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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL


FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL Y RECURSOS
CALLAO
Ao de la consolidacin
del Mar de Grau
NATURALES

COLORACIN
DIFERENCIAL
INFORME DE LABORATORIO N3 y 4

INFORME DE LABORATORIO 93G


ALUMNO: SANCHEZ CARHUAPOMA, LUIS
ANGEL
PROFESORA:
BLG. SUYOS L, BEATRIZ

OBJETIVO

Objetivo Experimental N1

Observar las Hifas del hongo.


Aprender a preparar muestras de hongos

Objetivo Experimental N2

Uso de ms de un colorante en un proceso de coloracin.


Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, de la muestra

bucal.
Conocer las tcnicas de coloracin diferencial bacteriana.
Uso correcto de las tcnicas de coloracin diferencial.

INTRODUCCIN

Muchos de los microorganismos que esxisten son diferentes de manera fsica y qumica,
como a su vez estas diferencias presentes entre ellos se deben a las distintas forman en
la que reaccionan ante determinados procesos de coloracin como los que
mencionaremos ms adelante, por ello en esta practicade laboratorio aprenderemos de
las varias tcnicas de coloracin que permitan diferenciar grupos de microorganismos
de otros.
MARCO TEORICO

Tcnicas de tincin. Fundamentos


Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias gram positivas y gram negativas
La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y
ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglicano
(tambin conocido como murena).

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada, y


se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin
distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior
est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas
diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material
que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram positivas lo poseen en
mucha mayor proporcin que las gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin se debe a que la
membrana externa de las bacterias gram negativas es soluble en solventes orgnicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee
es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que
se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin
azul-violcea. Por el contrario, las bacterias gram positivas, al poseer una pared celular
ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros, cerrndolos,
lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloracin azul-violeta.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin,
ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones
precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son
formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la
seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura
realmente existente.
Factores que alteran la tincin Gram
A pesar de la gran utilidad de la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con
precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas (cultivos viejos
de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teirse como
gram negativos) y la tcnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se

puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian como gram negativas). Por
esta situacin, junto a la muestra deben teirse controles con bacterias gram positivas
(por ejemplo Staphylococcus aureus) y gram negativas (por ejemplo, Escherichia coli).
En lineas general los pricipales factores que alteran el metodo de tincin Gram son:

Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibiticos

TINCIN GRAM
La tincinde gram o coloracin de gram es un tipo de tincin diferencial empleado en
microbiologa para la visualizacin de bacteras, sobre todo en muestras clnicas. Debe
su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. se
utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria gram negativa a las
que se visualizan de color rosa.
Tcnica

Preparar el frotis y fijarlo al calor


Colocar la preparacin fijada con la solucin de cristal violeta durante l
Lavar con solucin yodada (Lugol )
Cubrir el frotis con Lugol durante 1
Escurrir y decolorar por alcohol hasta que no arrastre ms cristal violeta.
Lavar con agua
Contrastar con la solucin de fucsina por 1
Lavar con agua, secar al aire y examinar con objetivo de inmersin

Bacterias Gram Positivas


En microbiologa, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se
tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Grampositivas" o tambin "grampositivas". Esta caracterstica est ntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organizacin
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como
taxn se utiliza tambin el nombre de Posibacteria.

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana


citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano,
que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante
molculas de cido lipoteicoico. La capa de peptidoglucano confiere una gran
resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tincin de
Gram .
Incluyen especies tanto mviles (va flagelos) como inmviles con forma de bacilo
(Bacillus,

Clostridium,

Corynebacterium,

Lactobacillus,

Listeria)

coco

(Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas


(Mycoplasma). Algunas especies son fotosintticas, pero la mayora son hetertrofas.
Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables. Realmente,
no todas las bacterias del grupo son Gram positivas (no se tien por la aplicacin de ese
mtodo), pero se incluyen aqu por su similitud molecular con otras bacterias Grampositivas.
Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas)

Bacterias Gram Negativas

Las Bacterias Gram-Negativas son aquellas que presentan dos membranas lipdicas y
entre ellas se localiza un fina pared celular compuesta fundamentalmente por
peptidoglucano ( al ser fina esta pared, no se tie de violeta o azul en la tincin ).
Estas bacterias se tien de Rosa.
Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos Gramnegativos

causan

la

gonorrea

(Neisseria

gonorrhoeae),

meningitis(Neisseria

meningitidis) y sntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos


Gram-negativos incluyen un gran nmero de especies. Algunos de ellos causan
principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Klebsiella
pneumoniae , Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades
urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia
marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella
enteritidis, Salmonella typhi). Otros estn asociadas a infecciones nosocomiales
(Acinetobacter baumanii).
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la
tincin de Gram

