ACTIVIDADES BIOCIDAS (17-5-2019)

CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ABE DE LAS PIELECILLAS DEL CAFÉ

1. Autohidrólisis en el reactor

Biomasa (% p/p) Temperatura (°C) Tiempo (min)

20 170 20

Masa total en el reactor: 80 g café + 320 g agua.

Nota: Preparar una cantidad suficiente para que en el gas stripping del último paso haya unos 500 ml de muestra.

2. Hidrólisis enzimática

Para cada fracción aproximada de 100 g de muestra (mezcla de sólidos y líquidos), añadimos estos reactivos:
 0,96 g de ácido cítrico.
 Ajustamos el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40% o de HCl concentrado.
 580 µl de la enzima Cellic CTec2 (o lo equivalente a 3,6 FPU/g pieles de café).
Incubamos a 50 °C durante unas 68-72 h, con una agitación de 180 rpm.

3. Fermentación

3.1. Inóculos

 Se prepara una botella de 50 ml de medio líquido con 19 g/l de RCM y 10 g/l de glucosa.
 Se introducen en cada botella 125 µl de esporas de la cepa Clostridium beijerinckii CECT 508.
 Se somete la botella a un choque térmico (2 min a 80 °C en un baño de agua y 5 min en hielo).
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min en el espacio de cabezas.
 Se incuban las botellas a 35 °C durante 20-24 h.
 Se comprueba que la densidad celular ha alcanzado aproximadamente 5·10 8 células/ml (o simplemente se
comprueba que el inóculo está turbio y tiene espuma).

3.2. Fermentación

 El hidrolizado de pieles de café se filtra (con la media o con un filtro de papel) y se centrifuga a 3000 rpm
durante 10 min.
 A cada botella se le añaden los nutrientes correspondientes de la Tabla 1.
 Se ajusta el pH inicial a 5,59.
 Se inocula un 3% (v/v) de bacterias.
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban las botellas a 34 °C y 100 rpm durante 96 h.
También hay que preparar un control para la cepa con aproximadamente 24 g/l glucosa, 11 g/l xilosa y los nutrientes
de la Tabla 1.

Tabla 1. Nutrientes para la fermentación del hidrolizado de pielecillas de café.

Concentración (g/l)
Compuesto Hidrolizado de café Control
Extracto de levadura 1 1
KH2PO4 0,5 0,5
K2HPO4 0,5 0,5
NH4Cl 2,1 2,1
CaCO3 7,55 5
MgSO4·7H2O 0,2 0,2
FeSO4·7H2O 0,01 0,01
Cisteína 0,5 0,5

4. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 60
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 5
Tiempo (h) 4

Bibliografía
Microbial Cell Factories (2018) 17: 154. https://doi.org/10.1186/s12934-018-1002-z.
Chemical Engineering Transactions (2018) 64: 37-42. https://doi.org/10.3303/CET1864007.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ABE DE LOS RESIDUOS DE MANZANA DE ZUMO (WASTE2FUELS)

1. Autohidrólisis en el reactor

Biomasa (% p/p) Temperatura (°C) Tiempo (min)

10 142 12

Masa total en el reactor: 80 g manzana + 320 g agua.

Nota: Preparar una cantidad suficiente para que en el gas stripping del último paso haya unos 500 ml de muestra.

2. Hidrólisis enzimática

Para cada fracción aproximada de 100 g de muestra (mezcla de sólidos y líquidos), añadimos estos reactivos:
 0,96 g de ácido cítrico.
 Ajustamos el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40% o de HCl concentrado.
 290 µl de la enzima Cellic CTec2 (o lo equivalente a 3,6 FPU/g manzana).
Incubamos a 50 °C durante unas 48 h, con una agitación de 180 rpm.

3. Fermentación

3.1. Inóculos

 Se prepara una botella de 50 ml de medio líquido con 19 g/l de RCM y 10 g/l de glucosa.
 Se introducen en cada botella 125 µl de esporas de la cepa Clostridium beijerinckii CECT 508.
 Se somete la botella a un choque térmico (2 min a 80 °C en un baño de agua y 5 min en hielo).
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min en el espacio de cabezas.
 Se incuban las botellas a 35 °C durante 20-24 h.
 Se comprueba que la densidad celular ha alcanzado aproximadamente 5·10 8 células/ml (o simplemente se
comprueba que el inóculo está turbio y tiene espuma).

