ESPECTROFOTOMETRÍA

Grupo 2 – Bloque 3 Laboratorio de Bioquímica; Facultad de Ciencias Básicas,

Universidad Santiago de Cali
Docente: Omaira Vera Liscano.
02 octubre de 2021

RESUMEN
En la práctica realizada se llevó a cabo el espectro de absorción de luz visible de una
sustancia colorida rojo congo. Para ello se realizó un barrido espectral de 400-700 nm
para encontrar la máxima absorbancia y así poder seleccionar la longitud de onda a la
cual se trabajó, encontrando que para el rojo congo es de 490 nm. Para evaluar la ley
de Beer-Lambert se elaboró una curva de calibración en la que se relaciona de manera
lineal la concentración y la absorbancia. La concentración obtenida fue de 3.4 mg/mL
con un porcentaje de error de 66.0%.

Palabras claves: Espectrofotómetro, Absorbancia, longitud de onda, UV-visible, ley de

Beer-Lambert, curva de calibración.

1. INTRODUCCIÓN
El espectrofotómetro es el instrumento más económico, versátil y utilizado en el
laboratorio para diversas identificaciones y cuantificaciones analíticas.

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica fundamental que permite

conocer la concentración de una sustancia en solución. Esta técnica se basa en que las
moléculas absorben radiación electromagnética y esta cantidad de radiación absorbida
se relaciona de manera lineal con la concentración.1 Esta relación se conoce como la
ley de Beer-Lambert o simplemente, ley de Beer que indica cuantitativamente como la
cantidad de atenuación depende de la concentración de las moléculas absorbentes y de
la longitud de la trayectoria donde ocurre la absorción. De acuerdo a esta ley la
absorbancia es directamente proporcional a la concentración de las especies
absorbentes.2
Una gran variedad de biomoléculas absorbe luz a longitudes de onda características,
esta propiedad de las biomoléculas es utilizada para la medición de absorción de la luz
mediante un espectrofotómetro para detectar e identificar moléculas y para medir
concentración en disolución.
Para el análisis cuantitativo se debe construir una curva de calibración con patrones de
concentración conocida, procurando siempre que la matriz sea igual o muy similar a la
de la muestra. Para la cuantificación de la absorbancia de la muestra se debe interpolar
en esta recta de calibración con el fin de obtener la concentración de la muestra.
El rojo congo, derivado del azobenceno, es un diazo colorante que tiene en su estructura
dos enlaces N=N y cuatro grupos auxocromos, ver figura 1. Gracias a su estructura tiene
una alta solubilidad en agua y etanol, lo que permite su uso como indicador de pH. El
rango de pH de este colorante es de 3-5, en condiciones de pH menor a 3 el rojo congo
 tiene un color azul, a pH mayor a 5 es de color rojo. En estado sólido se presenta como
un polvo rojo parduzco. Otra de las aplicaciones de este colorante es en biología, donde
es usado para teñir el citoplasma y los eritrocitos. Se usa también para la detección de
amiloide en pacientes con amiloidosis.

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tras la elección de la sustancia problema rojo congo, se procede a realizar un barrido a
diferentes longitudes de onda, desde 400 hasta 700 nm con el espectrofotómetro,
encontrando para esta sustancia absorbe a 490 nm, ya que en esta longitud de onda se
evidencia la absorbancia máxima 0.245 nm. La información de absorbancia vs longitud de
onda se tabuló y se graficó como se puede observar en la Tabla 1 y Gráfica 1.

Tabla 1. Barrido espectrofotométrico. Absorbancia vs

longitud de onda
LONGITUD DE ONDA (nm) ABSORBANCIA
400 0,196
430 0,127
460 0,182
490 0,245
520 0,224
550 0,120
580 0,038
610 0,010
640 0,007
670 0,007
700 0,008
 Grafica 1. Absorbancia vs Longitud de onda

A 490 nm, que es la longitud de onda donde se encontró la máxima absorbancia, se hizo
la lectura de un blanco (agua destilada) y una curva de calibración comprendida por ocho
puntos: 0.00ppm 0.25 ppm, 0.50 ppm, 1.00 ppm, 1.50 ppm, 2.00 ppm, 3.00 ppm y 4.00
ppm. Las absorbancias obtenidas en la lectura de cada uno de estos puntos, se tabuló y
se graficó como se indica en la Tabla 2 y Gráfica 2

