AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS FÚNGICAS AUTÓCTONAS DE

CAÑA DE AZÚCAR PARA LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF AUTOCHTHONOUS SUGARCANE

FUNGAL STRAINS FOR HYDROLYTIC ENZYME PRODUCTION

Serafin Pérez Contreras1, Francisco Hernández Rosas1, José Andrés Herrera Corredor1, Elizabeth del Carmen Varela
Santos2, Julissa Yamilet Rojas Jiménez3, Ricardo Hernández Martínez4*.

1Colegio de Postgraduados Campus Córdoba, Carretera Federal Córdoba-Veracruz Km 348, Congregación Manuel León,
Municipio Amatlán de los Reyes, 94946 Veracruz, México.

2Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca, Tierra Blanca, Veracruz, México.

3Universidad Autónoma Chapingo, Parasitología Agrícola. Km 38.5 Carretera México-Texcoco, Edo. de México. C.P.
56230, México.

4CONACYT- Colegio de Postgraduados Campus Córdoba, Carretera Federal Córdoba-Veracruz Km 348,Congregación

Manuel León, Municipio Amatlán de los Reyes, 94946 Veracruz, México, correo: odracirhema@gmail.com.

RESUMEN
El presente trabajo consistió en el aislamiento de 2 cepas fúngicas a partir de hoja de caña de azúcar
(HCA) y bagazo de caña de azúcar (BCA) con capacidad para producir enzimas hidrolíticas
específicas para biomasa lignocelulósica de caña de azúcar. El objetivo del trabajo fue aislar e
identificar mediante características morfológicas, cepas fúngicas con capacidad para la producción
de celulasas y xilanasas extracelulares. Las cepas fúngicas fueron aisladas de BCA (ingenio azucarero
local) y HCA (Mex 72-2086 del Colegio de postgraduados Campus Córdoba). Para el aislamiento de
las cepas el BCA y HCA fueron colocadas en una cámara húmeda a 31°C por 7 días para favorecer
el desarrollo de microorganismos autóctonos, posteriormente fueron sembradas en cajas Petri con
agar cloranfenicol rosa de bengala y diclorán (ACRBD), realizando subcultivos hasta la observación
de cultivos puros. Las cepas puras fueron caracterizadas de acuerdo a sus características micro y
macroscópicas: hifas, conidios, conidióforos, así como apariencia y color (respectivamente). La
capacidad para producir enzimas hidrolíticas fue evaluada cualitativamente en caja Petri, utilizando
carboximetil celulosa (CMC) y xilano de abedul (XA) como única fuente de carbono, la capacidad
de producción de enzimas se observó revelando el halo de hidrolisis con una solución de rojo congo.
Fueron aisladas 2 cepas fúngicas que presentaron características macro y microscópicas que
coincidían con el género Trichoderma, color blanco-amarillento, conidios verdes y medio de cultivo
amarillo, conidios globosos, conidióforos ramificados y fiálides con forma de botella alargada. Los
aislados fúngicos mostraron capacidad para producir enzimas hidrolíticas ya que formaron halo de
hidrolisis en presencia de CMC y XA lo cual demuestra su capacidad para producir celulasas y
xilanasas extracelulares.

Palabras clave: Bagazo de caña de azúcar, Hojas de caña de azúcar, Trichoderma, Celulasas,
Xilanasas.

ABSTRACT
In the present work, two fungal strains with the capacity to produce hydrolytic enzymes specific for
lignocellulosic sugarcane biomass were isolated from sugarcane leaves (SCL) and sugarcane bagasse
(SCB). The objective of this work was isolate and identify fungal strains with the capacity to produce
extracellular cellulases and xylanases, by morphological characteristics. The fungal strains were
isolated from SCB (local sugar mill) and SCL (Mex 72-2086 of the Colegio de postgraduados Campus
Córdoba). For isolation of the strains, the BCA and SCL were placed in a humid chamber at 31°C for
7 days to favor the development of autochthonous microorganisms; they were subsequently sown in
Petri dishes with Dicloran rose bengal and chloramphenicol agar (DRBCA), and subcultured until
pure cultures were observed. The pure strains were characterized according to their microscopic and
macroscopic characteristics: hyphae, conidia, conidiophores as well as appearance and color
(respectively). The ability to produce hydrolytic enzymes was qualitatively evaluated in Petri dish,
using carboxymethyl cellulose (CMC) and birch xylan (XA) as sole carbon source, the enzyme
production capacity was observed by revealing the hydrolysis halo with a congo red solution. Two
fungal isolates showed macrocroscopic and microscopic characteristics that coincided with the
Trichoderma genus, yellowish-white color, green conidia and yellow culture medium, globose
conidia, branched conidiophores and elongated bottle-shaped phialides. The fungal isolates showed
ability to produce hydrolytic enzymes as they formed hydrolysis halo in the presence of CMC and
XA which demonstrates their ability to produce cellulases and extracellular xylanases.

