TALLER #2 BIOFERMENTACIÓN 1

MEDIO DE CULTIVO

LUISA RUEDA
STEFANY CASTRO DAZA
JENNY URRUTIA
JHOANA FERNANDEZ
MARCELO LOZANO

ING. CARLOS RAMÓN VIDAL

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

INGENIERIAS Y TECNOLOGIAS
VALLEDUPAR- CESAR
2015
QUE ES UN MEDIO DE CULTIVO Y PARA QUE SE UTILIZA

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones

adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología
por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura
la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los
laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que
pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para
preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un
agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.

PARA SU PREPARACIÓN SE DEBEN TENER EN CUENTA LOS SIGUIENTES

ASPECTOS:

● Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o

proveedores que suministren productos de calidad.

● Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad

microbiológica y fisicoquímica adecuada.

● Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua

destilada o desmineralizada.

● Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su

esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por
el fabricante.

La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los

nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los
microorganismos en el laboratorio.
PROCEDIMIENTO

1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo

asignado.

2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de

cada uno de los ingredientes Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.

3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es

necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.

4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a

temperatura ambiente (25°C). Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL,
medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH
0,1N. Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la
solución correspondiente pero 1 N.

5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el

profesor.

6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre,

distribución y fecha de preparación.

7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones

señaladas en el trabajo práctico N°

8. Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el

medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo
refrigeración.
Los medios de cultivo

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han
preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la
que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios

de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se
solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre
el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que

bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación
de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa
se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos
resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH
básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya
que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,

como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para
ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que
tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de

carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de
estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida
de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la
peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a

muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,
magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al
punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y

comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de

oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio,
los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así
que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y

43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertermófilos). En líneas generales, los patógenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC,
y los saprofitos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

CLASIFICACIÓN

Según sus cualidades físicas, se distinguen:

● líquidos: Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes

disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de
microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.

● semisólidos:

● sólidos: Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les

añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con
frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el
laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

Según su origen:

● Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen

animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición
química no se conoce exactamente.
● Sintéticos: son los medios que contienen una composición química
definida cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.

● Semisinteticos: son los sintéticos a los que se les añaden factores de

crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo
extracto de levadura.

Según su formulación:

● Químicamente definidos: se conoce la cantidad exacta de cada uno de

los compuestos que hay en el medio.

● Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de

levadura, sangre, etc.); no se conoce exactamente cuál es la composición del
medio; sin embargo, presenta la ventaja de que ya están presentes todos o casi
todos los elementos que una célula puede requerir.

Según su uso:

● Medio general: medio en donde crecen todo tipo de microorganismos,

excepto los que necesitan condiciones especiales (por ejemplo, agar CLED).

● Medio selectivo: permite seleccionar el crecimiento de una especie o

grupo determinado (hongos, bacterias entéricas, protozoos...).

● Medio diferencial: permite identificar una especie con otra, ambas en el

mismo medio. Puede ser por su crecimiento, su metabolismo,su respiración, etc.
(por ejemplo, medio de McConkey).

● Medio de enriquecimiento: contiene los nutrientes necesarios para apoyar

el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, se utiliza para la
cosecha de diferentes tipos de microorganismos en un mismo medio.

● Medio mínimo: contiene la mínima cantidad de nutrientes posible que

permite el crecimiento de una especie.

● Medio de transporte: preparado para servir como almacenamiento

temporal a especímenes transportados o en transferencia; mantienen su viabilidad
y su concentración.

Almacenamiento de los Medios de cultivo

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados
bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un
lugar fresco (entre 15 y 25o), con poca humedad y protegidos de la luz solar
directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de
calor o vapor.

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de

estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe
tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien
cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorción de agua produce
cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etcétera, lo cual
indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios
químicos o estar contaminados.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede

almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas
protegido de la luz, o por períodos mayores a 12–15 ºC. Sin embargo,
almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8 ºC se prolonga la vida útil de los
mismos, (nunca por debajo de 0 ºC porque se destruye la estructura del gel). Los
medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su
deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima
una envoltura de papel (Craft).

Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo
preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se
determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia, pH) y microbiológicas
(esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los
requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su
uso.

