CAPACIDAD DE PRODUCCIÓN DE PHA’S Y EL EFECTO DEL PH EN LA PRODUCCIÓN

DE LEVANO UTILIZANDO UNA LEVADURA

PRODUCTION CAPACITY OF PHA'S AND THE EFFECT OF PH ON LEVAN

PRODUCTION USING A YEAST

Mariana González-Torres1, Francisco Hernández-Rosas1, Ricardo Hernández-Martínez2*

1
Colegio de Postgraduados-Campus Córdoba, Carretera Federal Córdoba‑Veracruz Km 348, Congregación
Manuel León, Municipio Amatlán de los Reyes, 94946 Veracruz, México

2
CONACYT- Colegio de Postgraduados-Campus Córdoba, Carretera Federal Córdoba‑Veracruz Km 348,
Congregación Manuel León, Municipio Amatlán de los Reyes, 94946 Veracruz, México

RESUMEN

Ante la necesidad de diversificación de la agroindustria azucarera, se han implementado nuevas estrategias para el
aprovechamiento de productos y co-productos con el objetivo de valorizar y obtener productos como los
biopolímeros y exopolisacáridos a través de procesos sustentables. En este estudio se aislaron y seleccionaron 11
cepas a las cuales se les determinó la capacidad para producir polihidroxialcanoatos (PHA’s) por el método de azul
de Nilo y negro de Sudán. Las cepas que presentaron capacidad de producción de PHA’s fueron sometidas a
fermentación sumergida y se cuantificaron los PHA’s y exopolisacáridos (EPS) producidos. Los polímeros fueron
analizados por FT-IR. Adicionalmente, se evaluó el efecto del pH para la producción de levano (una cepa). Las
cepas con la capacidad para producir EPS y PHA’s fueron caracterizadas morfológicamente macroscópica y
microscópicamente. Los resultados mostraron que tres cepas tuvieron la capacidad para producir PHA’s y EPS y
su análisis por FT-IR que eran polihidroxibutirato (PHB, para las tres cepas) y los EPS levano (dos cepas) e inulina
(una cepa). La caracterización macro y microscópica demostró que dos cepas eran bacterias y una levadura. Al
evaluar el pH para la producción de levano (utilizando la levadura) se encontró que la mayor concentración se
obtenía a un pH de 6.5.

Palabras clave: PHA´s, exopolisacáridos, levano, biotecnología

ABSTRACT

Owing to the need to diversify the sugar industry, new strategies have been implemented for the use of products
and co-products with the aim of valuing and obtaining products such as biopolymers and exopolysaccharides
through sustainable processes. In this study, 11 strains are isolated and selected, whose capacity to produce
polyhydroxyalkanoates (PHA's) is prolonged by the Nile blue and Sudan black method. The strains that showed
PHA production capacity were subjected to submerged fermentation and the PHA and exopolysaccharides (EPS)
produced were quantified. The polymers were analyzed by FT-IR. In addition, the effect of pH for levan production
(one strain) was evaluated. The strains with the capacity to produce EPS and PHA were characterized
macroscopically and microscopically morphologically. The results showed that three strains had the capacity to
produce PHA and EPS and their FT-IR analysis showed that they were polyhydroxybutyrate (PHB, for the three
strains) and the EPS levan (two strains) and inulin (one strain). Macro and microscopic characterization revealed
that two strains were bacteria and one yeast. When evaluating the pH for levan production (using yeast) it was
found that the highest concentration was obtained at a pH of 6.5.

Key words: PHA´s, Exopolysaccharide, levan, biotechnology

INTRODUCCIÓN
En México la agroindustria cañera representa un importante sector que impacta a la sociedad y economía
de manera relevante (Meghana y Shastri, 2020), tan solo para la zafra 2020-2021 se reportaron 5.7
millones de toneladas cosechadas, colocando a México como el sexto mayor productor en el mundo
(CONADESUCA, 2022). Sin embargo, este sector requiere de su diversificación mediante la emulación
del concepto de biorefinería para valorizar productos y coproductos generados durante la cosecha e
industrialización de la caña de azúcar, y con ello la optimización de los procesos de producción con el
principal objetivo de obtener beneficios económicos, sociales y ambientales (Boviatsi et al., 2020). En
este contexto se han desarrollado estrategias que permiten el aprovechamiento de los productos y
coproductos generados (Albarelli et al., 2018) a través de procesos biotecnológicos (químicos,
bioquímicos y termoquímicos) para la generación de bioproductos de alto valor agregado (Guerra et al.,
2019; Vaz, 2019). Los coproductos que más se producen en la industria azucarera son el bagazo, la
melaza y las vinazas (Santos et al., 2019).

