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FISIOLOGÍA DEL DESARROLLO VEGETAL

3º Grado en Biología

Facultad de Ciencias
Universidad de Alicante

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 Sofía Daniela Hernández Romero y Marian Simarro González.
3º Biología, L1

¿Cómo se ven afectadas las concentraciones de proteínas,

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
azúcares y clorofilas según la edad en ​Asparagus
officinalis​?

Necesitamos cuantificar la concentración de azúcares y proteínas en la planta.

Para ello debemos extraer ambos compuestos, pero también las clorofilas porque interfieren
con la espectrofotometría de las proteínas.

El ​plan de trabajo que vamos a realizar lo separamos en 6 sesiones de trabajo de unas 3

horas cada sesión.

En las sesiones 1 y 2, planteamos la hipótesis del trabajo y planificamos las próximas

Reservados todos los derechos.

sesiones de trabajo, así como la metodología de los experimentos. Para ello empleamos
una recopilación de tres artículos científicos en los cuales nos basamos para diseñar los
experimentos.
Además, en la sesión 2, hemos realizado los cálculos necesarios para preparar las
disoluciones y los reactivos que harán falta tanto para nuestras muestras como para las
rectas de calibrado.
En la sesión 3, haremos el pesado de las muestras de espárragos para proceder con la
extracción de azúcares y la medición de sus absorbancias. .
En la sesión 4, continuaremos con la extracción de proteínas y su medición.
En la sesión 5 nos dedicaremos a medir la absorbancia de las clorofilas presentes en tejido.
La sesión 6 la dedicaremos a representar gráficamente los resultados para obtener las
rectas de calibrado y conseguir las concentraciones problema de nuestras muestras.

Metodología de los experimentos

Primero hay que tener en cuenta que tenemos 2 botes diferentes que contienen cierta
cantidad de espárrago en polvo. Ambos espárragos están en estados vitales diferentes, es
decir, uno es más viejo que el otro.

Para la extracción de azúcares:

Se usan 20 mg de polvo de espárrago para hacer 5 muestras para cada espárrago.

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 Sofía Daniela Hernández Romero y Marian Simarro González.
3º Biología, L1

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Cada muestra se mezcla con 1 ml de metanol al 80 % y se calienta durante 2 min a 80 ºC.
Se agita durante 3 min y se centrifuga a 10000 x G.
El sobrenadante se decanta y el pellet es resuspendido 2-3 veces con 1 ml de metanol frío
al 80 % y agitado 5 min. Se mezclan los líquidos resultantes.
Cuando ya tenemos nuestra muestra de azúcares de ambos espárragos, necesitamos:
● 1 ml de los azúcares de nuestra muestra
● 1 ml de solución acuosa de cianoacetamida (1%)

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● 2 ml de tampón buffer, a un Ph= 9 y [ 0’1 ] M.
Se coloca todo en un tubo de ensayo de 10 ml. Deberíamos tener 10 tubos.
Se calientan durante 10 min en un baño hirviendo.
Después, se enfrían introduciendo los tubos en un baño con agua del grifo.
Se mide la absorbancia a 276 nm (usando el cubito de cuarzo) de cada tubo de ensayo.

Debemos hacer una recta de calibrado.

Deberíamos hacer un banco de diluciones para tener varias concentraciones distintas.
Estas concentraciones conocidas nos servirán para asociarlas a ciertas absorbancias y así
podremos conocer la concentración de azúcares de nuestras muestras problema.

Para hacer la recta de calibrado:

Se usa glucosa pura como estándar
1. Para hacer la disolución madre de 7’5 x 10​-4 M se necesitan 0’135 g de glucosa y 1 L
de disolvente metanol.
2. Para la disolución de 6 x 10​-4 M se necesitan 0’6 L de la disolución madre. Se
añaden 0’15 L de disolvente. Volumen final 0’75 L.
3. Para la disolución de 4’5 x 10​-4 M se necesitan 0’375 L de la disolución de 6 x 10​-4
M. Se añaden 0’ 125 L de disolvente. Volumen final 0’5 L.
4. Para la disolución de 3 x 10​-4 M se necesitan 0’2 L de la disolución de 4’5 x 10​-4 M.
Se añaden 0’1 L de disolvente. Volumen final 0’3 L.
5. Para la disolución de 1’5 x 10​-4 M se necesitan 0’075 L de la disolución de 3 x 10​-4
M. Se añaden 0’075 L de disolvente. Volumen final 0’15 L.
6. Para la disolución de 5 x 10​-5 M se necesitan 0’025 L de la disolución de 1’5 x 10​-4 M.
Se añaden 0’05 L de disolvente. Volumen final 0’075 L.

