BIOQUÍMICA

Ing. Biotecnológica.

Bioquímica
Ing. Biotecnológica

Marily Milena Duarte Guevara

Código 1611610

Andrea Mayerli Franco García

Código 1611613

Nayely Yuliana Contreras Moreno

Código 1611615

Informe de Bioquímica Cromatografía de aminoácidos y

pigmentos verdes

M.Sc. Edgar Rincón Villamizar

14 de noviembre 2019

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 1. CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS Y PIGMENTOS
VERDES

PRÁCTICA DE CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS Y PIGMENTOS VERDES

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1.1 Introducción

La cromatografía es una técnica que permite separar mezclas de sustancias. En ella siempre
hay una fase móvil (en este caso etanol) y una fase estacionaria (en este caso papel de filtro);
la mezcla de pigmentos se distribuye entre las dos fases según su afinidad química, lo que
permite separar sus componentes porque cada uno se desplaza a distinta velocidad.

La cromatografía es un método de análisis que permite separar, aislar e identificar componentes

estrechamente relacionados presentes en mezclas complejos. Existen diferentes tipos
cromatografía en los cuales se utilizan una fase móvil y una fase estacionaria. De acuerdo a los
tipos de fase estacionaria y móvil, los tipos de cromatografía pueden ser: en papel, en capa fina,
gas, líquido, en gel y de afinidad. En la cromatografía en papel para la separación de los
aminoácidos, los solventes utilizados son mezclas de agua, alcoholes y ácidos o bases. El papel
filtro utilizados sirve de soporte al componente más polar del solvente (agua) formando así la
fase estacionaria. Los componentes menos polares del solvente (alcohol y ácido acético)
constituyen la fase móvil que arrastra diferencialmente las moléculas disueltas en la fase
estacionaria. Durante el proceso cromatográfico los aminoácidos son separados de acuerdo a su
afinidad con la fase estacionaria o la fase móvil. Para permitir la visualización de los aminoácidos
separados se hace uso de un “revelador” como es la ninhidrina, la que reacciona con los alfa-
aminoácidos libres o combinados, formando un compuesto de color azul (con excepción de la
prolina e hidroxiprolina que forman un compuesto de color amarillo), que permite identificar a los
aminoácidos al ser comprados con un estándar apropiado. También en el valor Rf, es la relación
entre la distancia recorrido por un aminoácidos y la distancia que viaja el frente del solvente,

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medidas ambas desde el punto de aplicación de la muestra, es de utilidad para la identificación
de los aminoácidos.
La cromatografía es la técnica de separación de las sustancias presentes en una mezcla,
aprovechando la mayor o menor afinidad por un disolvente que recorre una columna de resinas
o papel. El arrastre que ejerce el disolvente sobre los distintos compuestos hace que éstos se
desplacen con distinta velocidad, separándose poco a poco. Utilizaremos aquí la cromatografía
de papel. Los pigmentos disueltos en un líquido (alcohol etílico) ascienden por capilaridad en un
material poroso (papel) de tal forma que los que tienen un mayor tamaño ascenderán más
despacio que aquellos que sean más pequeños. En los cloroplastos de las hojas, las plantas
utilizan la luz solar para transformar la materia inorgánica (dióxido de carbono, agua y s.
minerales) en materia orgánica necesaria para alimentar al resto de la planta. Además de las
clorofilas, otros pigmentos están presentes en los vegetales para colaborar en la captación de
energía. Entre ellos destacaremos a los carotenos, xantofilas, antocianos, etc. Estos pigmentos
son sustancias coloreadas y son las responsables del color de las hojas (verde si tienen una gran
actividad fotosintética o amarillo, rojo o marrón cuando disminuye dicha actividad).

1.2. Objetivos

 Llevar a cabo la separación de aminoácidos mediante la aplicación del método

indicado, usando papel filtro.
 Extraer e identificar los diferentes pigmentos que hay en los vegetales.
1.3. Métodos

Para el laboratorio de cromatografía de aminoácidos, se corta un papel de filtro en forma

cuadrada, en un extremo de esta se hace una línea con un lápiz mina 2H a 0,5 cm de distancia,
debajo de la línea se marca con el mismo lápiz, M1, M2, M3, M4 correspondiente al lugar donde
se van a colocar una gota de los diferentes aminoácidos (Creatina, Lisina, Glicina, punto con
mina de lapicero color rojo), se utiliza un tubo capilar para aplicar la muestra de aminoácidos al
papel filtro, (una gota), se seca la muestra dentro de la campana extractora de gases y se rocía
con un atomizador que contiene una solución reveladora (Ninhidrina), la placa se secara

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haciéndole llegar aire caliente del secador de cabello hasta que aparezcan una manchas de
color, que representar el lugar donde se encuentran los aminoácidos que reaccionaron con la
Ninhidrina.
Para la práctica de cromatografía de pigmentos verdes, se procedió a lavar las hojas de espinaca
con agua, luego se colocaron en un mortero las hojas de espinaca en trozos, eliminado las
terminaciones nerviosas, y se le añadió 10 ml de alcohol etílico. Triturar las hojas en el mortero
hasta que adquiera un color verde, adicionar arena lavada para mejorar la extracción de
pigmentos verdes, filtrar en un colador de tela y recoger el filtrado en la placa de Petri, cortar el
papel filtro en forma de cuadrado, doblar el cuadrado en forma de V para que se mantenga en
pie sobre la placa de Petri, dejar reposando unos 30 minutos y observar.

