Uso de la cromatografía en capa fina para la separación de

aminoácidos y detección mediante la reacción con ninhidrina.

Miriam G. Morán (21187)

Universidad del Valle de Guatemala, Facultad de Ciencias y Humanidades, Departamento

de Bioquímica. Curso Bioquímica de macromolécula, Carrera Química Farmacéutica.

Resumen

La identificación y/o caracterización de aminoácidos, es de suma importancia en los

análisis de mezclas biológicas; esto se logra realizar por medio de la cromatografía, técnica
que utiliza la diferencia de las propiedades químicas de los analitos en una muestra, para
separarlos y posteriormente, identificarlos (Roberts & Caserio, 2021). En la presente
práctica, se delimitó como objetivo la caracterización de aminoácidos en una muestra
desconocida, a través de cromatografía de capa fina, y luego, una reacción de ninhidrina
que los revelara para calcular sus factores de retención. Esto se cumplió de manera
satisfactoria, obteniendo dos Rf de la muestra desconocida: 0.22 y 0.66, los cuales se
trataron de arginina y glicina respectivamente; esto se determinó gracias a los valores R f de
los estándares empleados de dichas sustancias. Asimismo, las características físicas de las
manchas de la muestra presentes en la placa, también coincidieron con las manchas de los
estándares de los aminoácidos. Por otra parte, el estándar de ácido aspártico resultó con un
número de 0.69, y este comportamiento no fue el esperado. A raíz de esto, en futuras
experimentaciones, se recomienda hacer uso de un solvente menos básico que el empleado
en la práctica, y así, disminuir la afinidad del ácido aspártico con la fase móvil y promover
una mejor separación.

Palabras clave: CCF, ninnhidrina, glicina, arginina, coeficiente de partición

Introducción presentan con el material para la

Los aminoácidos son la unidad básica
que conforman las proteínas, jugando así,
un papel fundamental en el organismo.
Debido a esto, la caracterización de
aminoácidos es recurrente en diversos
análisis de mezclas biológicas; dicha
identificación se puede llevar a cabo a
través de la cromatografía, la cual se
define como un método de análisis
químico que permite la separación de
analitos en una muestra (Roberts &
Caserio, 2021). La separación depende de
su fundamento químico, que se basa en
las diferencias de las propiedades
químicas de los compuestos que
separación, como por ejemplo:
solubilidad, tamaño, forma, carga, y
afinidad con otras sustancias (Luján,
2017). La cromatografía en general se
divide en dos fases, la estacionaria y
móvil; la primera, es la parte del sistema
que se mantiene fija, mientras que la
segunda, se encarga de arrastrar el analito
de la muestra a lo largo de la fase
estacionaria (Gottlieb & Hosfelt, 2020).
En el caso de la separación de
aminoácidos, una técnica efectiva es la
cromatografía en capa fina. El principio
químico de dicha técnica, se basa en la
afinidad de los componentes de la
muestra, con la fase estacionaria sólida
(placa) y la fase móvil de un solvente. Las
sustancias recorren la placa al ser
arrastradas por el solvente con capilaridad
en la placa; y, puesto que, cada una de
ellas presenta diferente afinidad, se
movilizan a diferente ritmo, lo cual
provoca que se separen y se establecen en
un lugar en específico respecto a la
posición del solvente (Merck, 2020). A
partir de ello, se calculan los coeficientes
de partición, Rf, de cada uno; esto al
dividir la distancia recorrida por la
sustancia entre la distancia que viajó el
solvente. Este dato permite la
identificación de los componentes de la
muestra, al ser comparados con
estándares de los mismos (Jain et al.,
2021).
Materiales y métodos
La presente práctica se basó en la
separación e identificación de los
aminoácidos presentes en una muestra
desconocida, a través de cromatografía de
capa fina (CCF) y a su vez, el cálculo de
los factores de retención Rf de cada
sustancia. Para ello, también se realizó
una reacción de ninhidrina y así, revelar
los aminoácidos. Como material
biológico se emplearon estándares de
glicina, arginina, ácido aspártico, todas al
2%, y una solución de composición
desconocida. Por otra parte, los reactivos
fueron, una mezcla de alcohol
etílico:hidróxido de amonio al 34% y
proporción 7:3, una solución de
ninhidrina en acetona, y las placas de
sílica gel para cromatografía. Se siguió el
procedimiento según la guía Jorrín, J.,
Díaz, N., & Bárcena, J. (2016).
“Separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina y detección
mediante reacción con ninhidrina”.
Universidad de Córdova.
Como primer paso, se marcó una línea
con lápiz en la placa de sílica gel, a 0.5
cm del margen, y en esta, se dibujaron
cuatro puntos separados. Cabe destacar
que en todo momento se utilizaron
guantes para manipular la placa. Luego,
en la placa y con un capilar, se agregaron
3 gotas de glicina, arginina y ácido
aspártico, cada una en las primeras tres
marcas de la línea, y después, 1 gota de la
solución de aminoácidos desconocidos.
Posteriormente, la placa se colocó en un
beaker de 250 mL, y se agregó
aproximadamente 10 mL de la mezcla
alcohol etílico:hidróxido de amonio al
34% (7:3), procurando que este no se
pusiera en contacto con la línea dibujada
en la placa. Después, se tapó el beaker
con papel aluminio y se dejó reposando
en la campana de extracción durante 20
minutos.
Una vez pasados los 20 minutos, se sacó
la placa del beaker, se marcó con lápiz la
distancia que recorrió el solvente y se
procedió a dejar secando la placa durante
2-3 minutos. Seguidamente, se agregó
ninhidrina con un asperjador y se utilizó
una secadora para revelar las manchas de
los aminoácidos que recorrieron la placa.
Finalmente, se midieron las distancias
recorridas para calcular el factor de
retención de las sustancias e identificar
los aminoácidos presentes en la muestra
desconocida.
Resultados