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 Sofía Daniela Hernández Romero y Marian Simarro González.
3º Biología, L1
Hacemos la representación gráfica de las absorbancias (eje Y) y las concentraciones (eje
X), obtenemos una recta de regresión y con su ecuación calculamos las concentraciones de
nuestras muestras (utilizando las 5 absorbancias de cada espárrago).
Se cambian las unidades (gramos de azúcares por gramo de tejido) y, por último, hacemos
la media de las 5 concentraciones, para cada espárrago.

Los datos y cálculos utilizados son los siguientes:

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Datos:
● Masa molecular​(glucosa)​= 180’156 g/mol
● Rango de concentraciones → 5-750 nmoles/ml

Fórmulas:
● n = masa (g)/masa moleculas (g/mol)
● Molaridad = moles (n)/ volumen (L)
● C​0​ x V​0 =
​ C​F​ x V​F

La disolución madre (ds) es la más concentrada y tendrá la máxima concentración permitida

en el rango. La haremos con 1 L de disolvente.

Reservados todos los derechos.

Como sabemos la concentración en moles/L y la masa molecular podemos saber los
gramos que vamos a necesitar.

Masa​glucosa​ = (7’5 · 10​-4​ moles) · 180’156 = 0’135 g de glucosa.

A partir de esta disolución cogeremos cierto volumen para diluirlo con más disolvente y así
obtener las otras concentraciones. Para esto se usará la ecuación C​0​ x V​0 =
​ C​F​ x V​F​.

7’5 · 10​-4 ​ · V​0​ = 6 · 10​-4 ​ · 0’75 L ; V​0​ = 0’6 L

6 · 10​-4 ​ · V​0​ = 4’5 · 10​-4 ​ · 0’5 L ; V​0​ = 0’375 L
4’5 · 10​-4 ​ · V​0​ = 3 · 10​-4 ​ · 0’3 L ; V​0​ = 0’2 L
3 · 10​-4 ​ · V​0​ = 1’5 · 10​-4 ​ · 0’15 L ; V​0​ = 0’075 L
1’5 · 10​-4 ​ · V​0​ = 5 · 10​-5 ​ · 0’075 L ; V​0​ = 0’025 L

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Para la extracción de proteínas:

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Se usarán muestras de 10 mg del espárrago hecho polvo. Se harán 5 muestras por
espárrago, por lo que se necesitan 50 g de polvo en total de cada espárrago para la
determinación de proteínas).
Se debe eliminar la clorofila mezclando la muestra con 1’5 ml de acetona al 80% durante 10
min a 25 ºC.
Las muestras se centrifugan a 10000 x G durante 2-3 min.

La mezcla de acetona-clorofila se decanta y se guarda para medir absorbancias a dos

longitudes de onda: 646 y 663 nm. Su blanco sería la acetona sola.

-1​
[Clorofila]​TOTAL=
​ (mg·L​ ) = 17’3 x Abs646
​ ​ + 7’18 x Abs663
​

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El pellet es resuspendido al hervirlo durante 10 min con 3 ml de NaOH a [0’1] M que
contenga 1% de sodio dodecil sulfato.

Cuantificación de los extractos:

1. Colocar 0,1 mL del extracto vegetal en una cubeta de plástico de 1,5 mL.
2. Añadir 1 mL del reactivo de Bradford (azul Coomassie) a cada cubeta.
3. Tapar con Parafilm e invertir suavemente la cubeta varias veces, procurando evitar la
formación de espuma.
4. Dejar reposar 10 minutos.
5. Medir la absorbancia a 595 nm frente al azul de Croomassie con NaOH, que usaremos
como blanco.
6. Sustituir el valor de absorbancia obtenido en la ecuación de la recta de calibrado.

