UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA)
FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS DINÁMICAS

PRACTICA N° 1

ESPECTROFOTOMETRIA

I.OBJETIVOS:
1.Determinar la concentración de la muestra problema utilizando el método
espectrofotométrico.
2.Interpretar y comparar los resultados haciendo uso de los métodos gráfico y analítico.

II: INTRODUCCIÓN:
El método espectrofotométrico es un método analítico cuantitativo que mide la
concentración de una muestra, en base a su capacidad de absorber luz de una zona
determinada del espectro electromagnético.

La mayoría de los compuestos en solución tienen una capacidad de absorción selectiva

sobre determinadas radiaciones luminosas, cuando esta absorción se realiza en la zona
espectral visible, las soluciones las ve el observador de un color que es producido por las
radiaciones que no han sido absorbidas

Partiendo del hecho que la luz puede ser emitida, reflejada, transmitida o absorbida y
gracias a la ley de la conservación de la energía (no destrucción de la energía), la cantidad
total de “luz” debe ser igual al 100%; por tanto, cuando un objeto es iluminado, se puede
medir cuánta radiación ha sido reflejada o transmitida y, con ello, podemos decir cuánta
fue absorbida, cuál es la cantidad que ha interactuado con el objeto.

Un espectrofotómetro es un instrumento que permite determinar a qué longitud de onda la

muestra problema (analito) absorbe la luz y la intensidad de la absorción. Podemos
distinguir cuatro partes:

SISTEMA DE SISTEMA SISTEMA DE SISTEMA DE

RADIACIÓN MONOCROMADOR DETECCIÓN REGISTRO
Luz policromática Prisma Celda Galvanómetro
V:W Red de difracción fotomultiplicadora A:0-----------100
Uv:Ar,Hg T:100-----------0
Ir: Ni-Cr A= 2-log%T

FUNDAMENTO DEL MÉTODO:

Cuando un haz de luz (LUZ Incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación
queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su
intensidad (LUZ Transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorción de dichas
El método espectrofotométrico trabaja en base a dos Leyes :Ley de Lambert y Ley de Beer.
Jean-Henri Lambert investigó la absorción de las radiaciones por los sólidos (vidrio) y
estableció una ley que dice: “Cuando una luz monocromática atraviesa un medio de
concentración de color determinado, la intensidad de la luz transmitida es inversamente
proporcional a su longitud”. Bouguer Beer estudió las soluciones de manera similar y
dedujo la ley que dice: ”Cuando una luz monocromática (luz incidente) atraviesa un medio
coloreado, la intensidad de la luz transmitida es inversamente proporcional a la intensidad
de color del medio, es decir a la concentración en color del medio”; resumiendo:
Ley de Lambert : la cantidad de luz absorbida por una sustancia en solución depende de la
distancia recorrida por la luz.
Ley de Beer: La cantidad de luz absorbida por una sustancia en solución depende de su
concentración
Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad
de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el número de moléculas
que se interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este número varía de acuerdo
con la concentración del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solución, estos
factores están considerados en la "Ley de Lambert y Beer", que rige los principios de la
colorimetría y cuyas formas de expresión son:

A = Log (Io / It) = ε l c

A = D.O. = 2 – Log % T

Io = Intensidad de luz incidente

It = Intensidad de luz transmitida
ε = Coeficiente de extinción molar o absortividad molar
l = longitud (ancho) de la cubeta de lectura (cm).
C = Concentración Molar (mol/L)
A = Absorbancia
D.O. = Densidad óptica
% T = porcentaje de transmitancia

Si se quiere dar con una relación directamente proporcional entre la absorbancia (A) y la
concentración molar (c), la absortividad molar (ε) y el ancho de la cubeta-celda (l) deben
ser constantes; se cumple cuando ε debe poseer un valor estándar, en una longitud de onda
óptima, un solvente adecuado y l de una celda blanco patrón.