3.2. Fermentación

 El hidrolizado de manzana se filtra (con la media o con un filtro de papel) y se centrifuga a 3000 rpm durante
10 min en el caso de que se haya filtrado con la media.
 Al hidrolizado se le añaden los nutrientes de la Tabla 1.
 Se ajusta el pH inicial a 6,00.
 Se inocula un 3% (v/v) de bacterias.
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban las botellas a 35 °C y 100 rpm durante 96 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con aproximadamente 29 g/l glucosa, 15 g/l xilosa y los
nutrientes de la Tabla 1.

Tabla 1. Nutrientes para la fermentación del hidrolizado de residuos de manzana.

Concentración
Compuesto
(g/l)
Extracto de levadura 5 Autoclavar
KH2PO4 0,5
K2HPO4 0,5
NH4Cl 2,1
CaCO3 5
MgSO4·7H2O 0,2 Filtrar
FeSO4·7H2O 0,01
Cisteína 0,5

4. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 60
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 5
Tiempo (h) 4

Bibliografía
Applied Microbiology and Biotechnology (2017) 101: 8041–8052. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8522-z.
Chemical Engineering Transactions (2018) 64: 37-42. https://doi.org/10.3303/CET1864007.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE LOS RESIDUOS DE MANZANA DE ZUMO
(WASTE2FUELS)

1. Autohidrólisis en el autoclave

Biomasa (% p/p) Temperatura (°C) Tiempo (min)

30 121 20

En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, se introducen 30 g de manzana seca y 70 g de agua destilada.

Nota: Preparar una cantidad suficiente para que en el gas stripping del último paso haya unos 500 ml de muestra.

2. Hidrólisis enzimática

Para cada fracción aproximada de 100 g de muestra (mezcla de sólidos y líquidos), añadimos estos reactivos:
 0,96 g de ácido cítrico.
 Ajustamos el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40% o de HCl concentrado.
 1080 µl de la enzima Cellic CTec2 (o lo equivalente a 3,6 FPU/g manzana).
 300 µl de la enzima Viscozyme L (o lo equivalente a 0,41 CMC/g manzana).
Incubamos a 50 °C durante unas 48 h, con una agitación de 180 rpm.

3. Fermentación

3.1. Inóculos

 Se prepara un medio de cultivo sólido en placas de Petri con 10 g L -1 glucosa, 3 g L-1 extracto de levadura, 3
g L-1 extracto de malta, 5 g L-1 peptona de soja y 20 g L -1 agar, y se siembra con la levadura Saccharomyces
cerevisiae Ethanol Red® conservada en glicerol. Se incuba en condiciones aerobias a 20°C hasta la
aparición de colonias de 1-2 mm.
 Se introduce/n una/s colonia/s de la placa en un matraz de 100 mL que contiene 50 mL del mismo medio
nutritivo anterior (pero sin agar). Se cierra el matraz con un tapón de espuma y se incuba a 30 °C y 150 rpm
durante 7-24 h hasta que la densidad celular sea de 1·10 8 células mL-1.

3.2. Fermentación

 El hidrolizado de manzana se usa tal cual, sin filtrar, centrifugar, esterilizar ni añadir nutrientes.
 Se ajusta el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40%.
 Se inocula un 3% (v/v) de levaduras.
 Se realiza la fermentación con 50 ml de hidrolizado de manzana en matraces de 100 ml tapados con tapones
de espuma. Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban los matraces en condiciones aerobias a 30°C y 150 rpm durante 72 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con aproximadamente 29 g/l glucosa, 15 g/l xilosa y los
nutrientes de la Tabla 1.
 Se prepara un control de la fermentación con 82 g L -1 glucosa, 70 g L-1 xilosa, 20 g L-1 extracto de levadura y
2,69 g L-1 KH2PO4. Se justa el pH a 5,0.

4. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 70
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 0
Tiempo (h) 4

Bibliografía
Fermentación alcohólica: Artículo de la manzana de Mari Cruz.
Gas stripping: Artículo de la manzana de Mari Cruz.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ABE DE LA PIEL DE PATATA (WASTE2FUELS)

1. Autohidrólisis en el reactor

Biomasa (% p/p) Temperatura (°C) Tiempo (min)

10 140 56

Masa total en el reactor: 80 g piel de patata + 320 g agua.

