TEMA 2.

PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO

Las alteraciones de origen enzimático son muy variadas, y muchas de ellas influyen
negativamente en la calidad del alimento, aunque otras veces estas alteraciones pueden ser
Las modificaciones causadas por enzimas son de dos tipos:

- Procesos bioquímicos normales en la vida del alimento

- Cambios bioquímicos durante el deterioro

1. PROCESOS BIOQUÍMICOS NORMALES

Se trata de procesos deseables en el alimento.

- Respiración: este proceso es importante en hortalizas

- Maduración: importante en frutas

*la respiración y la maduración son procesos post-recolección. Se dan durante el desarrollo

del alimento o del vegetal

- Germinación de cereales: cerveza, pan...

- Procesos de transformación del músculo en carne: son procesos post-mortem

2. CAMBIOS BIOQUÍMICOS DURANTE EL DETERIORO

Procesos indeseables ocasionados en la post-recolección del alimento o en su procesado

- Pardeamiento enzimático
- Formación de olores y sabores indeseables
- Alteración del valor nutritivo

Las consecuencias de estas alteraciones son cambios en la calidad sensorial del alimento
como modificaciones del olor, sabor, aroma, textura, color.

Los cambios pueden ser favorecidos o no dependiendo del tipo de producto y del grado de
alteración que presente.

PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO

Alteración en el alimento que se manifiesta con la formación de colores oscuros y la pérdida

de sabor, e incluso, de contenido nutricional.

El pardeamiento u oscurecimiento de los alimentos puede seguir dos mecanismos claramente

distintos:

1. Los de carácter enzimático, en los que intervienen enzimas propias del alimento
2. Y los de carácter no enzimático provocados por procesos estrictamente químicos.

- Requiere enzima

CARÁCTER ENZIMÁTICO - Requiere el sustrato apropiado

- Requiere contacto con oxígeno

El fenómeno de pardeamiento es una de las principales causas de pérdida de calidad y valor
comercial de frutas y vegetales convirtiéndose en un problema de primera magnitud en la
industria agroalimentaria.

Se debe fundamentalmente a tres procesos:

- Procesos fisiológicos durante la maduración: crecimiento

- Procesos asociados a la recolección: recogida y almacenamiento
- Tratamientos tecnológicos post-recolección: procesado

Produce cambios importantes tanto en la apariencia como en las propiedades organolépticas

de frutas y vegetales comestibles, además suele ir asociado al desprendimiento de olores y
efectos negativos sobre el valor nutricional.

Alteraciones del color que reducen el valor

PROBLEMÁTICO comercial y nutricional del alimento. Incluso
puede hacerlos inaceptables para el consumo

- Frutas (plátano, manzana...)

- Champiñón, patatas...
- Aguacate
- Crustáceos
- Industria del vino

Contribuye al desarrollo de olores y

VENTAJOS
colores característicos
O

- Preparación de la sidra
- Maduración de los dátiles
- Maduración de las pasas
- Fermentación del té
- Secado de los granos de cacao

El pardeamiento enzimático es muy característico de alimentos de origen vegetal.

También en alimentos de origen animal ocurre la melanosis o moteado negro, mediante un

proceso es muy similar al pardeamiento vegetal, ya que en ambos están implicados los
mismos enzimas.

1. Mecanismo
- Lindlet, 1895: el mecanismo era de naturaleza enzimática
- Onslow, 1920: los sustratos implicados en el
oscurecimiento eran de naturaleza fenólica tales como el
catecol.

El pardeamiento enzimático engloba a un conjunto de reacciones

de oxidación que ocurren en todos los seres vivos y del cual son
responsables un grupo de enzimas denominadas polifenoloxidasas
(ppo) en sus primeras etapas y siempre en presencia de oxígeno.
Estas enzimas actúan sobre fenoles o polifenoles.
Se desencadena cuando se produce una pérdida de la integridad celular en la superficie de
las frutas o verduras. Esto provoca una destrucción de la compartimentación de enzimas y
sustratos, que al ponerse en contacto entre ellos y con la presencia además del oxígeno del
aire, en unos minutos se originan compuestos coloreados.

