptable nivel de incertidumbre. (Dosal, M &Villanueva, M
2008)
Intervalo analítico:
Se define como el intervalo de concentración en que el analito puede ser determinado mediante el
empleo de la curva de calibración; se considera que es el comprendido entre el límite de
cuantificación hasta la concentración en la cual se pierde la linealidad de la curva. (Dosal, M
&Villanueva, M 2008).

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Figura 3.0: Ejemplo de una curva de calibración de la concentración de albúmina sérica bovina con un coeficiente de
correlación de 0.9987 considerando la linealidad de los valores de absorbancia hasta 0.4. (Dosal, M. & Villanueva, M.
2008)

Aplicaciones de la cuantificación de proteínas en la industria farmacéutica:

Según Randall (1951) la reacción de lowry se utiliza para identificar proteínas en los sueros, en
precipitados antígeno-anticuerpo y en insulina, para medición de la proteína durante el
fraccionamiento enzimático
Gonzales (2010) menciona que la medición de la absorbancia de proteínas se utiliza en algunas
técnicas de química clínica, que se utilizan para determinar la concentración de colesterol,
triglicéridos, glucosa, entre otros metabolitos, en sangre.

3.- Resultados y observaciones.

Fig.3.1. Resultados de la curva de calibración de la albumina de huevo, obteniendo una pendiente de –0.027 y una
ordenada al origen de 0.314, con una exactitud de 39.98%

4.- Discusiones
Las curvas reportadas en BioTek Instruments (2001). a 650 nm arrojan una pendiente positiva con un
valor de 0.02391, y según la grafica 3.1 y 3.2 en la practica se obtuvo una pendiente negativa con un
valor de 0.027, por lo cual podemos deducir que al momento de realizar la medición de la absorbancia
por un error de comunicación se midieron los tubos en un orden contrario. Por lo cual se realizo una
grafica nueva con los datos ordenados de la manera correcta, obteniendo una pendiente positiva con
un valor de 0.027.

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Fig.4.1. Resultados de la curva de calibración de la albumina de huevo ordenados, obteniendo una pendiente de 0.027
y una ordenada al origen de 0.152, con una exactitud de 39.98

Según Gonzales (2010) A mayor absorbancia, mayor será la concentración del metabolito
estudiado. Por lo cual nuestros resultados de la tabla 3.1 no son correctos, ya que estaríamos
diciendo que a mayor concentración, menor absorbancia.

Figura 4.3: Posibles curvas de calibración de la albumina (Gonzales,2010)

5.- Conclusiones
Se logro construir una curva de calibración con pendiente negativa cumpliendo parcialmente el
objetivo.

6.- Cuestionario.

1. ¿Qué es la espectrofotometría?
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 La medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función
de la longitud de onda de la radiación, así como las mediciones por separado a una longitud de
onda determinada. (Underwood, 1995)
2. ¿Cómo funciona un espectrofotómetro?
El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en iluminar la muestra con
luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de
longitudes de onda. Lo más usual es que los datos se recojan en 31 intérvalos de longitudes de
onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm, 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz
a través de un dispositivo monocromático que fracciona la luz en distintos intervalos de longitudes
de onda.(Sánchez D., 2011)
3. ¿Cuál es el propósito de contar con una curva de calibración para cuantificar proteínas?
Es una curva de referencia que se construye con cantidades conocidas de una sustancia y
se utiliza para determinar la cantidad de una sustancia (proteínas) presente en una muestra
incógnita. (Sánchez L., 2011)
4. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de usar un método colorímetro?
La mayor ventaja de un método colorimétrico consiste en que no es necesario el aislamiento
del compuesto y se pueden determinar los constituyentes de una mezcla compleja, sin que se
requiera mucho tratamiento previo
5. ¿Considera que el método que se uso en el desarrollo de la practica es el más adecuado?
¿por qué? Justifique su respuesta
Si, ya que según Oliver H. Lowry, Nira J. Rosebrough, A. Lewis Farr, and Rose J. Randall,
(1951) Es tan sensible como con el reactivo de Nessler,10 o 20 veces más sensible que la medición
de absorción ultravioleta en X = 280 rnp y es mucho más específico y mucho menos susceptible de
dañarse por turbidez, Es varias veces más sensible que la reacción de ninhidrina, Así como mucho
más fácil de adaptar para los análisis a pequeña escala, además de ser 100 veces más sensible
que la reacción de biuret.
6. Si tuviera la oportunidad de proponer algún método para cuantificar proteínas ¿Cuáles
son los criterios que tomaría en cuenta?
Que la reacción sea muy sensible, además de que sean pocos los factores que puedan
interferir en los resultados
7. ¿Qué observo durante la realización de la curva de calibración?¿Pudo usted utilizar la
curva patrón para calcular la concentración de proteína de sus muestras problema? Explique
su respuesta.
No se pudo utilizar la curva patrón debido a que la R2 es menor a 0.98 entonces la curva no
es fiable para calcular la concentración de proteína de nuestras muestras.
8. ¿Cuál fue la concentración de proteína que obtuvo para la clara de huevo? ¿qué puede
concluir de este resultado?
Para nuestra concentración de 0.2 se obtuvo una absorbancia de 0.390 mientras que para
nuestra concentración de 0.4 se obtuvo una concentración de 0.196 por lo cual podemos ver que a

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mayor concentración la absorción es menor lo cual es una contradicción a lo que (Mónica
Gonzales,2010) nos dice en los resultados.

7.- Bibliografía
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