TINCIN WIRTZ CONKLIN

Los reactivos presentes son solucin acuosa de verde malaquita 5% y solucin acuosa
de safranina al 0,5%. Se observan con lente de inmersin las esporas se colorean de
verde y las bacterias de color rojo intenso.
RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para
los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que
aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El
permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica.
Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios
parsitos, se tien con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis
pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre
la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma,
los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que
adems permiten la diferenciacin morfolgica.
NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de
acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se
intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la
tincin.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos
ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado
que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el
subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos.
TINCION DE ZIEHL NEELSEN

La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y


econmica, para la identificacin de microorganismos patgenos, por ejemplo M.
tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un
bacterilogo y Friedrich Neelsen (1854 -1894), un patlogo.
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias. Contienen cidos grasos (cidos
miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad
de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes
bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Las mico bacterias como M.
tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se
caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de
Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana
que contiene ceras.
Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que
diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes
celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomiceos
(muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por
la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido
sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes
parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 minutos con Carbol fucsina aplicando calor suave. Lavar
con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y
teir durante 30-60 seg. Con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar
TECNICA:

Cubrir la lmina previa fijacin de la preparacin por calor con la fucsina


fenicada de Ziehl Neelsen y calentarla hasta que emita vapores, sin que hierva,
durante tres a cinco minutos, respondiendo constantemente el colorante para

evitar la desecacin.
Lavar con agua corriente.

Decolorar con el alcohol-cido hasta que no haya ms salida de color.


Lavar con agua corriente.
Contra teir con la solucin de azul de metileno por un minuto.
Lavar con agua, secar al aire y observar por inmersin.
Puede utilizarse en lugar de la Carbo fucsina de Ziehl Neelsen la de Kinyoun,
en cuyo caso no es necesario el calentamiento.

COMPOSICION:

Fucsina bsica.. 4 g
Fenol 8 ml
Alcohol etlico de 9520 ml
Agua destilada.. l00 ml

Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium son designados


acidorresistentes a causa de que una vez teidos por un mtodo conveniente retienen el
colorante y no son decolorados por accin de los cidos. Los grmenes acidorresistentes
(bacilos de la tuberculosis y de la lepra) aparecen de color rojo y los no acidorresistentes
de azul, al igual que las clulas, leucocitos, etc. Del material en estudio.
Imagen: BGN y levaduras en una tincin GRA Para la tincin del bacilo tuberculoso,
lepra y mico bacterias

MATERIALES

Materiales Biologcos.
Batera para tincin de Gram.

Batera para Ziehl Neelsen.


Microcopio.
Portaobjetos.
Cubre objetos.
Asa de siembra.
Mechero.
Pinza de madera.
PROCEDIMIENTO

Experiencia con la muestra de hongo:

Con un asa de siembre sacar una muestra de hongo


Colocar la muestra en la lamina porta objetos.
Cubrir la muestra con 2 gotas de lugol
Coloque el cubre objetos a 15 grados aproximadamente
Observar en el microscopio

Experiencia con la muestra de sarro bucal:

Prepare un extendido de la muestra bucal sobre la superficie central de la lamina

porta objetos.
Deja secar el extendido bucal en la lamina porta objetos hasta secar
Cubra el extendido con la solucin violeta de cristal y deje actuar por un minutos

(1min mnimo)
Lavar con agua
Descolore la muestra con alcohol acetenoa hasta que prenda colorante.
Lavar con agua
Aplique la safranina y deje actuar 1 minuto
Lavar con agua
Secar la preparain, observar con el microscopio y el aceite de inmercin.

RESULTADOS

Experiencia con la muestra de hongo:


-

Se logro observar las hifas de los hongos tanto en la muesra de

Experiencia con la muestra de sarro bucal:

Se porcedio a observar las distintas muestras de los compaeros en clase


microorganismos como diplococos, cocos, y se encontraron las siguientes
particularidades.

Muestra N1

Muestra N2

Muestra N3

Muestra N4

Muestra N6

Muestra N7

Muestra N8

CONCLUSIONES

Experiencia con la muestra de hongo:


-

Lamuestra de xx o xx presentan hifas, filamentos en los hongos que se


presentan en forma de redes laxas, formando micelio.