La implementación de tecnologías sostenibles para la diversificación de la industria azucarera

proporciona múltiples ventajas como reducción del consumo de energía, reducción en los tiempos de
producción y uso de sustancias químicas tóxicas, además, permite la producción a gran escala, la
obtención de mayores rendimientos con menor costo en el proceso (Gharib-Bibalan, 2018). La
transformación de estos productos y coproductos puede permitir la producción de diversos productos
con valor agregado, entre los que se pueden destacar los biomateriales tales como son los bioplasticos y
exopolisacáridos que presentan potencial para ser aplicados en diversas áreas (Santos et al., 2019).

Los bioplásticos, como los polihidroxialcanoatos (PHA’s) son biopolímeros sintetizados por
microorganismos en forma de gránulos lipídicos que se acumulan almacenados en el citoplasma,
estructuralmente son poliésteres de ácidos 3-,4-,5- y 6- hidroxialcanoicos (Vega-Vidaurri et al., 2022).
Se ha reportado una amplia gama de microorganismos que producen PHA’s (Sehgal & Gupta, 2020).
Los PHA’s surgen como una alternativa biodegradable y sostenible ante la problemática ocasionada por
los plásticos convencionales, pueden ser producidos utilizando productos y coproductos de la
agroindustria azucarera (Javaid et al., 2020). Por otra parte, los exopolisacáridos (EPS) producidos por
microorganismos son polímeros biológicos secretados fuera de la célula que cumplen la función de
protección y fuente de energía (Vega et al., 2022).

Por otro lado, el levano es un homopolisacárido conformada por múltiples unidades de fructosa
(Chidambaram et al., 2019) y también puede ser producido utilizando productos o coproductos de la
agroindustria azucarera ya que la sacarosa es un inductor natural para su biosíntesis. Debido a las
propiedades fisicoquímicas que presenta este EPS, puede ser aplicado en diversas áreas como la
alimentaria, medicina y farmacia (Han et al., 2021). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la
capacidad de producción de pHAs y exopolisacáridos por cepas microbianas aisladas de la agroindustria
azucarera.

MATERIALES Y MÉTODOS
Determinación de la capacidad de producción de PHA’s de cepas microbianas

La capacidad de producción de PHA’s por las cepas aisladas de la agroindustria azucarera (Vega-
Vidaurri et al., 2022), codificadas como JM1, JA1, JF1, JF2, JF3, JF4, JC1, ML1, ML2, MA1 y TA1,
fue determinada por el método de tinción con negro de Sudán y por el método de azul de Nilo en placa
(Kosmachevskaya et al., 2020).

Para la tinción con negro de Sudán, las cepas microbianas aisladas fueron inoculadas en placas de agar
nutritivo (BD Bioxon®) suplementados con 20 g/L de sacarosa e incubadas a 37 °C durante 48 h. Después
del crecimiento en placa, se realizó un frotis y la biomasa fue teñida con una solución de negro de Sudan
(Hycel®) al 0.3% (Kosmachevskaya et al., 2020) en etanol al 70%, se dejaron reposar 30 min y fueron
lavadas con xileno (Fermont™) durante por 20 segundos, posteriormente y se contra tiñeron con una
solución de safranina (Hycel®). Finalmente, fueron observadas al microscopio (National DC5-163)
(Chandani et al., 2020; Kosmachevskaya et al., 2020). Un resultado positivo se determina por la
aparición de manchas oscuras dentro de la célula.

Para la determinación de la capacidad de producción de PHA’s por las cepas bacterianas aisladas por el
método de azul de Nilo, las cepas aisladas fueron inoculadas en placas de agar nutritivo (BD Bioxon®)
suplementadas con 8 g/L de sacarosa (Fermont™) y 0.5 mg/mL de azul de Nilo (SIGMA®) y se
incubaron a 37 °C durante 72 h, se considera un resultado positivo se indica cuando la biomasa que
creció en las placas se torna de un color naranja fluorescente al irradiarse con luz ultravioleta (Arshad et
al., 2017).
Caracterización de las cepas aisladas

Para este análisis se seleccionaron las cepas con capacidad de producción de PHA’s. La caracterización
morfológica se realizó examinando visualmente las colonias, incluyendo el color, forma, bordes y
elevación de acuerdo a la técnica reportada por Ismail et al (2018). Para la caracterización bioquímica se
realizaron las siguientes pruebas: pruebas de catalasa, prueba de oxidasa, rojo de metilo, Vogues
Proskauer y citrato.