Los fenoles oxidados continúan dando reacciones de polimerización originando pigmentos

oscuros (llamados melaninas) responsables del cambio de color que se observa, por ejemplo,
cuando troceamos una fruta.

2. Enzimas implicados

Las enzimas que catalizan esa transformación pertenecen a las oxidorreductasas, y se

conocen con diferentes nombres dependiendo del material biológico donde se encuentre.
Estas enzimas están ampliamente distribuidas en microorganismos, plantas y animales,
cumpliendo varias funciones biológicas. Abundan en frutas como la manzana, al plátano, la
pera, la fresa y otras, pero no se encuentran en productos más ácidos como la lima, la naranja,
el melón o el limón.

Las polifenoloxidasas (PPO) (también llamadas catecol oxidasas,

ortodifenol oxidasas o tirosinasas) se encuentran mayoritariamente en las
plantas.

Están siempre localizadas en orgánulos celulares: cloroplastos y

mitocondrias. Se encuentran unidas a la membrana o de forma soluble
(aumenta esta proporción con la maduración del fruto).

La PPO son metal o enzimas que contienen un 0,2% de cobre. El Cu

situado en el centro de la enzima es esencial para la actividad de la PPO.

La PPO de la batata o papa dulce (Ipomoea batatas) se ha convertido en modelo para las
investigaciones de estructura y función de este tipo de enzimas. Esta PPO presenta forma
elipsoidal. La estructura secundaria es primariamente helicoidal, con un núcleo constituido
por un haz de cuatro hélices (α2, α3, α6, y α7). Este haz helicoidal aloja a los dos sitios
catalíticos y está rodeado por las hélices α1, α4 y varias hojas β cortas.
 A) Esquema de cilindros (que representan las hélices alfa) y
cintas (que representan las hojas beta) en el que se
muestra la ubicación de los átomos de cobre,
B) Estructura elipsoidal de la enzima,
C) Sitio activo de la tirosinasa en el que se localizan los
átomos de cobre,
D) Átomos de cobre coordinados con los residuos de histidina
dentro del sitio activo,
E) Disposición espacial de las histidinas que rodean a los
átomos de cobre.

Cada uno de los dos sitios de cobre está delimitado por tres histidinas (aminoácido que se
representa con la letra H) presentes en las cuatro hélices del haz).

El sitio de cobre A está flanqueado por las histidinas 88, 109 y 118. La His 88 está localizada
en la mitad de la hélice α2, la His 109 y la His 118 están al comienzo y en la mitad de la hélice
α3 respectivamente.

El sitio de cobre B está delimitado por las histidinas 240, 244 y 274. Estos aminoácidos se
encuentran en la mitad de las hélices α6 y α7. Además de las seis histidinas, existe una
molécula (posiblemente un ión hidróxido) que completa la zona de acoplamiento (la cual
presenta una forma piramidal trigonal) para ambos iones
metálicos con las histidinas 109 y 240.

La distancia cobre-cobre es de 2.9 Å, pero tras la

reducción de la enzima, la separación metal-metal se
incrementa significativamente a 4.4 Å, mientras las que
histidinas se mueven levemente y no se observa cambio
conformacional significativo para otros aminoácidos de la
proteína.

La distancia cobre-cobre es de 2.9 Å, pero tras la reducción de la enzima, la separación metal-

metal se incrementa significativamente a 4.4 Å, mientras las que histidinas se mueven
levemente y no se observa cambio conformacional significativo para otros aminoácidos de la
proteína.

Una característica interesante del sitio catalítico es la presencia de un enlace covalente tioéter
formado entre la histidina 109 y el átomo de azufre de la cisteína 92. Parece ser que este
enlace confiere restricciones estructurales adicionales a la región del centro del cobre A.
MECANISMO GENERAL

Se trata de una enzima inusual en el sentido que cataliza dos tipos de reacciones distintas. La
primera reacción (1) es una hidroxilación de monofenoles a orto-difenoles (actividad
cresolasa: oxigenasa). La segunda reacción (2), o actividad catecolasa (oxidasa), consiste en
la oxidación de odifenoles a o-quinonas.

