Guía de prácticas - Biología 2020-II

PRÁCTICA N°9

INMOVILIZACIÓN DE LA AMILASA PARA

LA OBTENCIÓN DE GLUCOSA

COMPETENCIA

 Participa activamente en ensayos básicos relacionados a la inmovilización de enzimas.

 Reconoce e identifica algunas características del uso de soportes empleados para la
inmovilización de enzimas.
 Comprende la importancia del uso de las enzimas inmovilizadas para mejorar el
rendimiento de transformaciones enzimáticas no sólo de alimentos, sino también para la
inmovilización de otros compuestos bioactivos, como moléculas con capacidad
antimicrobiana o antioxidante.
 Realiza la inmovilización de la enzima α−amilasa salival o ptialina, por medio de la
técnica de atrapamiento en gel utilizando como soporte gelatina.
 Comprueba la actividad de la enzima sobre el sustrato.

I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad son numerosos los procesos biotecnológicos que se llevan a cabo mediante
la utilización de células o de sus enzimas aisladas, siendo éste un campo con grandes
perspectivas de futuro.
Una de las aplicaciones en procesos industriales de la biotecnología es el uso de enzimas
para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o alimentarios. Entre las muchas
ventajas de su uso está la gran actividad catalítica, a temperatura ambiente y presión
atmosférica, y gran especificidad de sustrato. Por otro lado, la inestabilidad que presentan
en los procesos químicos industriales y la dificultad de poder separarse de sustratos y
productos, todos solubles en agua, hacen que las enzimas no se puedan reutilizar. Entonces,
se ideó una alternativa, el método de inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer factible
que un proceso biotecnológico sea rentable (1).
Se denomina una “inmovilización de enzimas” al confinamiento físico de una enzima o
célula en una determinada región del espacio, de manera que su actividad catalítica se
retenga, y pueda ser reutilizada (2), posteriormente simplificado del término
“biocatalizadores inmovilizados” a; enzimas, células enteras u orgánulos celulares (o bien
combinaciones de ellos) que se encuentran en un estado tal que se permite su reutilización .

Las ventajas desde el punto de vista aplicado son: a) Gran aumento de la estabilidad de la
enzima o célula inmovilizada. b)Incremento de la productividad enzimática por la
capacidad de reutilización. c) Facilidad de recuperación y purificación de los productos. d)
Se puede elegir entre una gran variedad de diseños ingenieriles e) Se aumenta la facilidad
de operación y control del proceso, al trabajar en condiciones más suaves. Las desventajas
a) Generalmente, se disminuye la actividad enzimática por la alteración de la enzima
respecto de su estado nativo. b) Se aumentan los problemas difusionales. c) Se aumenta el
costo del proceso. d) El intervalo de pH de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador
nativo (3)

EEG – Área de Ingenierías UNMSM

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Métodos de Inmovilización

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Aplicaciones de enzimas inmovilizadas.

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Por otro lado. el almidón es un carbohidrato complejo compuesto por un gran número de
unidades de glucosa unidas a través de enlaces glucosídicos.
Se suele subdividir en dos componentes: la amilosa (de forma helicoidal) y la amilopectina (de
forma ramificada). La amilosa es un polímero lineal de glucosas unidos a través de enlaces alfa-
1,4-O-glucosídicos, mientras que la amilopectina tiene estructura similar a la amilosa, sin
embargo, tiene puntos de ramificación a través de enlaces alfa-1,6 glucosídicos.
La α-amilasa salival hidroliza uniones α-1,4 y su pH óptimo es 6,7 y se inhibe a pH estomacal.
Los productos finales de la digestión del almidón son oligosacáridos, maltosa, maltoriosa,
algunos polímeros con uniones 1,4 de glucosa y las dextrinas límites.

II. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

Inmovilización de la amilasa para la obtención de glucosa

Materiales

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 Gelatina
 Aceite helado
 Jeringas de 10mL
 Cocina
 Baño María aprox. 46°C
 Frascos de vidrio transparente
 Colador
 Agua destilada o agua de grifo
 Saliva recolectada

Procedimiento
 (I) Recolectar en un vaso aprox. 3mL de saliva humana.
 (II) Preparar una suspensión de gelatina en agua aprox. 100mL y disolver
completamente en la cocina, dejar enfriar hasta aprox. 46°C.
 Mezclar I yII en un sólo recipiente y colocar en baño María.
 Disponer de 2 recipientes o vasos con alcohol helado (colocado previamente 24
horas antes del experimento).
 Con una jeringa de 10ml cargar la mezcla del agar con saliva (no usar la aguja que
viene con la jeringa, usar solamente la jeringa) y dejar caer gota a gota en forma
constante y rápida el contenido de la jeringa sobre el aceite helado (250mL o
menos dependiendo del recipiente) contenido en un vaso.
 Observará que se forman pequeñas esferitas.
 Luego, todo el contenido pasar del vaso a través de un colador.
 Lavar con agua las perlas obtenidas en el colador por 3 veces consecutivas.
 Colocar las perlas en un vaso y conservar a 4°C para su posterior uso.

Evaluación de la acción de la amilasa inmovilizada y no inmovilizada en la

producción de glucosa

Materiales
 Agua destilada/de grifo
 Aprox. 15ml de solución de maizena (media cucharadita pequeña de maizena disuelto en
medio vaso de agua)
 Tintura de yodo o alcohol yodado

Procedimiento
 Disponer de 3 vasos transparentes y rotular como C (control), EI (Enzima
inmovilizada) y EL (Enzima libre)
 En C colocar 15 ml de solución de maizena mas 3ml de agua.
 En EI colocar 15 ml de solución de maizena mas la totalidad de perlas obtenidas en
el paso anterior Inmovilización de amilasa mas 3ml de agua destilada.
 En EL colocar 15ml de solución de maizena mas 3mL de saliva
 Incubar aprox a 37°C por 30 minutos en baño María.

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 Transcurrido ese tiempo extraer 2mL de cada tubo y colocarlo en otros tubos
rotulados correspondientes.
 Agregar 3 a 4 gotas de lugol a cada tubo.
 Observar el tipo de cambio en la intensidad de color.

Tratamientos Observaciones características respecto al cambio de color

Control
EI
EL

III. RESULTADOS

Anote los resultados de cada experimento. Agregando imágenes, esquemas o gráficos etc.
Asimismo, realice la interpretación considerando los aspectos teóricos, reacciones
químicas, entre otros.

IV. CONCLUSIONES
Anote las conclusiones de manera clara y precisa en un párrafo por cada experimento.
CONCLUSIONES
1.

2.

3.

V. CUESTIONARIO
1. Explique ¿Por qué se utilizó la temperatura de 37°C para la actividad de la amilasa
salival? ¿Qué ocurriría si utiliza 30 o 42°C?
2. ¿Qué factores afectarían a la actvidad de la enzima inmovilizada?
3. Nombre algunos alimentos/ productos en casa obtenidos por biotecnología.

VI. REFERENCIAS.

1 Cebrian cabo, S. 2020. Nuevos métodos y soportes para la inmovilización de enzimas.

Trabajo de fin de Máster universitario de la universidad de Valencia.
2 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA. 1971.
3 Arroyo, M.; Acebal, C.; de la Mata, I. 2014. Biocatálisis y biotecnología. ARBOR,
Ciencia y Cultura. Vol.190-768
4 Arroyo, M:1998 Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones. Ars
Pharmaceutica, 39:23-39.

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