Este método tiene múltiples aplicaciones, en Bioquímica se utiliza para medir velocidades
de reacción catalizadas por enzimas, análisis de muestras bioquímicas ,determinar
conformaciones estructurales e interacciones moleculares, determinar grupos funcionales
en moléculas orgánicas, determinar metales en compuestos de coordinación, análisis de
semiconductores, análisis cuantitativo de procesos químicos y bioquímicos.
.
CÁLCULO DE CONCENTRACIÓN DE UNA MUESTRA PROBLEMA

Tenemos dos formas:

a)   Método del empleo de la curva calibración o curva estándar (Método Gráfico)
Aplicable cuando los valores del coeficiente de absortividad molar (e) son desconocidos, y
en casos donde se requiera una reacción previa para el logro de la capacidad absortiva del
analito (especie absorbente). Para este método resulta necesario preparar una serie de
soluciones de concentración conocida, cuantificarla, hacer la reacción previa (generación
del compuesto absorbente) y medir la absorbancia por medio del espectrofotómetro UV-
vis. (1)
Presentándose en una tabla los datos correspondientes a  pares ordenados conocidos (X-
concentraciones, Y-absorbancias); siendo tomada como referencia la recta/curva de
calibración obtenida. La determinación de una concentración del analito se hará
interpolando el valor de A (medido en la gráfica) o bien despejando el valor de X que le
corresponde a la medida Y (A), en dicha ecuación de la recta de calibración. (1)

b) Método del factor de calibración (Método Analítico)

El factor de calibración relaciona el factor de concentración estándar de la muestra con la

absorbancia estándar de la muestra problema o la cantidad de intensidad de luz que llega a
absorber la muestra. Así mismo este método hace uso del factor de dilución en el caso que
sea necesario para obtener un mejor resultado en la muestra

III. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Método Gráfico : Método del empleo de la curva calibración o curva estándar
a) Preparar la siguiente batería de tubos.
Solución stock: Permanganato de potasio (KMnO4) 10mg/dL

Tubos N° 1 2 3 4
mL de KMnO4 10 mg% 0.5 1 1.5 2

mL agua destilada 4.5 4 3.5 3

concentración
A420
A520
A620
Lambda óptimo
A de la muestra problema

b) Hallar la concentración estándar en mg% de la solución de KMnO4 para cada tubo

mediante la siguiente formula: V1C1=V2 C2
 c) Leer las absorbancias de los 4 tubos a las siguientes longitudes de onda (λ) 420 nm,
520 nm y 620 nm en el espectrofotómetro.

d) Con las gráficas elegir la longitud de onda óptima para el KMnO4

e) Medir la absorbancia de la  muestra problema (de acuerdo a su mesa correspondiente)

f) Expresar y analizar los resultados .

 
3.2.Método Analítico ó método del factor de calibración

a) Utilizando los resultados de concentración, y absorbancia a Lambda óptimo hallar

el factor de calibración en cada tubo FC = conc/A
Tubos N° 1 2 3 4
mL de KMnO4 10 mg% 0.5 1 1.5 2

mL agua destilada 4.5 4 3.5 3

concentración
Absorbancia a lambda
óptimo
Factor de calibración
Promedio
Concentración de la
muestra

b) Analíticamente, multiplicando la absorbancia por el Fc promedio y el factor de 

           dilución. Medir la absorbancia de la muestra problema. 

[ St ]
 Fórmula para el cálculo [ MP ]= × Amp × Fd
Ast

 
Sin dilución :el Factor de dilución (Fd) = 1 
 Dilución = d = v / V           v = volumen tomado  V = Volumen total
 Factor de Dilución Fd = d-1  
Dilución equivalente: Si se realiza varias diluciones sucesivas
Ejemplo : Con tres diluciones sucesivas: 1/2, 1/5, 1/10  , la dilución equivalente es
1 1 1 1
Dilución equivalente = × × =
2 5 10 100

    c) Comparar y analizar ambos resultados.

IV.CUESTIONARIO

1.Ha que se denomina linealidad

2.Porqué es necesario hacer diluciones en algunas muestras
3.Hallar la concentración de la muestra (con sus datos experimentales ) que diluida
sucesivamente al 1/10 y al 1/5 obtuvo una absorbancia de la mitad.

4. Hallar los %T si las absorbancias son: A1 = 0.004, A2 = 0.04,A3 =0.4

 A=2−log T %

5. Hallar la Absorbancia cuando el % T es 10 %, 50 %, 100 %

A=-log T=-log(I/Io)

6. La absorbencia molar de un soluto es 2.1 x 104, calcular la transmitancia a través de una

cubeta con un trayecto de luz de 1 cm para una solución de 2x10-5 M.

7.Se disolvieron en agua 10 g de un fármaco cuyo PM es 200 y se diluyeron a 1 litro,la λ es

255nm, la cubeta 1cm y la absorbancia 0.556, calcular la pureza de la muestra
El estándar de la muestra presenta una absortividad de 13230