La actividad cresolasa de la enzima es un reflejo de un comportamiento de oxigenasa

(incorpora uno o dos atomos de oxígeno por mol de sustrato). Mientras que la actividad
catecolasa es un caso de actividad enzimática de una oxidasa (transferencia de electrones del
sustrato al oxígeno).

Esta doble vertiente de la polifenoloxidasa origina una variedad de calificaciones y

nomenclaturas. Por la hidroxilación se la llama monooxigenasa, tironasa, monofenolasa o
cresolasa, entre otros. Por la oxidación, podemos llamarla oxidasa, difenolasa o catecolasa.
En general nos referiremos a ellas como polifenoloxidasas (PPOs).

Función de las PPO en las plantas:

Hay distintas teorías que explican la función de las PPOs en las plantas:

- Tienen función defensiva, ya que se forman quinonas y melaninas (pigmentos que se

obtienen al final de la reacción), los cuales parece que inhiben enzimas de
determinados microorganismos e inactivan virus.
- otra teoría dice que las melaninas son polímeros insolubles y su formación sirve de
barrera para el avance de una posible infección.

La forma de actuación del enzima, con dos actividades distintas (hidrosilación y oxidación), ha
sido un misterio, aclarado en parte hace relativamente pocos años. El enzima cataliza dos
reacciones porque en el estado natural se encuentra en dos formas distintas, la llamada MET
coordinada con OH, que es activa solamente sobre polifenoles, y la OXY coordinada con dos
átomos de oxígeno. Estas formas se interconvierten entre ellas, de forma acoplada al
desarrollo de las reacciones que catalizan, mediante unión de difenol o monofenol al sitio
activo.
REACCIONES

Siguiendo un mecanismo ordenado, el enzima liga primero el

oxígeno. Se produce un cambio de valencia de los iones de cobre
de Cu I a Cu II. A continuación, se introduce un monofenol o
difenol formándose complejos con enlaces O – O polarizados.

HIDROXILACIÓN (actividad cresolasa). La primera de

ellas, cuando el sustrato presente es un monofenol, es
su transformación en difenol. La hidroxilación es más
lenta porque necesita la forma OXY de la enzima, menos
abundante. Por mol de oxígeno consumido origina un
mol de agua.

OXIDACIÓN (actividad catecolasa). La transformación

del difenol en quinona. Dependiendo de la fuente de la
enzima, la actividad cresolasa es mayor o menor,
incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas
las enzimas tienen actividad catecolasa. Los
monofenoles sufren ambas reacciones (hidroxilación y
oxidación) en un solo episodio catalítico.
A partir de la formación de la quinona, la reacción progresa de forma espontánea. Las
quinonas se pueden convertir en trifenoles por reacción con el agua, y posteriormente
oxidarse a hidroxiquinonas.

Las hidroxiquinonas son la base de condensaciones oxidativas dando lugar a polímeros. Estos
productos finales, llamados melaninas, son de color muy oscuro, o negro, e insolubles en
agua, con estructuras complejas, no muy conocidas, cuyo esquema general es el detallado.

Las proteínas y los aminoácidos también pueden reaccionar a través de los grupos aminos y
tioles libres con las quinonas para dar compuestos de coloración intensa.
Además de reaccionar consigo mismas para formar melaninas y polímeros, las o-quinonas se
pueden transformar combinándose con compuestos no fenólicos

- aniones inorgánicos
- grupos tiol
- grupos amino de aminoácidos y proteínas
- agentes reductores

Imprescindible:

- que exista una desorganización de la estructura del alimento (provocada por un

proceso mecánico como pelado o golpeado de frutas)
- que el alimento posea compuestos fenólicos
- que se presente actividad enzimática
 - que haya contacto con el oxígeno

El grado de pardeamiento en un alimento es muy variable y depende fundamentalmente de

tres factores:

- De la concentración y tipos de compuestos fenólicos

- De la actividad enzimática
- De los antioxidantes naturales que posea el alimento

Factores que influyen en la reacción de pardeamiento

*Velocidad: dependerá de factores tales como,

- La concentración y actividad de la enzima

- La cantidad y naturaleza de los compuestos
fenólicos:
o La especie
o La variedad
o El estado fisiológico de los frutos
- La cantidad de oxígeno disponible en el
entorno del tejido vegetal
- Otros: pH, temperatura, actividad del agua

*El pH: el pH óptimo se sitúa entre 5 y 7. Está relacionado con el pH óptimo de la actividad de
las polifenoloxidasas y de las reacciones no enzimáticas posteriores.