1.3.1 Materiales

Los materiales utilizados en la práctica de laboratorio de cromatografía de aminoácidos son,

papel filtro Watman Qualitative, vaso de precipitado de 200 ml, vidrio reloj, tijeras, goteros,
secador (para aplicar calor), tubo capilar, probetas de 50 ml, pipeta de 1 ml, muestras de
aminoácidos: Creatina, Lisina, Glicina, tinta de lapicero (rojo); fase móvil, mezcla de Butanol,
Ácido acético, agua (8:2:2), solución de Ninhidrina (0,2 gr), agua destilada (100 ml).

Los materiales utilizados en la práctica de laboratorio de cromatografía de pigmentos verdes son,

mortero, tijeras, papel filtro, colador de tela, alcohol antiséptico (70°), arena lavada, placa de Petri,
vaso de precipitado; material biológico, hojas de espinaca (Spinacia oleracea).

1.3.2 Resultados

AQUÍ VA LO QUE USTED ESTA ESCRIBIENDO

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 Aminoácidos Distancia recorrida (cm) Rf Rf teórico
Lisina 1.5 0.18 0.14
Glicina 3 0.3 0.26
Tinta lapicero 6.5 0.8

Tabla 1. Valores teóricos de Rf de los aminoácidos

En la tabla 1 están los valores de factor de retención, teóricos y los obtenidos durante la práctica
para dos de los tres aminoácidos, debido que el aminoácido Creatinina, no nos mostró alguna
reacción, se muestra un margen de error medio, debido a la fase estacionaria de la placa o por
la cantidad de muestra aplicada.

En la práctica de cromatografía de pigmentos verdes, se observó la degradación de pigmentos

verdes, al romper las células en el mortero los pigmentos que estaban dentro de ellas pasan al
alcohol etílico, en la disolución obtenida del vegetal se verán la misma cantidad de pigmentos
como líneas de diferentes colores, en el papel se observan 4 líneas diferentes que corresponden
a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes en las hojas de espinaca (Spinacia oleracea).
La separación se produce en una hoja de papel de filtro colocada sobre la placa, en donde el
pigmento más soluble en el alcohol será el que forme una línea coloreada en la parte superior del
papel, y el menos soluble en el alcohol será el último en ascender a través del papel.

Pigmentos fotosintéticos Distancia recorrida (cm) Rf Rf teórico

Carotenos 7.3 1.04
Xantofilas 1.4 0.2 0.8
Clorofila a 0.3 0.04 0.5
Clorofila B 0.0 0.0 0.0
Tabla 2. Resultados de la cromatografía en papel.

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En la tabla 2 se observa la distancia recorrida y el factor de retención (Rf), además del valor
teórico de Rf en donde se puede apreciar que el margen de error para las xantofilas y la clorofila
a es elevado esto depende del tipo de vegetal con el que se trabaje.

Figura 1. Pigmentación en el papel filtro Figura 2. Pigmentación de hojas de espinaca

Figura 3. Pigmentos fotosintéticos

1.4. Cuestionario

1.4.1 Cuestionario cromatografía de aminoácidos

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 1. Los aminoácidos son sustancias que dependiendo del valor del potencial de hidrogeno se
comportan de manera diferente. ¿Cuál es el valor del potencial de hidrogeno de la fase móvil?

RTA. El valor del potencial de hidrogeno de la fase móvil debe tener un potencial de hidrogeno
de 2-8, este no debe superar el pK de los aminoácidos.

2. ¿En qué forma se encuentran los aminoácidos en el potencial de hidrogeno de trabajo?

RTA. El pH inferior a su pK existirá un gran número de cargas positivas debido a la

protonación de los grupos disociables de los aminoácidos.

3. ¿Es posible explicar la elusión de los aminoácidos en función de su peso molecular?

RTA. No, debido a que la elusión de los aminoácidos se ve determinada por el pH.

4. ¿Es posible llevar a cabo esta técnica por cromatografía en papel?

RTA. Si, en 1994 Consden, Gordon y Martin introdujeron esta técnica con el fin de facilitar
la rápida interpretación de los cromatograma.