Experiencia con la muestra de sarro bucal:


-

Con la tincin gram se pudo evidenciar de forma definida los


microorganismos gram+ (violetas) y gram (rojas).

CUESTIONARIO

1.- Qu funcin cumple el Lugol en la coloracin Gram?


La funcin del yodo- Lugol funciona como fijacin de la preparacin, y tambin actua
sobre la pared de las bacterias que se tieron, al agrgar la safranina, las bacterias
restantes se teiran, siendo estas ltimas las la bacterias Gram Negativas.
2.-Cul es la composicin del lugol?

El reactivo de Lugol consiste en 20 gramos de yodo metlico y 40 gramos de yoduro


potsico, disueltos en un litro de agua destilada. El yoduro potsico facilita la disolucin
del yodo diatmico, debido a la formacin de iones triyoduro I3-.
No debe confundirse el lugol con la tintura de yodo, que consiste en yodo diatmico y
sales de yodo disueltos en una mezcla de agua y alcohol etlico (etanol). La disolucin
de Lugol no contiene alcohol.
3.- Cul es el fundamento de las coloraciones diferenciales?
Los fundamentos de la tcnica de coloracin diferencial se basan en las diferencias que
existen entre las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas,, es
decir el nivel de reaccin que tiene el pptidoglucano evidenciando que en el caso de las
Gram positivas se tia y por lo contrario en las Gram negativas.
4.- Cul es la funcin de la fenicada en la coloracin ZIHEL NEELSEN?
Algunos gneros microbianos dentro de los que se incluyen las microbacterias, tieenen
la propiedad de retener el colorante con que han sido teidas, aunque sean somentidos a
la accin de solventes tan fuertes como los cidos para su decoloracin, el primer
mtodo de coloracin para este tipo de microorganismo.
5.- A que denimina colorane primario y colorante de contraste?
Primer colorante.- Un colorante bsico (+) que en contacto con la clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta.
Colorante contrate.- es un colrante bsico de distinto color que el primer colorante por
eejemplo, la safrina.
6.- Mencione 5 ejemplos de bacterias G+ y 5 ejemplos de bacterias GBacterias Gram Positiva

Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus epidermidis es una especie bacteriana
del gnero Staphylococcus, consistente en cocos Grampositivos arreglados en grupos.

Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus, conocido como estafilococo
ureo, o comnmente estafilococo dorado, es una
bacteria anaerobia facultativa, grampositiva, productora
de coagulasa, catalasa, inmvil y no esporulada

Bacilius Antradis
Bacillus anthracis es una especie del gnero de bacterias
Gram positivas Bacillus. La bacteria fue identificada
simultnea e independientemente por primera vez por
Aloys Pollander, en Alemania, y en Francia por Pierre
Rayer y Casimir Davaine.

Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis es una bacteria Gram-positiva
comensal, que habita el tracto gastrointestinal de
humanos y otros mamferos.

Streptococcus viridans
Estreptococo

viridans

es

un

trmino

pseudotaxonmico para referirse un gran grupo


de

bacterias

estreptococo

comensales

grampositivas que pueden ser o bien del tipo hemoltico, que producen una coloracin.

Bacteria Gram Negativa

Pseudomona aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gramnegativa, aerbica, con motilidad unipolar. Es
un patgeno oportunista en humanos y tambin
en plantas

Enterobacter clocae
El Enterobacter cloacae es una bacteria que
pertenece al gnero Enterobacter, de la familia
de las Enterobacteriaceae. Es un bacilo Gram
negativo Oxidasa negativo y Catalasa positivo
presente en el aparato digestivo humano.

Escherichia coli
Escherichia coli, tambin conocida por la
abreviacin de su nombre, E. coli, es un bacilo
gramnegativo

de

la

familia

de

las

enterobacterias que se encuentra en el tracto


gastrointestinal de humanos y animales de
-

sangre caliente.
Proteus mirabilis
Proteus mirabilis es un bacilo gram negativo,
facultativamente

anaerbico.

Muestra

aglutinacin, motilidad, y actividad ureasa. P.


mirabilis

causa

el

90%

de

todas

las

infecciones por 'Proteus'. Viene de la Tribu


Proteae.
-

Serratia marcescens

La

Serratia

gramnegativo

marcescens

es

de

la

un

bacilo
familia

Enterobacteriaceae. Puede ser peligroso para


el hombre, ya que a veces es patgena, como
causa

de

urinarias.

infecciones

nosocomiales