Nota: Preparar una cantidad suficiente para que en el gas stripping del último paso haya unos 500 ml de muestra.

2. Hidrólisis enzimática

Para cada fracción aproximada de 100 g de muestra (mezcla de sólidos y líquidos), añadimos estos reactivos:
 0,96 g de ácido cítrico.
 Ajustamos el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40% o de HCl concentrado.
 290 µl de la enzima Cellic CTec2 (o lo equivalente a 3,6 FPU/g piel de patata).
 100 µl de la enzima Spirizyme Fuel (o lo equivalente a 2,26 mg proteína/g piel de patata).
Incubamos a 50 °C durante unas 68-72 h, con una agitación de 180 rpm.

3. Fermentación

3.1. Inóculos

 Se prepara una botella de 50 ml de medio líquido con 19 g/l de RCM y 10 g/l de glucosa.
 Se introducen en cada botella 125 µl de esporas de la cepa Clostridium saccharoperbutylacetonicum DSM
2152. Nota: En algunas ocasiones esta cepa también se ha cultivado en medio de patata.
 Se somete la botella a un choque térmico (2 min a 80 °C en un baño de agua y 5 min en hielo).
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min en el espacio de cabezas.
 Se incuban las botellas a 35 °C durante 20-24 h.
 Se comprueba que la densidad celular ha alcanzado aproximadamente 5·10 8 células/ml (o simplemente se
comprueba que el inóculo está turbio y tiene espuma).

3.2. Fermentación

 El hidrolizado de piel de patata con la media y se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min.
 Al hidrolizado se le añaden los nutrientes de la Tabla 1.
 Se ajusta el pH inicial a 6,00.
 Se inocula un 3% (v/v) de bacterias.
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban las botellas a 35 °C y 100 rpm durante 120 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con aproximadamente 29 g/l glucosa, 15 g/l xilosa y los
nutrientes de la Tabla 1.

Tabla 1. Nutrientes para la fermentación del hidrolizado de pieles de patata.

Concentración
Compuesto
(g/l)
Extracto de levadura 5 Autoclavar
KH2PO4 0,5
K2HPO4 0,5
NH4Cl 2,1
CaCO3 5
MgSO4·7H2O 0,2 Filtrar
FeSO4·7H2O 0,01
Cisteína 0,5

4. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 60
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 5
Tiempo (h) 4

Bibliografía
New Biotechnology (2018) 46: 54-60. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2018.07.002.
Chemical Engineering Transactions (2018) 64: 37-42. https://doi.org/10.3303/CET1864007.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ABE DE LA PAJA DE MAÍZ (AGROCYCLE)

1. Hidrólisis ácida en el reactor

Tiempo Concentración de H2SO4 (%, p/p)

Biomasa (% p/p) Temperatura (°C)
(min)
10 160 5 0,89

Masa total en el reactor: 80 g paja de maíz + 320 g agua.

Nota: Preparar una cantidad suficiente para que en el gas stripping del último paso haya unos 500 ml de muestra.

2. Hidrólisis enzimática

Para cada fracción aproximada de 100 g de muestra (mezcla de sólidos y líquidos), añadimos estos reactivos:
 0,96 g de ácido cítrico.
 Ajustamos el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40% o de HCl concentrado.
 360 µl de la enzima Cellic CTec2 (o lo equivalente a 3,6 FPU/g paja de maíz).
Incubamos a 50 °C durante unas 68-72 h, con una agitación de 180 rpm.

3. Detoxificación con resinas

Acondicionamiento de la resina Dowex Optipore SD-2:

 Se pesan 55 g de resina, se cubren de agua y se cargan en la columna. Esta resina viene en el envase casi
completamente seca. El volumen total de la resina hidratada en la columna es de 90 ml.
 Se lava con 270 ml de una disolución de NaOH 1 N a flujo 4 mL/min.
 Después se lava con 810 ml de agua destilada a flujo de 10 mL/min.
Detoxificación del hidrolizado con la resina en la columna:
 Se filtra el hidrolizado de paja de maíz o se centrifuga y se filtra, en función de la facilidad que haya para
hacerlo. Se ajusta el pH del hidrolizado de maíz a 5,42 (valor de pH óptimo para la fermentación).
 El hidrolizado se pasa por la columna a un flujo de 2 mL/min (10 min de tiempo de residencia).