Tabla 2. Concentración vs Absorbancia

TUBO No 1 2 3 4 5 6 7 8
SOLUCIÓN DE
0,25 0,50 1,00 1,50 2,00 3,00 4,00 0,00
SUSTANCIA (mL)
AGUA DESTILADA (mL) 9,75 9,50 9,00 8,50 8,00 7,00 6,00 10,00
ABSORBANCIA (A) 0,043 0,101 0,149 0,211 0,357 0,651 1,150 0,000
CONCENTRACIÓN
2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 30,0 40,0 0,0
(mg/mL)
 Grafica 2. Curva de Calibración.
Concentración vs Absorbancia
Los datos obtenidos de grafica 2 muestra que no hay una linealidad lo que no dice que
no hay una relación entre la absorbancia y la concentración, esto debe a que como se
está trabajando con concentraciones muy bajas (ppm) cualquier error que se cometa en
las preparaciones va a ser mucho más grande que si trabajamos con concentraciones
más grandes debido a que la desviación estándar es más grande. Lo anterior se ve
reflejado en el valor de R=0.9385 de ecuación de la recta lo nos indica que la curva de
calibración no es lineal, ya que para serlo se debería obtener valores de R de
aproximadamente 0.99. Los factores que probablemente influenciaron en los resultados
fueron a que las soluciones madres no se disolvieron completamente lo que conlleva a
que la concentración no es la adecuada como también la toma de las alícuotas para
cada nivel de concentración y su respectivo aforo al volumen final ocasionan errores en
las respuestas obtenidas ya que si se observa la curva hay puntos donde se evidencia
que la concentración está por debajo de lo que se espera obtener. Lo ideal cuando se
trabaja con soluciones que presentan algún tipo de coloración es que se preparen y se
realicen las lecturas de manera inmediata para evitar posibles factores de degradación y
falsos resultados, lo que probablemente nos sucedió en la práctica ya que no se realizó
las lecturas de manera rápida; otro posible factor de error es que entre lecturas que se
hicieron a la celda se le realizaron lavados con agua purificada y probablemente
estábamos diluyendo un poco cada solución de la curva.
Después de realizar la lectura del blanco y la curva de calibración, se realizó la lectura de
la muestra problema. La muestra se compone de 1.0 mL de rojo congo (100 mg/L) y 9.0
mL de agua destilada. La absorbancia obtenida en la lectura de la muestra problema es
de 0.031.
La Gráfica 2 aporta la ecuación de la curva que relaciona de manera lineal la concentración
con la absorbancia y = 0.0269 x - 0.0796 dónde y es la absorbancia de la muestra y x es
la concentración desconocida. Reemplazando y por 0.031 y despejando x, se obtiene:
0.031=0.0269 x - 0.0796
 x = (0.031 + 0.0796) / 0.0296
x = 3.4 mg/mL
En este caso, la concentración esperada es de 10.0 mg/mL debido a que la preparación
de la muestra coincide con la preparación del tubo No 3 de la Tabla 2
por tanto, el porcentaje de error es el siguiente:
%Error = ((3.4 - 10.0) / 10.0) x 100
%Error = 66.0 %
Al obtener un % de error tan alto se confirma el error en las preparaciones de las diferentes
soluciones. hablar de una posible falla en las lecturas del equipo no es factible ya que
muestra que al aumentar las diferentes concentraciones sus absorbancias aumenta
proporcionalmente y los valores obtenidos son reproducibles si se leen una misma
muestra, ahora bien un error muy común en los espectrofotómetros es que se presente
algún tipo de suciedad que interfiera en el camino óptico lo cual no se observó en el
momento de realizar las lecturas, otro posible error que presenta el equipo es que la
intensidad de energía de la lámpara no se la adecuada lo que conlleva a que se muestran
falso resultados debido a la baja intensidad lo que no se puede confirmar ya que para
realizar este proceso se requiere de un personal autorizado.

CONCLUSIONES
Los espectros de absorción por medio de un barrido de diferentes longitudes de onda
permiten determinar los picos máximos, facilitando así un análisis cuantitativo aplicando
la ley de Beer-Lambert.
Por medio de la espectrofotometría es posible determinar, con una gran precisión, la
concentración problema de una muestra.
Aplicando la curva de calibración del rojo congo se determinó la concentración de una
muestra problema y en uso de la ecuación de la recta, obteniendo un resultado de
3.4mg/mL, comparada con la concentración teórica de 10mg/mL se obtuvo un %error de
66,0%.
El porcentaje de error tan alto se debe a errores sistemáticos que afectan el buen
desarrollo de la práctica, mencionaremos algunos que pudieron presentarse y pasaron
inadvertidos:
La balanza y el espectrofotómetro no están calificados y verificados.
Error en el pipeteo de las alícuotas.
Dado el porcentaje de error tan alto obtenido en la práctica se evidencia que los analistas
requieren más práctica en el manejo y desarrollo de los equipos de laboratorio.

BIBLIOGRAFIA
1. Martinez C, Lizcano Y, Vera O. Guia de laboratorio de Bioquímica, Universidad Santiago
de Cali, Practica No.1. Espectrometría.
2.J.MILLER, Estadistica y Quimiometria para Quimica Analitica, 4 ed, Pearson 2008.
pp.21,24.
3.Harris, D.C. Análisis Químico Cuantitativo. 3ed. Capitulo 18. Reverte,2007.