AISLAMIENTO
Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos
que le acompañan. El método más usual es la siembra por estría sobre un medio
de cultivo sólido adecuado dispuesto en una placa de petri.

Para ello se toma una pequeña cantidad de muestra con un asa de platino y se
reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas
e inmovilizadas las células bacterianas. Tras la incubación en condiciones
adecuadas, cada célula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas
divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas características
determinadas en cuanto a su forma, borde, elevación, tamaño , consistencia, etc..
Los tipos de bacterias presentes en la muestra original es visible como tipos
diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible
obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la
muestra original.

El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la

superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el
mayor número de estrías posible. En las primeras estrías aparecerán colonias
confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estrías finales
deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un
reducido inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la población
sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de
cultivo, debe asegurar que finalmente algunas células queden suficientemente
separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.

Criterios para la diferenciación de colonias. El aspecto de las colonias, su

coloración, tamaño, etc. permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son
propiedades generales muy influenciadas por las condiciones de cultivo, por lo que
a continuación se realiza una descripción muy general. Las colonias pueden ser
opacas, translucidas o transparentes. Algunas producen pigmentos fluorescentes
cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras aparecen con superficie
pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos concéntricos. En
ocasiones el olor es también característico.

Ejemplos de medios de cultivo

- Agua peptonada

Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de

alimentos y otros materiales de interés sanitario.

- APC Agar plate count

Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas,

aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. También es recomendado
como medio general para determinar poblaciones microbianas.

- Baird Parker Medio Base

Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento

y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de
importancia sanitaria.

- VRBL Violeta Rojo Bilis Lactosa

Medio selectivo para la investigación presuntiva y recuento de coliformes en

alimentos y productos lácteos. Es importante aclarar que este medio en particular
no debe esterilizarse en autoclave.

- EMB (eosina-azul de metileno)

Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo

de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.

- YGC (extracto de levadura, glucosa, cloramfenicol)

Medio selectivo recomendado para el recuento genérico de mohos y levaduras.

- Caldo Mac Conkey

Medio de cultivo selectivo, utilizado para la investigación presuntiva de
microorganismos coliformes en aguas, alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria.

- Caldo lactosado

Se recomienda como prueba presuntiva para investigar la presencia de bacterias

del grupo coliforme en agua, productos lácteos, etc. Actualmente también está
indicado para el preenriquecimiento no selectivo en la búsqueda de Salmonella
spp. a partir de alimentos.

Utilización de los medios de cultivo

- Diagnóstico clínico en medicina humana y veterinaria

● Detección de microorganismos patógenos a partir de muestras de fluidos,

tejidos y excretas y sus toxinas causantes de enfermedades.

- Industria farmacéutica y biotecnológica

● Cultivo masivo de microorganismos productores de metabolitos (proteínas,

factores de crecimiento, aminoácidos, péptidos, antibióticos, etc.)

● Control de la calidad (control de proceso, materias primas, productos

terminados, aguas, residuales y ambiente)

- Industria alimenticia

● Cultivo masivo de microorganismos productores de sustancias nutritivas y

alimentos (proteínas y compuestos saborizantes entre otros)

● Obtención de alimentos fermentados (yogurt, otros productos lácteos y

alimenticios)

● Control de la calidad (control de proceso, materias primas, productos

terminados, y ambiente)

- Otras industrias y sectores productivos (agricultura, química)

● Cultivo masivo de microorganismos (obtención de polímeros, azúcares y

otros)
● Control de la calidad (control de proceso, materias primas, productos
terminados y ambiente)

- Control del medio ambiente

● Control de las aguas y fuentes de abasto

● Control ambiental (aire, suelos)

● Control de residuales

- Investigaciones

● Estudios morfológicos, funcionales, sistemáticos y de otro tipo, dirigidos al

conocimiento de la flora microbiana.

● Investigaciones relacionadas con el desarrollo de sustancias o productos en

las industrias y sectores anteriormente señalados.
BIBLIOGRAFIA

http://www.ecured.cu/index.php/Medio_de_cultivo_(Microbiolog%C3%ADa)

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/prepara
cion-de-medios-de-cultivo

http://www.unavarra.es/genmic/microgral/manual%20practicas%20micagral.pdf