Cultivo en medio líquido para la producción de PHA’s

La producción de PHA’s se realizó utilizando matraces Erlenmeyer de 250 mL como unidad
experimental y medio de cultivo compuesto por (g/L): caldo nutritivo (BD Bioxon ®) (23), sacarosa
(Difco™) (20), cloruro de amonio (Fermont™), (2), fosfato dibásico de potasio (Karal ®) (1.5). La
concentración del inóculo se ajustó a 2x105 unidades formadoras de colonias (UFC) y el cultivo se
mantuvo a 37 °C durante 72 horas a 150 rpm, realizando un muestreo periódico cada 12 horas (Ammar
et al.,2021; Lee,2020; Samrot et al.,2011).

Preparación del inóculo para fermentación líquida

La cepa se cultivó en medio líquido caldo Luria (Difco™), pH 6.8, y se mantuvo a 30°C a 150 rpm
durante 24 h. El número de células viables se determinó mediante recuento en cámara de Neubauer. El
inóculo se expresó en unidades formadoras de colonias UFC/mL.

Producción y efecto del pH en la obtención de levano

La producción de levano se realizó en recipientes de vidrio con capacidad de 170 mL de geometría

uniforme con un volumen de trabajo de 75 mL mediante fermentación líquida (Srikanth et al., 2015),
conteniendo (g/L): sacarosa (40.0), peptona bacteriológica (10.0), (NH4)2SO4 (1.0), KH2PO4 (1.0) y
MgSO4·7H2O (1.0). Las condiciones de producción de levano se ajustaron de la siguiente manera: pH
6.0, tamaño de inóculo de 1x106 UFC/mL (Castilla-Marroquín et al., 2020), y se mantuvo a 30 °C a 150
rpm utilizando un agitador orbital (IKATM KS260). Además, se estudió el efecto de diferentes valores
iniciales de pH del medio de producción, de 5.0 a 8.0 (Zhang et al., 2014).

Caracterización FT-IR de los exopolisacáridos producidos

Los análisis de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) para los PHA y EPS obtenidos por las
cepas aisladas se realizaron utilizando un espectrómetro de infrarrojos Bruker™ Vertex 70 (con una
resolución de 3 cm–1) en modo de muestreo de reflexión total atenuada (ATR). Para el análisis de los
espectros de EPS se utilizaron los siguientes estándares comerciales: Inulina de tubérculos de dalia
(SIGMA®), Levano de Erwinia herbicola (SIGMA®).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinación de la capacidad de producción de PHA’s de cepas microbianas

Los resultados de la determinación de la capacidad de producción de PHA’s por las técnicas negro de
Sudán y azul de Nilo, indicaron que, de las once cepas microbianas aisladas, tres mostraron la capacidad
de producción de PHA’s. La capacidad de producción de PHA’s por la estrategia de azul de Nilo indicó
un resultado positivo para la cepa ML2 ya que presentó una coloración naranja fluorescente al irradiarse
con luz ultravioleta (UV) (Figura 1a). Mientras que las tinciones con negro de Sudán arrojaron un
resultado positivo para las cepas JA1 y MA1 (Figura 1b). Los resultados son consistentes con lo
reportado por Lee y Rahim (2020), donde indicaron que los PHA’s acumulados en las colonias emiten
una fluorescencia naranja brillante el exponerse a luz UV. Por otra parte, el resultado de la tinción con
negro de Sudán no evidenció la presencia de gránulos oscuros dentro del citoplasma para la cepa ML2.
Se ha reportado que la prueba positiva es indicativa de la producción intracelular de los PHA’s (Tufail
et al., 2017; Rathika et al., 2019). Sin embargo, Morohoshi et al (2020) menciona que las acumulaciones
de PHA’s compiten con la acumulación de EPS por lo que se puede inferir que los PHA’s son expulsados
de la célula hacia el medio por lo cual esta prueba resultó negativa para la técnica de negro de Sudán,
pero positiva para la prueba de azul de Nilo en caja.

Figura 1. Determinación de la capacidad de producción de PHAs a) Método de azul de Nilo de la cepa ML2 y b)
Método de negro de Sudán de la cepa MA1.