4. Recuperación de los compuestos fenólicos y otros inhibidores retenidos en la resina

 Se hace pasar una corriente de aire a través de la columna para intentar retirar toda la humedad posible de la
resina con un flujo de 10 mL/min durante xx min.
 Se lava la resina con 270 ml de acetona con un flujo de 4 ml/min, o bien hasta que deja de salir acetona
teñida de color.
 Se recoge la acetona cargada de fenoles. La muestra se lleva a sequedad.

5. Fermentación

5.1. Inóculos

 Se prepara una botella de 50 ml de medio líquido con 19 g/l de RCM y 10 g/l de glucosa.
 Se introducen en cada botella 125 µl de esporas de la cepa Clostridium saccharobutylicum DSM 13864.
 Se somete la botella a un choque térmico (2 min a 80 °C en un baño de agua y 5 min en hielo).
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min en el espacio de cabezas.
 Se incuban las botellas a 35 °C durante 48 h.
 Se comprueba que la densidad celular ha alcanzado aproximadamente 5·10 8 células/ml (o simplemente se
comprueba que el inóculo está turbio y tiene espuma).

5.2. Fermentación

 El hidrolizado acuoso salido de las columnas se recoge y se distribuye en botellas. En cada botella se ponen
25-50 ml de hidrolizado.
 Al hidrolizado se le añaden los nutrientes de la Tabla 1.
 Se comprueba el pH inicial y se ajusta, si es necesario, a 5,42.
 Se inocula un 3% (v/v) de bacterias.
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban las botellas a 28 °C y 100 rpm durante 96 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con aproximadamente 27 g/l glucosa, 18 g/l xilosa y los
nutrientes de la Tabla 1.
Tabla 1. Nutrientes para la fermentación del hidrolizado de paja de maíz.

Concentración
Compuesto
(g/l)
Extracto de levadura 5 Autoclavar
KH2PO4 1
K2HPO4 1
NH4Cl 2,1
CaCO3 8
MgSO4·7H2O 0,2 Filtrar
FeSO4·7H2O 0,01
MnSO4·7H2O 0,01

6. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 60
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 5
Tiempo (h) 5

Bibliografía
Fermentación y gas stripping: Artículo de la paja de maíz.
Chemical Engineering Transactions (2018) 64: 37-42. https://doi.org/10.3303/CET1864007.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ABE DE LOS RESIDUOS DE TOMATE

1. Autohidrólisis en el reactor

Biomasa (% p/p) Temperatura (°C) Tiempo (min)

20 121 20

Masa total en el reactor: 80 g tomate + 320 g agua.

Nota: Preparar una cantidad suficiente para que en el gas stripping del último paso haya unos 500 ml de muestra.

2. Hidrólisis enzimática

Para cada fracción aproximada de 100 g de muestra (mezcla de sólidos y líquidos), añadimos estos reactivos:
 0,96 g de ácido cítrico.
 Ajustamos el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40% o de HCl concentrado.
 720 µl de la enzima Cellic CTec2 (o lo equivalente a 3,6 FPU/g tomate).
 200 µl de la enzima Viscozyme L (o lo equivalente a 0,41 CMC/g tomate).
Incubamos a 50 °C durante unas 48 h, con una agitación de 180 rpm.

3. Fermentación

3.1. Inóculos

 Se prepara una botella de 50 ml de medio líquido con 19 g/l de RCM y 10 g/l de glucosa.
 Se introducen en cada botella 125 µl de esporas de la cepa Clostridium beijerinckii DSM 6423.
 Se somete la botella a un choque térmico (2 min a 80 °C en un baño de agua y 5 min en hielo).
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min en el espacio de cabezas.
 Se incuban las botellas a 35 °C durante 24 h.
 Se comprueba que la densidad celular ha alcanzado aproximadamente 5·10 8 células/ml (o simplemente se
comprueba que el inóculo está turbio y tiene espuma).

3.2. Fermentación

 El hidrolizado de Tomate manzana se filtra (con la media o con un filtro de papel) y se centrifuga a 3000 rpm
durante 10 min en el caso de que se haya filtrado con la media.
 Al hidrolizado se le añaden los nutrientes de la Tabla 1.
 Se ajusta el pH inicial a 6,00.
 Se inocula un 3% (v/v) de bacterias.
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban las botellas a 35 °C y 100 rpm durante 96 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con aproximadamente 34 g/l glucosa, 10 g/l xilosa y los
nutrientes de la Tabla 1.