Keywords: Sugarcane bagasse, Sugarcane leaves, Trichoderma, Cellulases, Xylanases.

 INTRODUCCIÓN
Las enzimas han tenido varias aplicaciones biotecnológicas, durante décadas se han empleado en la
producción de textiles, detergentes, papel, alimentos para animales y humanos. Así mismo las
enzimas también se aplican en procesos industriales para eliminar o reducir el uso de altas
temperaturas, disolventes orgánicos y pH extremos, al tiempo que ofrecen una mayor especificidad
de reacción, pureza del producto y un menor impacto ambiental (Ferreira et al., 2018).

Algunas de las enzimas con mayor demanda industrialmente son las celulasas y xilanasas, usadas
ampliamente en los sectores alimentario, papelero, agrícola, farmacéutico, en procesos de
fermentación y producción de biocombustibles (Singh et al., 2021). Además, son fundamentales para
el aprovechamiento de residuos lignocelulósicos (como el bagazo de caña), que requieren de varios
grupos enzimáticos para la liberación eficiente de azúcares fermentables. (de França Passos et al.,
2018). En este contexto, la producción de enzimas hidrolíticas se ha centrado en los hongos
filamentosos, por su eficiencia en la producción de estás enzimas, en particular en las involucradas
en la deconstrucción de biomasa lignocelulósica. Además, debido a su versatilidad, los hongos
filamentosos se pueden aislar de una gran variedad ambientes diferentes, estrategia que ha sido
empleada como un método para encontrar enzimas hidrolíticas eficientes (Lübeck y Lübeck, 2018).

El uso de cepas fúngicas con potencial para la producción de enzimas hidrolíticas depende de su
capacidad, por lo que para su selección es necesario evaluar su potencial para expresar la actividad
enzimática, para el caso de las celulasas y xilanasas existen técnicas que hacen uso de ensayos de
azúcares reductores, cromatografía en capa fina (TLC), o cromatografía líquida de alto rendimiento,
con sustratos como el CMC, P-nitrofenil β-D-glucopiranósido, β-metilumbeliferil-oligosacáridos o
hidroxietilcelulosa (Karthika et al., 2020; Kumar et al., 2018; Ogonda et al., 2020; Rahman et
al., 2018; Zhang et al., 2006). Sin embargo, también existen métodos sencillos para evidenciar la
actividad hidrolítica (cualitativamente) y evaluar el potencial de una cepa para la producción de
enzimas hidrolíticas (Kun et al., 2019; Kasana et al., 2008).

Sin embargo, existen estrategias cualitativas que permiten tener confiable y en lapsos de tiempo cortos
y sin requerir mucho material, tal es el caso de los ensayos en placa de agar que has servido
históricamente para la selección de cepas productoras de diferentes enzimas hidrolíticas utilizando
diferentes fuentes de carbono (Bedade et al., 2017; Florencio et al., 2012), tal es el caso almidón
para las amilasas (Mihajlovski et al., 2021; Yadav et al., 2018), (Kumar et al., 2018; Yadav et
al., 2018), leche descremada para proteasas (Yadav et al., 2018), Guaiacol para lacasas (Sharma
et al., 2019) carboximetilcelulosa para celulasas (Hossain et al., 2021; Mihajlovski et al., 2021)
y xilano de abedul o de haya para la actividad xilanasa. Es por ello, que el presente trabajo de
investigación tuvo como objetivo aislar y caracterizar, cepas fúngicas autóctonas de la caña de azúcar
con potencial para la producción de enzimas hidrolíticas del tipo celulasas y xilanasas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de cepas fúngicas

Las cepas fúngicas utilizadas en este trabajo fueron aisladas de bagazo de caña de azúcar (BCA)
proveniente de un ingenio azucarero local y de hojas de caña de azúcar (HCA) variedad Mex 72-2086
colectadas en el colegio de postgraduados, Campus Córdoba. Las muestras se sometieron a una
cámara húmeda a 31°C por 7 días. Transcurrido este tiempo las muestras fueron sembradas mediante
la técnica de siembra directa en cajas Petri con agar cloranfenicol rosa bengala y diclorán Difco TM
(ACRBD) compuesto por: 5 g/L de proteosa peptona, 10 g/L de dextrosa, 1 g/L de fosfato
monopotásico, 0,5 g/L de sulfato de magnesio, 2 mg/L de diclorán, 25 mg/L de rosa de bengala, 0,1
g/L de cloranfenicol, 15 g/L de agar (Afolabi et al., 2020; Martínez-Salgado et al., 2021).