Cuadro 1. Factores de retención.

Sustancia Rf
Glicina 0.66
Arginina 0.22
Ácido aspártico 0.69
Muestra desconocida “Punto A”* 0.22
Muestra desconocida “Punto B”* 0.66
*Punto A hace referencia a la primera mancha de la
mx desconocida y Punto B a la segunda (Figura 1).
Rf = distancia recorrida por analito/distancia recorrida por solvente.

Figura 1. Placa de cromatografía.

con los valores de los estándares
Discusión utilizados (Cuadro 1).

Como objetivo principal de la práctica se
estableció la identificación de los
aminoácidos desconocidos en una
muestra por medio de cromatografía de
capa fina, acoplada con la reacción de
ninhidrina que permitiera observar las
manchas, y así, calcular los Rf de las
respectivas sustancias. Dicho objetivo se
cumplió de manera satisfactoria, logrando
identificar la glicina y arginina en la
muestra, y calculando los factores de
retención resultaron en 0.66 y 0.22
respectivamente, los cuales coincidieron
Al igual que los números Rf, las
características físicas de las manchas
resultaron similares entre los mismos
compuestos (Figura 1). En el caso de la
glicina, se trató de una mancha circular
grande de pigmento rojizo-amarillento,
con un borde morado. En cuanto a la
arginina, la mancha se presentó pequeña,
de color blanco y también borde morado.
El ácido aspártico se demostró como un
“derrame” y una línea vertical.

El comportamiento del movimiento de los
aminoácidos si fue el esperado en el caso
de la glicina y arginina; la glicina recorrió
una amplia distancia debido a su poca
afinidad con la placa, siendo la glicina
apolar y el sílica gel polar; asimismo, la
glicina es conocida por ser el aminoácido
más pequeño, siendo fácil su movimiento
(NCBI, 2023). Por otro lado, la arginina
recorrió una corta distancia, debido a que
su estructura es más grande y presenta
afinidad con la placa, puesto que ambas
se tratan de sustancias polares (Pommié et
al., 2004).
Por otra parte, al ácido aspártico se le
calculó un factor de retención de 0.69,
siendo más grande que el valor de la
glicina. Dicho comportamiento no fue el
esperado, debido a que el ácido aspártico
presenta una estructura más grande que la
glicina, y es una molécula de naturaleza
polar, siendo afín a la placa (Pommié et
al., 2004). A raíz de esto se identificó que
la principal fuente de error se encontró en
la fase móvil empleada, ya que, siendo
esta una mezcla básica con etanol,
posiblemente aumentó la afinidad con el
ácido aspártico.
A partir de lo mencionado anteriormente,
en caso de futuras experimentaciones, se
recomienda utilizar un solvente diferente
y menos básico, con el propósito de
disminuir la afinidad con el ácido
aspártico y promover una mejor
separación de los aminoácidos. Una
alternativa viable podría ser una mezcla
de etanol, etilenglicol, y acetona en una
proporción de 5:3:1 (Mohammad et al.,
2013).
Conclusión
1. El objetivo principal de la práctica fue
cumplido satisfactoriamente,
identificando los aminoácidos
desconocidos de una muestra a través de
cromatografía de capa fina y la reacción
de ninhidrina.
2. Los aminoácidos presentes en la
muestra fueron la glicina y arginina,
puesto que los factores de retención en la
muestra resultaron de 0.66 y 0.22
respectivamente, coincidiendo con los Rf
de los estándares utilizados.
3. El tamaño, color y forma de los
aminoácidos en la muestra también
manifestaron ser iguales a las
características de las manchas de los
estándares.
4. La arginina no recorrió una mayor
distancia; mientras que, la glicina sí se
movió significativamente en la placa
cromatográfica.
5. El ácido aspártico se movilizó más de
lo esperado, con un Rf de 0.69 (mayor al
valor de la glicina). Esto se consideró que
sucedió por cierta afinidad con la fase
móvil.
6. En caso de próximas
experimentaciones, se recomienda
emplear un solvente menos básico, con el
propósito de delimitar la afinidad que este
presentó con el ácido aspártico.
Referencias
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