*La temperatura: tiene un efecto directo sobre las reacciones enzimáticas y sobre la
modificación del color de los productos vegetales. El óptimo para las PPO está sobre 25- 35C.
Por debajo, las velocidades de las reacciones son bajas; y por encima, hay inactivación
térmica de las enzimas.

Si se baja mucho la temperatura, se originan deslocalizaciones celulares en los productos

vegetales que favorecen el pardeamineto. Por tanto hay que almacenar los productos en frío
para disminuir la velocidad de las reacciones, pero que no se originen deslocalizaciones
celulares.

*Actividad del agua: el descenso de la actividad del agua frena las actividades enzimáticas por
una menor movilidad de los sustratos y de los productos de reacción. Pero en el caso de los
productos vegetales, un descenso de la actividad del agua es incompatible con la
supervivencia del vegetal, originado problemas fisiológicos con mayores consecuencias sobre
el pardeamiento enzimático.

SUSTRATOS

Los sustratos más comunes son compuestos insaturados, principalmente los que tienen
estructuras fenólicas y polifenólicas en los alimentos de origen vegetal:

- Orto-difenoles y derivados (pirocatecol, ácido cafeico

 - Compuestos derivados de la L-tirosina (dopa en la patata o dopamina en los plátanos),

- Ácidos orgánicos con anillos aromáticos (ácido gálico y ácido clorogénico, en

manzanas y peras),

- Los flavonoides que pueden encontrarse bajo distintas formas,

- Los taninos en el café y el cacao,
- Las antocianinas en diversas frutas

Sin embargo, existen otros compuestos hidroxílicos no fenólicos que también pueden actuar
como sustratos de la reacción:

Otros no son propiamente polifenoles porque no todos son derivados polihidroxílicos:

El papel de los polifenoles en la alimentación engloba aspectos bien diferentes. Son
compuestos con notable repercusión en la calidad sensorial del alimento, a muchos niveles:

- Sabor: los ácidos fenólicos proporcionan acidez, las dihidrochalconas sabor dulce,
ciertas flavonas como la naringina aportan amargor.
- Olor: Los atributos olorosos del vino, la vainillina o los característicos olores de
ahumados o especias se deben también a compuestos fenólicos.

Por otro lado, los compuestos fenólicos contribuyen a la salubridad alimentaria debido a sus
propiedades antibacterianas.

Otra de las funciones características de los polifenoles surge de sus probadas propiedades
antioxidantes. La eficacia de estos antioxidantes naturales reside en un mecanismo
antirradicales libres.

CONTROL DE LA REACCIÓN DE PARDEAMIENTO

El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente

mediante la compartimentalización de los sustratos. El enzima se encuentra en los
cloroplastos, mientras que los compuestos fenólicos se acumulan en vesículas.

Cuando se rompe la compartimentalización por un daño mecánico (el triturado, corte o

congelación y descongelación) la reacción de pardeamiento se puede producir.

Los métodos desarrollados para controlar el proceso de pardeamiento son preventivos. Se

dividen en dos tipos:

1. Métodos químicos: sobre el enzima, los sustratos (fenoles o disponibilidad de O2) o sobre
los productos de la reacción. De difícil clasificación ya que los inhibidores químicos pueden
actual simultáneamente sobre varios de los componentes de la reacción

2. Modos que los tecnólogos aplican para conservación de los productos alimentarios, esto
es, aplicando: métodos físicos de conservación.