Purificación de las cepas

Las cepas fúngicas se purificaron mediante la técnica de punta de hifa en cajas Petri con ACRBD y
se mantuvieron a 31°C durante 5 días, se realizaron subcultivos siguiendo esta metodología hasta
observar cultivos puros en el microscopio (Lacerda et al., 2018).

Caracterización morfológica de las cepas

Las cepas puras fueron caracterizadas de acuerdo con sus características microscópicas como la
morfología de hifas, conidios y conidióforos y macroscópicas como la apariencia y el color de las
colonias (Savín-Molina et al., 2021).

Prueba para la producción de enzimas celulasas y xilanasas en placas de agar

Para evaluar cualitativamente el potencial de los aislados para la producción de enzimas hidrolíticas
del tipo celulasas, se inocularon discos miceliales (5 mm) en placas de agar (1.5%) suplementado con
0.2% de Carboximetil celulosa (CMC), 0.2% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.05% KCl,
0.2% y 0.2% peptona (Arana-Cuenca et al., 2019; Kasana et al, 2008). Las placas inóculadas se
incubaron a 31°C durante 3 días. Transcurridas las 72 h se reveló el halo de hidrólisis con solución
rojo congo (1 % durante 15 min) y lavados con NaCl (1 M, 12 min). Para comparar el potencial de
los aislados (H y B) para la producción de celulasas, se determinó el índice de potencia (IP), midiendo
el diámetro de la colonia y del halo de hidrólisis , y realizando el cálculo con la siguiente ecuación
(Herrera, 2003; Soria-Noroña y López-Almeida, 2020):
 𝐷𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝐻𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝐻𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠
𝐼𝑃 =
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎

Para evaluar el potencial de los aislados (H y B) para la producción de enzimas xilanasas, se realizó
la metodología previamente descrita, sustituyendo el CMC por 0.2% de Xilano de abedul (XA).
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento y caracterización de las cepas fúngicas

Como se puede observar en la Figura 1 (a y b) de los muestreos realizados se lograron aislar dos cepas
fúngicas, una proveniente de HCA (cepa H) y otra proveniente de BCA (cepa B). Las características
macroscópicas de la cepa H fueron desarrollo micelial algodonoso de color amarillo después de 3
días, una coloración del medio de cultivo amarilla-café y la presencia de conidios amarillos-verdes
después de 5 días. Esto concuerda con algunas características reportadas por Asis et al., (2021) para
especies del género Trichoderma, como la presencia de micelio blanco, una pigmentación del medio
amarilla-marrón y la presencia de conidios amarillos después de 5 días de cultivo.

Por otra parte, la cepa B presentó desarrollo micelial de color blanco-amarillo después de 3 días,
presencia de un ligero color amarillo sobre el medio de cultivo y la presencia de conidios verdes
después de 5 días. Así mismo, estas características son similares a las reportadas por (Asis et al.,
2021; Unartngam et al., 2020) algunas especies del género Trichoderma, como el desarrollo de
micelio amarillo transparente, presencia de conidios verdes en el cultivo maduro y la pigmentación
del medio en color amarillo.

Figura 1. Colonias de las cepas fúngicas aisladas sobre medio agar cloranfenicol rosa bengala y diclorán después de 5
días de desarrollo. a) cepa aislada de hojas de caña de azúcar (H) y B: cepa aislada de bagazo de caña de azúcar (B).

Así mismo ambas cepas aisladas (H y B) se caracterizaron microscópicamente mediante una tinción
con azul de algodón, tal y como se puede observar en la Figura 2 (a y b). La estructura microscópica
de los aislados mostró conidios globosos nacidos en racimos, fiálides en forma de botella alargada, y
conidióforos ramificados. Estas características similares a las reportadas por diversos autores para
Trichoderma (Asis et al., 2021; Barnett y Hunter, 1972; Naher et al., 2021), presentando fiálides en
forma de botella, conidióforos ramíficados, y conidios ovoides nacidos en pequeños racimos
terminales para especies como T. Reesei, T. Harzianum y T. Viride. Además autores como da Silva
et al. (2019) y Rukmana et al. (2020) han reportado la presencia del género Trichoderma en paja y
bagazo de caña de azúcar.