Tabla 1. Nutrientes para la fermentación del hidrolizado de residuos de tomate manzana.

Concentración
Compuesto
(g/l)
Extracto de levadura 5 Autoclavar
KH2PO4 1
NH4Cl 2,1
CaCO3 5
MgSO4·7H2O 0,2 Filtrar
FeSO4·7H2O 0,01
Cisteína 0,5

4. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 60
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 5
Tiempo (h) 4

Nota: Nunca se ha llevado a cabo el gas stripping con esta muestra. No sabemos si funcionará.

Bibliografía
Fermentación ABE: Artículo del tomate.
Chemical Engineering Transactions (2018) 64: 37-42. https://doi.org/10.3303/CET1864007.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE LOS RESIDUOS DE TOMATE

Nota: Como los resultados de etanol obtenidos no son buenos (aproximadamente 20 g/l etanol), se considera que el
residuo de tomate no es una biomasa apropiada para la producción de bioetanol.

1. Autohidrólisis en el autoclave

Biomasa (% p/p) Temperatura (°C) Tiempo (min)

30 121 20

En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, se introducen 15 g de tomate seco y 35 g de agua destilada.

Nota: Preparar una cantidad suficiente para que en el gas stripping del último paso haya unos 500 ml de muestra.

2. Hidrólisis enzimática

En cada matraz con 50 g de muestra (mezcla de sólidos y líquidos), añadimos estos reactivos:
 0,48 g de ácido cítrico.
 Ajustamos el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40% o de HCl concentrado.
 540 µl de la enzima Cellic CTec2 (o lo equivalente a 3,6 FPU/g tomate).
 150 µl de la enzima Viscozyme L (o lo equivalente a 0,41 CMC/g tomate).
Incubamos a 50 °C durante unas 120 h, con una agitación de 180 rpm.

3. Fermentación

3.1. Inóculos

 Se prepara un medio de cultivo sólido en placas de Petri con 10 g L -1 glucosa, 3 g L-1 extracto de levadura, 3
g L-1 extracto de malta, 5 g L-1 peptona de soja y 20 g L -1 agar, y se siembra con la levadura Saccharomyces
cerevisiae Ethanol Red® conservada en glicerol. Se incuba en condiciones aerobias a 20°C hasta la
aparición de colonias de 1-2 mm.
 Se introduce/n una/s colonia/s de la placa en un matraz de 100 mL que contiene 50 mL del mismo medio
nutritivo anterior (pero sin agar). Se cierra el matraz con un tapón de espuma y se incuba a 30 °C y 150 rpm
durante 7-24 h hasta que la densidad celular sea de 1·10 8 células mL-1.

3.2. Fermentación

 El hidrolizado de tomate se usa tal cual, sin filtrar, centrifugar, esterilizar ni añadir nutrientes.
 Se ajusta el pH a 5,0 con una disolución de NaOH 40%.
 Se inocula un 3% (v/v) de levaduras.
 Se realiza la fermentación con 50 ml de hidrolizado de tomate en matraces de 100 ml tapados con tapones
de espuma. Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban los matraces en condiciones aerobias a 30°C y 150 rpm durante 72 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con aproximadamente 29 g/l glucosa, 15 g/l xilosa y los
nutrientes de la Tabla 1.
 Se prepara un control de la fermentación con 60 g L -1 glucosa, 22 g L-1 xilosa, 10,43 g L-1 extracto de levadura
y 1,47 g L-1 KH2PO4. Se justa el pH a 5,0.

4. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 70
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 0
Tiempo (h) 4

Nota: Nunca se ha llevado a cabo el gas stripping con esta muestra. No sabemos si funcionará.

Bibliografía
Fermentación alcohólica: Artículo del tomate.
Gas stripping: Artículo del tomate/artículo la manzana de Mari Cruz.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ABE DEL SUERO DE QUESO

1. Introducción

Este protocolo se diseñó para el suero de queso de oveja nanofiltrado de la Quesería Artesanal del Río Carrión S.L.
(La Serna Palencia). Su concentración inicial de lactosa era de 137 g/l. Aunque el suero esté pasteurizado, conviene
autoclavarlo para los experimentos de fermentación.