3. METODOS FÍSICOS

Lo métodos físicos habituales son la aplicación de calor y la conservación en refrigeración

(métodos térmicos). Sin embargo, han surgido recientemente métodos físicos muy
innovadores buscando alternativas que sustituyan a los métodos químicos ya que son
considerados como perjudiciales para el hombre y el medio ambiente.
Entre las innovaciones más destacadas están la conservación bajo una atmósfera variable,
controlada y programada y los recubrimientos comestibles (métodos NO térmicos).

TRATAMIENTOS TÉRMICOS

- Aplicación de alta temperatura: El tratamiento de inactivación enzimática por calor

causa la desnaturalización irreversible de proteínas. A pesar de su eficacia,
normalmente sólo se recomienda cuando se trata de inhibir el pardeamiento en frutas
o vegetales que son destinadas a congelación y a producciones en conserva.
- Empleo de bajas temperaturas: A temperaturas bajas, no sólo es reducida o inactivada
las actividades enzimáticas que son responsables del pardeamiento, sino que además
las velocidades metabólicas descienden significativamente.
- Empleo de ondas electromagnéticas: El efecto de la energía de microondas en la
inactivación enzimática ha sido generalmente atribuido a efectos térmicos, aunque hay
alguna evidencia de efectos no térmicos.

TRATAMIENTOS NO TÉRMICOS

- Reducción de la disponibilidad de oxígeno: la eliminación total de oxígeno puede

obtenerse por desoxigenación a vacío o borboteo de nitrógeno, sin embargo, no es
conveniente porque los tejidos necesitan O2. La eliminación del oxígeno más sencilla
es por inmersión en disoluciones como jarabe, salmueras o agua para retardar la
difusión del oxígeno (recubrimientos comestibles). Otra alternativa sería el envasado
del producto en atmósfera inerte, pero el desarrollo de metabolismo anaerobio
alteraría las propiedades organolépticas de las frutas. Frecuentemente por tanto se
usan atmósferas modificadas para la comercialización de frutas y hortalizas
(atmósferas modificadas).
- Irradiación: La aplicación de irradiaciones (radiación ionizante) a frutas y a hortalizas
se emplea para la desinfestación de insectos y control de enfermedades.
Recientemente, la irradiación ha sido propuesta como método para la obtención de
frutas y hortalizas mínimamente procesadas. Los estudios realizados son
contradictorios y no determinantes.
- Altas presiones: se trata de una técnica prometedora ya que inactiva microorganismos
y enzimas dejando las propiedades nutritivas y la calidad del alimento prácticamente
intactas. Provoca una inactivación enzimática irreversible, y, por lo tanto, es una
alternativa a la elevación de temperatura.
- Pulsos eléctricos: el uso de campos eléctricos pulsantes es una reciente tecnología
que se ha planteado para la inactivación de microorganismos y de enzimas, donde se
da un aumento mínimo de temperatura con lo cual se conserva la cantidad nutricional
de los productos.
- Modificaciones genéticas: esta modificación comprende dos opciones: nuevas
variedades sin polifenoloxidasa, que no presenten dichas actividades enzimáticas o al
menos su actividad sea mucho menor, o la selección de variedades pobres en
sustratos fenólicos.

4. METODOS QUÍMICOS

La metodología más extendida para evitar el pardeamiento consiste en la utilización de

agentes químicos que actúen como inhibidores, interaccionando directamente sobre las
enzimas, los sustratos o los productos de las reacciones enzimáticas.
Su aplicación esta reglamentada por los organismos correspondientes y su dosificación o
aplicación están restringidos total o parcialmente en algunos de ellos, por consideraciones
toxicológicas y/o impactos organolépticos en sabor, aroma, color y textura.

Pueden actuar sobre:

- Las enzimas (por inactivación): la acidificación y los tratamientos térmicos se emplean

habitualmente combinados ya que las PPOs son activas entre los valores de pH de 5
a 7. Para desactivarlas es necesario bajar el pH a 3, difícil de conseguir
- Los sustratos: mediante la eliminación del oxígeno o del fenol del medio de reacción.
La wliminacion del O2 no es posible porque en organismos vivos causa condiciones
anaeróbicas.
Se puede eliminar el fenol por medio de adsorbentes específicos (ciclodextrina) o por
modificación enzimática a través de o-metiltransferasa que metila los grupos hidroxilo
de los fenoles
- Los productos de reacción: reduciendo de nuevo las quinonas a fenoles o haciendo
que éstas reacciones con otros compuestos para formar complejos no coloreados

INHIBICIÓN DE LOS ENZIMAS

Disminuir el pH por debajo de 4, se puede llevar a cabo siempre que la acidez sea tolerada
desde el punto de vista gustativo.

