Laboratorio de Análisis Instrumental, 2018-2

Práctica 2: Cuantificación: curvas de calibración – Ley de Beer

PRÁCTICA 2
ESPECTROSCOPÍA UV-Visible: Cuantificación: curvas de calibración-Ley de Beer.

1. INTRODUCCIÓN

La espectroscopia de absorción basada en la radiación ultravioleta y visible es una herramienta sumamente

útil para efectuar análisis cuantitativo. Un método espectrofotométrico está basado en la medida directa de la
absorción de radiación electromagnética por parte de una muestra y la correlación de esta variable con la
concentración de la especie de interés en dicha muestra. Todo analito molecular tiene la capacidad de
absorber ciertas longitudes de onda características de la radiación electromagnética. En este proceso, la
radiación es transferida temporalmente a la molécula y, como consecuencia, disminuye la intensidad de la
radiación. Dicha disminución, debida a la absorción experimentada por el analito, puede ser cuantificada
utilizando diversas magnitudes, siendo la Absorbancia, A, la más comúnmente utilizada en la
espectrofotometría UV-Vis. Dicha absorbancia se define por la expresión:

𝑃𝑜
𝐴 = −𝑙𝑜𝑔10 T = log
𝑃

donde A es la Absorbancia, P0 la potencia del haz de radiación incidente y P la potencia de dicho haz tras
atravesar la muestra.

Ley de Beer
La ley de Beer establece que la absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a
través de un medio y la concentración c de la especie absorbente, en el caso de radiación monocromática.
Esto es:
𝐴 = 𝑎𝑏𝑐

donde a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. Cuando la concentración c se expresa en

moles/litro, y b en centímetros, la constante de proporcionalidad se denomina absortividad molar, y se designa
por el símbolo , y, puesto que la absorbancia es una magnitud adimensional, tendrá unidades de L / cm mol.
En este caso, la ley de Beer adquiere la forma:

𝐴 = 𝜀𝑏𝑐
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Un espectro de absorción es una representación gráfica de la absorbancia de un analito (o de otra magnitud

equivalente) en función de la longitud de onda de la radiación,  (o de otro parámetro relacionado con la
energía de la radiación utilizada). El máximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorción de un
analito, nos dará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto será la que se
utilizará en el análisis espectrofotométrico de dicho analito.

El análisis cuantitativo de una especie mediante la espectroscopia de absorción molecular requiere de una
etapa previa de calibración. Una vez decididas las condiciones para el análisis, se prepara la curva de
calibración a partir de una serie de disoluciones patrón que abarquen el intervalo de concentración esperado
en las muestras problema. Idealmente los patrones de calibración deben tener una composición similar a la
de las muestras a analizar, no solo en cuanto a la concentración del analito, sino también respecto a la
concentración de otras especies absorbentes presentes en la matriz de la muestra. Se representa la
absorbancia de las muestras de concentración conocida a la longitud de onda de máxima absorbancia, frente
a la concentración de dichas muestras, para así obtener la curva de calibración. Según la ley de Beer, el
resultado obtenido será una línea recta, cuya expresión matemática puede ser obtenida mediante un
tratamiento de ajuste estadístico por mínimos cuadrados.

2. OBJETIVOS
 Seleccionar la longitud de onda más adecuada para efectuar el análisis cuantitativo.
 Elaborar una curva de calibración y entender su aplicabilidad en la determinación de la concentración
de un analito.
 Determinar cuantitativamente la concentración de una muestra problema de naranja de metilo
mediante espectroscopia de absorción molecular UV-Vis.
 Analizar cuantitativamente muestras de concentración desconocida por espectroscopia UV-Vis
empleando la Ley de Beer.

3. PROCEDIMIENTO
 A partir de una solución madre de 50 ppm de Naranja de metilo, prepare soluciones de 5, 10, 15, 20
y 25 ppm. Calcule el volumen en ml que debe tomarse de la solución madre para preparar 50 ml de
cada solución.
 Encender el equipo y abrir el software que controla el equipo.
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Práctica 2: Cuantificación: curvas de calibración – Ley de Beer

 Seleccionar el método de análisis apropiado para construir la curva de calibración a partir de las
soluciones de Naranja de metilo que se prepararon.
 Medir la línea base utilizando como referencia el solvente con el cual se prepararon las soluciones a
analizar.
 Determinar el espectro de absorción de las soluciones a la longitud de onda apropiada para el
análisis cuantitativo. Determinar dicho valor a partir de un barrido en el rango espectral
correspondiente al visible..
 Tome nota del valor de la absorbancia medido a la longitud de onda del análisis para cada una de las
soluciones patrón.
 Finalmente, mida el valor de la absorbancia para la muestra de concentración desconocida y tome
nota del valor obtenido.

4. TRATAMIENTO DE LOS DATOS

 Elabore una gráfica de absorbancia versus concentración y determine si se presentan desviaciones
positivas o negativas de la Ley de Beer. Compruebe en que intervalo de concentraciones se cumple
la Ley de Beer.
 Mediante regresión lineal determine la ecuación correspondiente a la gráfica elaborada. Asegúrese
de que se obtenga un buen ajuste (coeficiente de regresión).
 Determine la concentración de la muestra problema.
 Calcule la absortividad y la absortividad molar del Naranja de metilo a la longitud de onda del
análisis. Si es posible, compare con datos reportados en la literatura.

5. PREGUNTAS
 ¿En qué intervalo de las concentraciones de naranja de metilo trabajadas se cumple la Ley de Beer?
 ¿Qué tipo de soluciones no cumplen la Ley de Lambert-Beer?
 ¿Cuáles son las principales desviaciones de la Ley de Beer? Descríbalas.
 Consulte algunas aplicaciones industriales de la espectrofotometría de absorción UV-Vis.