2. Fermentación

2.1. Inóculos

 Se prepara una botella de 50 ml de medio líquido con 19 g/l de RCM y 10 g/l de lactosa.
 Se introducen en cada botella 125 µl de esporas de la cepa Clostridium beijerinckii CECT 508.
 Se somete la botella a un choque térmico (2 min a 80 °C en un baño de agua y 5 min en hielo).
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min en el espacio de cabezas.
 Se incuban las botellas a 35 °C durante 20-24 h.
 Se comprueba que la densidad celular ha alcanzado aproximadamente 5·10 8 células/ml (o simplemente se
comprueba que el inóculo está turbio y tiene espuma).

2.2. Fermentación

 El suero de queso se diluye con agua destilada hasta alcanzar una concentración de lactosa de 57 g/l. Nota:
Si se desea maximizar el consumo de lactosa, se puede trabajar con una concentración inicial de lactosa de
30 g/l.
 Al suero diluido se le añaden los nutrientes de la Tabla 1.
 Se ajusta el pH inicial a 6,00.
 Se inocula un 3% (v/v) de bacterias.
 Se inyecta N2 gaseoso durante 5 min al fondo de la botella.
 Se incuban las botellas a 35 °C y 100 rpm durante 96 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con 57 g/l lactosa y los nutrientes de la Tabla 1.

Tabla 1. Nutrientes para la fermentación del hidrolizado de residuos de manzana.

Concentración
Compuesto
(g/l)
Extracto de levadura 1 Autoclavar
NH4Cl 2,1
CaCO3 5
MgSO4·7H2O 0,2 Filtrar
FeSO4·7H2O 0,019

3. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 60
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 5
Tiempo (h) 4

Bibliografía
Chemical Engineering Transactions (2016) 49: 217-222. https://doi.org/10.3303/CET1649037.
Chemical Engineering Transactions (2018) 64: 37-42. https://doi.org/10.3303/CET1864007.
CORRIENTES DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DEL SUERO DE QUESO

1. Introducción

Este protocolo se diseñó para el suero de queso de vaca y oveja ultrafiltrado de la Quesería Entrepinares SAU
(Valladolid). Su concentración inicial de lactosa era de 120-170 g/l. Aunque el suero esté pasteurizado, conviene
autoclavarlo para los experimentos de fermentación.

2. Fermentación

2.1. Inóculos

 Se prepara un medio de cultivo sólido en placas de Petri con 10 g L -1 glucosa, 3 g L-1 extracto de levadura, 3
g L-1 extracto de malta, 5 g L-1 peptona de soja y 20 g L-1 agar, y se siembra con la levadura Kluyveromyces
marxianus DSM 5422 conservada en glicerol. Se incuba en condiciones aerobias a 20°C hasta la aparición
de colonias de 1-2 mm.
 Se introduce/n una/s colonia/s de la placa en un matraz de 100 mL que contiene 50 mL de un medio líquido
con 50 g/L lactosa, 0,3 g/L MgSO 4·7H2O, 5 g/L extracto de levadura, 2 g/L NH 4Cl, 10 g/L peptona y 1 g/L
KH2PO4. Se cierra el matraz con un tapón de espuma y se incuba a 35 °C y 120 rpm durante 7 h hasta que la
densidad celular sea de 1·108 células mL-1.

2.2. Fermentación

 El suero de queso se diluye con agua destilada hasta alcanzar una concentración de lactosa de 130 g/l. El
suero se autoclava y no se le añade ningún nutriente.
 La fermentación se realiza en matraces de 100 ml con 50 ml de muestra, cubiertos con un tapón de espuma.
 Se ajusta el pH inicial a 6,3.
 Se inocula un 3% (v/v) de levaduras.
 Se incuban los matraces a 30,3 °C y 150 rpm durante 44 h.
 También hay que preparar un control para la cepa con 130 g/l lactosa y la misma composición de nutrientes
que se describió para el inóculo.

3. Gas stripping

Volumen de muestra (mL) 500

Temperatura de alimentación (°C) 70
Flujo de gas (L/min) 1,34
Temperatura de refrigeración (°C) 0
Tiempo (h) 4

Bibliografía
PLoS ONE (2018) 13(12): e0210002. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210002.
Gas stripping: Artículo del tomate/artículo la manzana de Mari Cruz.
CAFÉ DE MÁQUINA DE HOTEL

Método pendiente.