Se usan ácidos como: cítrico, málico, fumárico, clorhídrico y fosfórico, sobre todo

El descenso de la actividad enzimática se debe a un debilitamiento de la afinidad del Cu por

el centro activo de la enzima.

Otros compuestos tienen la capacidad de acomplejar el Cu y dejar de estar disponible en la

reacción de pardeamiento: citrato, pirofosfato de sodio y el EDTA

Cloruro de sodio y de calcio también son usados para inhibir la reacción. El cloruro calcio
mantiene la integridad de los tejidos.

Otros halogenuros se usan forman complejos con el Cu y lo libera del centro activo de la
enzima.
MODIFICACIÓN O ELIMINACIÓN DE LOS SUSTRATOS DE OXIDACIÓN

La eliminación del oxígeno se lleva a cabo por inmersión de los productos en siropes,
salmueras o rebozado.

También se pueden envasar los alimentos en atmósferas pobres en oxígeno (atmósferas

modificadas o inertes).

Los sustratos fenólicos se pueden reducir o eliminar por selección de variedades naturalmente
pobres en compuestos fenólicos o por la utilización de métodos físicos.

Las ciclodextrinas (oligosacáridos cíclicos formados por unidades de glucosa) se han utilizado
ya que sus cavidades internas hidrófobas permiten la formación de complejos de inclusión
con polifenoles.

Sim embargo, eliminar los compuestos fenólicos no es siempre deseable ya que éstos ejercen
una acción directa sobre la calidad sensorial y nutricional de los alimentos.

Una alternativa es transformar de manera irreversible los o-difenoles

en fenoles metilados por la acción de la o-metiltransferasa.

Sin embargo, el alto coste de obtención de o-metiltransferasas limita

su utilización para la prevención del pardeamiento enzimático.

ACCIÓN SOBRE LOS PRODUCTOS DE REACCIÓN

Se pueden utilizar diversos agentes para prevenir el pardeamiento que actúan esencialmente
como reductores de las o-quinonas originando de nuevo los o-difenoles que originan
compuestos de adición con los agentes añadidos no coloreados.

Su efecto es temporal ya que desaparecen como consecuencia de las reacciones de oxido-

reducción en las que participan.

Entre estos agentes, los más eficaces son los sulfitos. Los sulfitos reducen las quinonas y
forman compuestos de adición incoloros. Su uso está muy reglamentado por riesgos para la
salud.

Los compuestos que contienen tioles, como la cisteína,

también son agentes reductores que inhiben el
pardeamiento. Sin embargo, para que sea efectiva hay que
añadir una gran cantidad y eso afecta al sabor del alimento
en muchos casos.

Ácido ascórbico: es el más recomendado para evitar

o minimizar el pardeamiento enzimático, por su
carácter vitamínico inofensivo. El ácido ascórbico
por sí mismo no es un inhibidor de la enzima: actúa
sobre el sustrato, de modo que puede adicionarse
después de haberse formado las quinonas. Tiene la
propiedad de oxidarse a ácido dehidroascórbico,
reduciendo la quinona a fenol hasta que se haya transformado totalmente en dehidroascórbico
que ya no puede reducir las quinonas.
Además también puede reducir el Cu del centro activo de la PPO.

TRATAMIENTOS COMBINADOS

Se pueden lograr tratamientos más efectivos para la conservación de productos frescos cortados
usando tratamientos combinados.

Uno de ellos incluye el ácido ascórbico y el cloruro de calcio.

Otros incluyen el empleo de ácido ascórbico y métodos físicos como el tratamiento con calor o
atmósfera controlada. La combinación de 0,5% de O2 y 1% de CaCl2 parece ser muy efectiva en peras,
por ejemplo.