Para hacer la recta de calibrado:

Se usa albúmina de suero bovino puro como estándar (Método Bradford modificado).
1. Para hacer la disolución madre de 4’5 x 10​-4 M se necesitan 0’3 g de albúmina y 1 L
de disolvente NaOH.
2. Para la disolución de 3’6 x 10​-3 M se necesitan 0’6 L de la disolución madre. Se
añaden 0’15 L de disolvente NaOH. Volumen final 0’75 L.
3. Para la disolución de 2’7 x 10​-3 M se necesitan 0’375 L de la disolución de 3’6 x 10​-3
M. Se añaden 0’ 125 L de disolvente NaOH. Volumen final 0’5 L.
4. Para la disolución de 1’8 x 10​-3 M se necesitan 0’2 L de la disolución de 2’7 x 10​-3
M. Se añaden 0’1 L de disolvente NaOH. Volumen final 0’3 L.
5. Para la disolución de 9 x 10​-4 M se necesitan 0’0375 L de la disolución de 1’8 x 10​-4
M. Se añaden 0’0375 L de disolvente NaOH. Volumen final 0’075 L.

Una vez hemos obtenido las disoluciones para la recta, debemos medir su absorbancia con
el siguiente método:

1. Colocar 0,1 mL de cada disolución de albúmina realizada (0-0,3 mg/mL), en sus

respectivas cubetas de plástico de 1,5 mL.
2. Añadir 1 mL del reactivo de Bradford (azul Coomassie) a cada cubeta.

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3º Biología, L1
3. Tapar con Parafilm e invertir suavemente la cubeta varias veces, procurando evitar
la formación de espuma.
4. Dejar reposar 10 minutos.
5. Medir la absorbancia a 595 nm frente al azul de Croomassie con NaOH, que
usaremos como blanco.
6. Construir una recta de calibrado representando absorbancia frente a concentración
de proteína, tal y como se ve en el ejemplo.
7. Calcular la ecuación de la recta de regresión y el coeficiente de regresión lineal

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Hacemos la representación gráfica de las absorbancias (eje Y) y las concentraciones (eje
X), obtenemos una recta de regresión y con su ecuación calculamos las concentraciones de
nuestras muestras (utilizando las 5 absorbancias de cada espárrago).
Se cambian las unidades (gramos de azúcares por gramo de tejido) y, por último, hacemos
la media de las 5 concentraciones, para cada espárrago.

Los datos y cálculos utilizados son los siguientes:

Dato:
● Masa molecular​(glucosa)​= 66’382 g/mol

Reservados todos los derechos.

● Rango de concentraciones → 0-0’3 mg/ml

Fórmulas:
● n = masa (g)/masa moleculas (g/mol)
● Molaridad = moles (n)/ volumen (L)
● C​0​ x V​0 =
​ C​F​ x V​F

La disolución madre es la más concentrada y tendrá la máxima concentración permitida en

el rango. La haremos con 1 L de disolvente.

Como sabemos la concentración en moles/L y la masa molecular podemos saber los

gramos que vamos a necesitar.

Masa​proteinas​ = (4’5 · 10​-3​ moles) · 66’382 = 0’3 g de proteina.

A partir de esta disolución cogeremos cierto volumen para diluirlo con más disolvente y así
obtener las otras concentraciones. Para esto se usará la ecuación C​0​ x V​0 ​= C​F​ x V​F​.

4’5 · 10​-3 ​ · V​0​ = 3’6 · 10​-3 ​ · 0’75 L ; V​0​ = 0’6 L

3’6 · 10​-3 ​ · V​0​ = 2’7 · 10​-3 ​ · 0’5 L ; V​0​ = 0’375 L
2’7 · 10​-3 ​ · V​0​ = 1’8 · 10​-3 ​ · 0’3 L ; V​0​ = 0’2 L
1’8 · 10​-3 ​ · V​0​ = 9 · 10​-4 ​ · 0’15 L ; V​0​ = 0’075 L
9 · 10​-4 ​ · V​0​ = 4’5 · 10​-4 ​ · 0’075 L ; V​0​ = 0’0375 L

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