5. ¿Existen otros reveladores aparte de la Ninhidrina para revelar las posiciones de los
analitos analizados en esta práctica?

RTA. Si,
 Vapores de Yodo sublimado (revelador universal)
 Fluorescamina

1.4.2 Cuestionario cromatografía de pigmentos verdes

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 1. Señala y nombra los pigmentos separados en la tira de papel
RTA.

2. ¿Por qué se separan los pigmentos?

RTA. Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad, lo cual permite su
separación usando una solución de la misma asciende por capilaridad por una tira de papel de
filtro, ya que las más solubles se desplazaran a mayor velocidad, pues acompañaran fácilmente
el disolvente a medida que este va ascendiendo. De esta forma, al cabo de cierto tiempo, a lo
largo del papel de filtro se irán situando distintos pigmentos en forma de bandas o líneas
coloreadas, tanto más desplazadas cuanto más solubles sean los pigmentos a que pertenecen y
tanto más anchas cuanto mayor sea la abundancia de estos en la mezcla.

3. ¿Cuál es la función de los pigmentos en las plantas?

RTA. La función principal de los pigmentos en las plantas es la fotosíntesis, que utiliza la clorofila,
un pigmento verde junto con otros pigmentos rojos y amarillos, que ayudan a captar la mayor
cantidad de energía luminosa posible

4. Las flores también son estructuras pigmentadas. ¿Qué función tienen estos pigmentos?
RTA. Las funciones de los pigmentos en las plantas incluyen la atracción de los insectos a las
flores, fomentando la polinización.

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 5. Calcular el Rf de cada uno de los puntos obtenidos
RTA.

6. Haz un dibujo del cromatograma, pon el nombre del pigmento que corresponde a cada
banda coloreada, sabiendo que la velocidad de difusión de cada uno de ellos es la
siguiente de mayor a menor: caroteno, xantofila, clorofila a, clorofila b.
RTA.

7. ¿Por qué empleamos alcohol para extraer la clorofila?

RTA. Por que son solubles en solventes orgánicos como el alcohol etílico y acetona. Esta
afinidad química entre el alcohol y la clorofila permite entonces disolver la clorofila que se
encuentra en las membranas y poder extraerlas con facilidad.

8. ¿Qué pigmentos son los más abundantes? ¿Cuáles se disuelven mejor en el alcohol?

RTA. La clorofila "a" es la más abundante, y posiblemente el que mejor se disuelva a la vez por
ello sus pigmentos son más abundantes.

9. Si añadiésemos benceno a la solución alcohólica inicial, el benceno se teñiría de verde y

la solución alcohólica quedaría de color amarillo naranja. ¿Qué nos indicaría esto?

RTA. El color de cada compuesto nos indica su función en la reacción, el color verde del benceno

nos indica que actúa en forma de base, o genera una base para la reacción, mientras que el color

amarillo-naranja que puede tener el alcohol nos indica que el mismo está trabajando como ácido,

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de tal manera que deba existir un balance, es decir que la clorofila se quedaría en el benceno,

mientras que la solución alcohólica se quedaría con el caroteno y la xantofila.

1.5 Conclusiones

Se obtuvieron los pigmentos fotosintéticos de la clorofila, que son los que le dan color a las hojas
de las plantas, ya que la fotosíntesis es un proceso que permite a los vegetales obtener materia
y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se logró observar cómo cambian
las tonalidades de estos pigmentos fotosintéticos que componen a las plantas y se encuentran
en los cloroplastos de la célula vegetal y les dan color a reflejar la luz, además se aprendió a
distinguir diferentes tipos de colores y a utilizar aspectos importantes en el laboratorio que nos
van dejar buenos aprendizajes para bioquímica.

Entre todos los caracteres más externos de los vegetales, el más notable y característico es
probablemente el color. El color no es únicamente un carácter llamativo de la vegetación, sino
que, además, algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a las
actividades fisiológicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cómo las plantas viven
y se desarrollan requiere el previo conocimiento de los pigmentos vegetales

Referencias

https://www.scribd.com/doc/16675209/6-EXTRACCION-Y-SEPARACION-DE-PIGMENTOS-VEGETALES

http://pablolaboratoriocvv.blogspot.com/2018/12/practica-10-separacion-de-pigmentos.html

http://www.quimica2011.es/sites/default/files/cromatografia_color.pdf

https://adciesparquegoya.files.wordpress.com/2014/05/separacic3b3n-pigmentos-vegetales-
cromatografc3ada.pdf

Quirós, M. B. (1995). Mecanismos Y Aplicaciones de la Cromatografía Líquida de Alto

Desempeño. En M. B. Quirós, Mecanismos Y Aplicaciones de la Cromatografía Líquida de Alto
Desempeño Costa Rica: Universidad Costa Rica.

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