19/10/2020

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA
ÁREA DE LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA
BIOQUÍMICA CLÍNICA II

DETERMINACIÓN DE ENZIMAS II

Lic. T.M. César Ramirez Fontela

La concentración de enzimas en suero es muy baja, sin embargo, dada su elevada capacidad catalítica, es posible
determinar su actividad y presuponer que ésta es proporcional a su concentración.

Por tanto, el estudio de las enzimas en el laboratorio se basa en la demostración “in vitro” de la actividad
catalítica.

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Se puede determinar la actividad enzimática analizando:

La desaparición del variación de una La aparición de algún

sustrato coenzima producto

TIEMPO

¿Cómo se obtiene en el laboratorio clínico el valor numérico de actividad

enzimática?
Generalmente la actividad enzimática se evalúa mediante ensayos espectrofotométricos, por tanto necesitamos seguir
la evolución de alguno de los elementos que participan en la reacción y que, por supuesto, deben absorber luz a una
determinada longitud de onda.

variación de una
coenzima

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Si el sustrato absorbe luz a una longitud de onda
determinada podemos evaluar la desaparición del
sustrato analizando la disminución de absorbancia a
dicha longitud de onda.
ABSORBANCIA
Si el producto absorbe luz a una longitud de onda
determinada podemos evaluar la aparición del
producto analizando el incremento de absorbancia
a dicha longitud de onda.

TIEMPO
En definitiva, la actividad de una enzima se mide mediante la determinación de la cantidad de producto formado o
desaparición del sustrato por unidad de tiempo, en condiciones exactamente definidas (pH, T°…) y estrictamente
controladas.

• Deigual modo podemos analizar la variación de una coenzima o de algún componente

de la reacción. Ej. es muy frecuente utilizar la aparición o desaparición de NADH o
NADPH, así
Curva de espectro de absorción del NAD+ y NADH FORMA OXIDADA FORMA REDUCIDA

Nicotinamida adenina dinucleótido NAD+ NADH

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A medida que va transcurriendo la reacción, llega un

momento en que el sustrato u otro reactivo se van agotando
(fase de agotamiento de sustrato) y la velocidad de reacción
disminuye hasta anularse.

Fase lineal en la que la formación de producto permanece constante,

Absorbancia

siendo la concentración de enzima de la muestra es el único factor

limitante. Es aquí donde se debe medir la actividad enzimática.

Pendiente = Velocidad = ΔA/ΔT

ΔA/min
La fase de retraso tiene lugar inmediatamente después de mezclar los
reactivos con la muestra biológica. Es una fase de encuentro y
acoplamiento de sustrato y enzima. Su duración es muy variable
(segundos a minutos).

En una reacción enzimática podemos

diferenciar tres fases:
Fase de agotamiento de sustrato

REDUCCIÓN
DEL NAD

Fase lineal

ABSORBANCIA DEL
PRODUCTO

Fase de retraso

TIEMPO

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En una reacción enzimática podemos

diferenciar tres fases:
Fase de retraso
OXIDACIÓN
ABSORBANCIA DEL
SUSTRATO
DEL NAD

Fase lineal

Fase de agotamiento

TIEMPO

Los métodos analíticos para determinar

La actividad enzimática y por tanto el ΔA/min
puede ser:
1.- DE DOS PUNTOS
• Se ponen en contacto los
ABSORBANCIA
reactivos y la muestra biológica y
tras un periodo de incubación que
supere la fase de retardo se mide
la absorbancia.
•Al cabo de un tiempo establecido
se vuelve a medir la absorbancia.
•Este tipo de técnica tiene el
inconveniente de suponer que la
reacción es lineal, lo que no
ocurre siempre.

Los métodos analíticos para determinar la actividad enzimática y por tanto

el ΔA/min pueden ser:

TIEMPO

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2.- MÉTODO CINÉTICO

Consiste en medir la absorbancia varias
veces con intervalos de minutos
Permite comprobar que realmente estás en
la zona lineal de la curva , zona ideal para la
ABSORBANCIA
determinación

TIEMPO

Unidad Internacional (U)

Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la

cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol
Inserte contenido
de sustrato en un minuto en condiciones estandar
previamente establecidas. La actividad específica es el
número de unidades de enzima por miligramo de proteína
(U/mg prot) o por unidad de volumen (U/ml, U/L ……).
U = µmol/minuto
1 mU = 10-3 U

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Unidad microKat (µkat)

Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI)

ha definido la unidad de actividad enzimática como la
cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por
Inserte contenido

segundo. Esta unidad se llama katal.(kat). Como 1 mol son

106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1
katal equivale a 60 x 106U. Esta unidad es muy grande, de
forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos
como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-
9 kat).

En definitiva, ya sabemos la fase en la que hemos de trabajar, que parámetro obtenemos experimentalmente y
como lo obtenemos pero ¿cómo convertimos ΔA/min en UI/L?

Para obtener el valor definitivo de actividad enzimática aplicamos la siguiente

fórmula:

· Vf es el volumen
total de reacción

· Vi es el volumen de
muestra en el ensayo
·ε es el coeficiente de extinción molar de aquel compuesto
cuya absorbancia estamos siguiendo en el espectrofotómetro.

l es el espesor de la cubeta

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Coeficiente de extinción molar (ε):

Es un parámetro que define la absorción de luz de una sustancia a una longitud de onda especifica por unidad de
concentración molar.
La absorción molar se expresa como cm-1.mol-1.

Así definimos ε como la absorción de 1 cm de paso óptico de una disolución 1 M de la sustancia en estudio

el NADH tiene un Ԑ a 340 nm de 6.22 x 103 cm-1 mol-1

Para un determinado ensayo todos los parámetros que aparecen en rojo

son constantes por tanto dela fórmula anterior podemos quedar como:

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ANALICEMOS UN INSERTO

30 seg

1 minuto
ABSORBANCIA

1 minuto

1 minuto

TIEMPO

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ABSORBANCIA
TIEMPO

ΔA/min= 0.050

UI/L = 0.050X 8095

UI/L = 404.75

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Ejercicio de aplicación

ABSORBANCIA A 340 nm

1 minuto

1 minuto

1 minuto

3 minutos

TIEMPO

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DATOS:
ABS. 1 = 0.140
ABS. 2 = 0.210
ABS. 3 = 0.290
ABS. 4 = 0.370

ABSORBANCIA A 340 nm

TIEMPO

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Reacción química y cálculo de: TGO

Reacción química y cálculo de: TGO

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Reacción química y cálculo de: TGO

Reacción química y cálculo de: Fosfatasa alcalina.

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Reacción química y cálculo de: Fosfatasa alcalina.

Reacción química y cálculo de: Fosfatasa alcalina.

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Reacción química y cálculo de: CPK-MB

Reacción química y cálculo de: CPK-MB

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PRINCIPALES ENZIMAS EMPLEADA EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO:

Enzima sérica Uso diagnóstico

Aminotranferasas Inf. Miocardio/ Hepatitis
Amilasa Pancreatitis aguda
Ceruloplasmina Degeneración hepática
Creatincinasa Trastornos musculares
G-GlutamilTraspeptidasa Enf. Hepáticas.
Lactato deshidrogenasa Infarto al miocardio.
Lipasa Pancreatitis aguda.
Fosfatasa Ácida Cáncer a la próstata.
Fosfatasa Alcalina Enf. óseas y hepáticas.

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