Caracterización de las cepas aisladas

De las 11 cepas aisladas, 3 mostraron la capacidad de producción de PHA’s y fueron caracterizadas

mediante pruebas bioquímicas (Cuadro 1) y observadas microscópicamente en fresco. Los resultados de
las pruebas bioquímicas demostraron que dos cepas correspondían a bacterias (JA1 y MA1) y mediante
la observación en fresco se determinó que una cepa correspondía a una levadura debido a que se observó
la gemación en fresco (ML2).

Cuadro 1. Resultados de pruebas bioquímicas

Pruebas bioquímicas JA1 MA1

Catalasa + +
Rojo de metilo + +
Vogues-Proskauer - +
Citrato reductasa + +
Oxidasa reductasa + -
Forma Circular Circular
Color Blanco Blanco
Margen Regular Entera
Elevación Convexa Elevada

Producción de polihidroxialcanoatos en medio líquido

Las cepas que mostraron la capacidad de producir PHA’s en las pruebas cualitativas fueron sometidas a
un proceso de cultivo en medio líquido para su producción y cuantificación. Los resultados mostraron
que la cepa AJ1 presentó una relación directa entre el crecimiento (biomasa 102 mg/L) con la producción
de EPS (15 mg/L) y PHA’s (0.126 mg/L). Por otro lado, los resultados de producción de PHA’s para la
cepa MA1 muestran que existe una relación directa entre el crecimiento (biomasa 173.5 mg/L) con la
producción de EPS (16.5 mg/L) y PHA’s (1.15 mg/L). De la misma manera, los resultados de producción
de PHA’s para la cepa ML2 muestran existe una relación directa entre el crecimiento (biomasa 235
mg/L)) con la producción de EPS (86 mg/L) y PHA’s (0.83 mg/L).

Los resultados de los espectros FTIR mostraron que tres cepas bacterianas con capacidad para producir
PHA’s (aislados JA1, MA1 y ML2) tenían la capacidad de sintetizar polihidroxibutirato, como se
muestra en la Figura 2. Las bandas características del espectro mostraron que los grupos funcionales (–
CH) 2931 cm–1, (–C=O) 1732 cm–1, (CH3) 1379 cm–1, (–CH2 y CH3)1456 cm–1, y (–C–O)1055 cm–1
observados para los tres las cepas bacterianas coincidieron estrechamente con los resultados del estándar
PHB. Estos resultados corroboraron la capacidad de las tres cepas para la producción de PHB y fueron
similares a estudios anteriores (Silambarasan et al., 2021; Tohme et al., 2018).
Figura 2. Espectros FTIR de los polihidroxialcanoatos recuperados de cepas bacterianas aisladas JA1, MA1 y ML2
y de poli [(R)-3-hidroxibutírico ácido] (PHB) de referencia comercial.

Además, los análisis de EPS producidos por las tres cepas bacterianas mostraron que las cepas tenían la
capacidad de producir inulina y levano, como se muestra en la Figura 3a y 3b. El EPS producido por el
aislado JA1 mostró bandas de espectro características de la inulina. Por otra parte, el EPS producido por
MA1 y ML2 mostró bandas de espectro características de levano.

Figura 3. Espectros FTIR del exopolisacárido recuperado del aislado de la cepa bacteriana JA1 y de la referencia
comercial de inulina (a), y del exopolisacárido recuperado de las cepas bacterianas MA1 y ML2 y de la referencia
comercial de levano (b).

Efecto del pH en la obtención de levano

Para evaluar la producción de levano, la cepa utilizada fue la identificada como una levadura. Los
resultados en la determinación del pH óptimo para la producción de levano indicaron que se produjo un
incremento en los rendimientos al aumentar el valor de pH (Figura 4). Sin embargo, el mayor rendimiento
en la producción de levano se obtuvo empleando un pH inicial de 6.5 en el medio de fermentación.
 Además, se observó que valores de pH superiores a 6.5 producen una disminución en la producción del
EPS. Esto puede deberse a que la enzima que sintetiza el levano, levansacarasa, desarrolla su óptima
actividad catalítica a pH casi neutros (Ni et al., 2018). Los resultados obtenidos son similares a los
reportados por Ua-Arak et al (2017), donde obtuvo el mejor rendimiento en la producción de levano con
un pH de 6.5 utilizando Gluconobacter albidus.

Figura 4. Efecto del pH en la producción de levano.

CONCLUSIÓN

Se demostró que tres cepas autóctonas tenían capacidad de coproducir PHA’s y EPS en un medio de
cultivo con sacarosa, siendo muy relevante ya que la coproducción puede permitir la reducción de costos
de producción, asimismo, se logró determinar la importancia del control del pH para la producción de
levano por una levadura.

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