Figura 2. Hifas, conidios y conidióforos observados mediante tinción con azul de algodón de las cepas fúngicas aisladas,
a) cepa aislada de hojas de caña de azúcar, b) cepa aislada de bagazo de caña de azúcar.

Ensayo para la producción de enzimas celulasas y xilanasas.

La determinación del potencial para expresar las celulasas y xilanasas se llevó a cabo midiendo el
crecimiento radial de las colonias fúngicas y del halo de hidrólisis en placas de agar suplementado
con CMC y XA (Figura 3), respectivamente.

Figura 3. Actividad enzimática en caja Petri. Cepa H: a) actividad celulasa, b) actividad xilanasa; cepa B c) actividad
celulasa, d) actividad xilanasa.

La presencia de halo de hidrolisis en la placas suplementadas CMC y XA como fuente de carbono

inoculadas con ambas cepas (H y B) es indicaticatico de su capacidad para expresar las actividad
celulasa y xilanasa, sin embargo para poder tener un parámetro más adecuado para determinar IP se
determinó el índice de potencia de los aislados fúngicos, los resultados se pueden observar en la tabla
1.

Tabla 1. Determinación del índice de potencia para cepas Fúngicas aisladas de bagazo de caña (B) y Hojas de caña (H) en
cajas Petri con Carboximetil Celulosa (CMC) y Xilano de Abedul (XA).

Fuente de Diámetro Colonia* Diámetro del Halo

Cepa 𝑰𝑷* ± Error
Carbono (cm) de hidrólisis* (cm)
B 3.13 3 0.95 ± 0.010
CMC
H 2.33 2.31 0.99 ± 0.025
B 3.93 3.63 0.92 ± 0.024
XA
H 3.13 3.26 1.04 ± 0.011
*Nota: datos promedio de 3 repeticiones

Los resultados que se observan en la tabla 1, indican que la cepa H mostró mejores IP lo cual puede
ser indicativo de que puede ser una mejor opción para producir las enzimas hidrolíticas por cultivo
en medio sólido que la cepa B. El IP calculado para la cepa H es un indicativo de un mayor potencial
de esta cepa para la producción de enzimas hidrolíticas extracelulares, el mayor IP puede ser
indicativo de una mayor producción de enzimas (halo de hidrólisis) en relación a su crecimiento-
desarrollo (micelio). Además, autores como Florencio et al., (2012) demostraron que existe una
relación directa entre los índices enzimáticos o IP (pruebas cualitativas en placas de agar) y la
producción de enzimas hidrolíticas en sistemas de fermentación en estado sólido (pruebas
cuantitativas).

Asimismo, la producción de enzimas hidrolíticas (celulasas y xilanasas) en presencia de CMC y XA

por la cepa H y B, se evidenció por la presencia de zonas claras alrededor de las colonias después del
revelado con rojo congo, este colorante tiene fuertes interacciones con los polisacáridos unidos por
enlaces β 1-3, al producirse la hidrólisis de estos compuestos, las interacciones entre el colorante y
los polisacáridos se pierde, y a su vez, la coloración del área en la que las cepas secretaron las enzimas
(Matos et al., 2018). La técnica de detección de actividad enzimática en placa de agar sido empleada
con éxito en la selección de cepas productoras de enzimas celulasas y xilanasas en sistemas de
fermentación en estado sólido (Arana-Cuenca et al., 2019) (Ire et al., 2018) (Gordillo-Fuenzalida et
al., 2019), y fermentación sumergida (Abd Elrsoul y Bakhiet, 2018) (Vázquez-Montoya et al., 2020)
(Saroj et al., 2018).

CONCLUSIONES
Las características macro y microscópicas de las cepas fúngicas aisladas (H y B) indican que pueden
tratarse de hongos filamentosos del género Trichoderma. Además, tanto la cepa B aislada de BCA
como la cepa H aislada de HCA, mostraron capacidad para la producción de enzimas hidrolíticas del
tipo celulasas y xilanasas. Sin embargo, la cepa H mostró un mayor potencial para la producción de
enzimas hidrolíticas.

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