Descubrimiento guiado por la evolución de antibióticos que inhiben la

remodelación de peptidoglicanos
Abstracto
Abordar la actual crisis de los antibióticos requiere el descubrimiento de compuestos con
nuevos mecanismos de acción que sean capaces de tratar infecciones resistentes a los
medicamentos 1 . Muchos antibióticos se obtienen de metabolitos especializados
producidos por bacterias, en particular los de la familia Actinomycetes 2 . Aunque los
extractos de actinomicetos se han cribado tradicionalmente utilizando plataformas
basadas en actividades, este enfoque se ha vuelto desfavorable debido al frecuente
redescubrimiento de compuestos conocidos. La secuenciación del genoma de los
actinomicetos revela un reservorio sin explotar de grupos de genes biosintéticos, pero se
requiere una priorización para predecir qué grupos de genes pueden producir nueva
materia química prometedora 2. Aquí hacemos uso de la filogenia de genes biosintéticos
junto con la falta de determinantes de resistencia conocidos para predecir miembros
divergentes de la familia de antibióticos glicopéptidos que probablemente posean nuevas
actividades biológicas. Usando estas predicciones, descubrimos dos miembros de una
nueva clase funcional de antibióticos glicopéptidos, el conocido antibiótico glicopéptido
complestatina y un compuesto recientemente descubierto que llamamos corbomicina, que
tienen un nuevo modo de acción. Demostramos que al unirse al peptidoglicano, la
complestatina y la corbomicina bloquean la acción de las autolisinas, las hidrolasas de
peptidoglicano esenciales que se requieren para la remodelación de la pared celular
durante el crecimiento. La corbomicina y la complestatina tienen niveles bajos de
desarrollo de resistencia y son eficaces para reducir la carga bacteriana en un modelo de
ratón de infección cutánea por MRSA.

Introducción:
A lo largo de la evolución, los grupos de genes biosintéticos (BGC) son esculpidos al
menos en parte por la presión selectiva sobre la actividad biológica del metabolito
resultante. Por lo tanto, las BGC que tienen genes biosintéticos divergentes
evolutivamente también podrían producir una nueva actividad biológica. Dicho
descubrimiento guiado por filogenia se ha aplicado previamente para identificar miembros
divergentes de familias de productos naturales mediante la generación de árboles
filogenéticos a partir de etiquetas de secuencia corta de genes biosintéticos seleccionados
3 , 4 , 5 . Alternativamente, hemos demostrado previamente que al combinar la selección
de resistencia a antibióticos con el análisis filogenético de segmentos de genes
biosintéticos concatenados, es posible identificar nuevos miembros de una clase de
antibióticos que conservan el mismo mecanismo de acción.6 . Estos enfoques son útiles
para priorizar las BGC que producen compuestos no descubiertos con actividad biológica,
pero no proporcionan ninguna información sobre el mecanismo de acción. Los antibióticos
BGC codifican no solo la maquinaria biosintética, sino también genes de resistencia para
protegerlos de la auto-intoxicación. La búsqueda de la presencia de genes de resistencia
en BGC ha dirigido previamente la extracción del genoma de antibióticos con mecanismos
conocidos o predichos 7 , 8 . En cambio, interesados en nuevos modos de acción,
sugerimos que al identificar BGC filogenéticamente distintas que carecen de genes de
auto-resistencia conocidos, podríamos encontrar antibióticos con diferentes y
posiblemente nuevos mecanismos de acción.

Descubrimiento de guías de resistencia y filogenia

Aplicamos nuestra hipótesis a la familia de antibióticos glicopéptidos, que fue elegida por su
diversidad de BGC, alto grado de adaptación y genes de auto-resistencia distintivos que actúan a
través de la modificación de la diana (por ejemplo, vanHAX ). A partir de secuencias genómicas
internas y repositorios públicos, recolectamos 71 BGC de antibióticos glicopéptidos (GPA) y
antibióticos de la familia de glicopéptidos, y construimos árboles filogenéticos de cada gen
compartido y segmento de genes encontrados en estos BGC 9. Al integrar nuestro conocimiento
sobre la filogenia de especies con el linaje de genes o dominios individuales, identificamos árboles
que proporcionaban información sobre la conservación o divergencia de componentes debido a la
función (por ejemplo, péptido sintasa no ribosómico) en lugar de la relación entre cepas en un nivel
de especies (por ejemplo, suministro de precursores) 9 . La relación que observamos en un árbol de
dominios de condensación de péptido sintasa no ribosomales particulares ejemplifica la divergencia
debida al cambio de función, y estuvo presente en varias filogenias que analizamos (Fig. 1a , Datos
extendidos Fig. 1a, b). Al mapear la presencia de genes de auto-resistencia en estos árboles,
encontramos que las BGC que contienen determinantes de resistencia comunes para los GPA
'verdaderos' (por ejemplo, vanHAX y vanY para los antibióticos que se unen a D -Ala- D -Ala del
lípido II) cayeron dentro de un un solo clado (Fig. 1a ). Sin embargo, en BGC con historias
evolutivas divergentes y un ancestro común distinto de los GPA "verdaderos", notamos dos clados
que carecían de cualquier determinante conocido de resistencia a GPA, lo que indica que también
pueden poseer una actividad biológica divergente.

FIGURA 1:
a , Un árbol filogenético de máxima probabilidad de dominios de condensación en el módulo C-2
de acuerdo con el esquema de etiquetado mostrado en la Fig. 1a de datos extendidos ; el árbol
completo se muestra en Datos extendidos Fig. 1b . La presencia de verdaderos genes de auto-
resistencia a GPA, incluidos vanHAX y vanY, dentro de cada BGC correspondiente está marcada
con círculos de colores. El árbol se muestra como un cladograma rectangular con una raíz en el
punto medio. Las etiquetas indican clados bien soportados (valores de soporte similares a
Shimodaira-Hasegawa (SH)> 0,89) de dominios de condensación para los verdaderos GPA, BGC
de tipo complestatina y BGC de tipo corbomicina. Las ramas no marcadas por una de estas
etiquetas de la familia BGC no están caracterizadas. Los árboles escalados y etiquetados por nodos
terminales están disponibles enhttps://github.com/waglecn/GPA_evolution . b , Las estructuras
químicas de complestatina y corbomicina.
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Uno de estos clados divergentes contenía un compuesto conocido, complestatina (Fig. 1b ), así
como otros miembros que se predijo que serían variantes estructurales. Purificamos complestatina
de Streptomyces sp. WAC01325 que contiene este BGC 10 (Datos extendidos Fig. 1c ). El segundo
clado divergente contenía BGC sin miembros caracterizados, por lo que usamos nuestros árboles
filogenéticos para hacer predicciones estructurales y guiar la purificación del metabolito resultante
de Streptomyces sp. WAC01529 (Fig. 1b , Fig. 1d de datos extendidos , e , Figs. Suplementarias 1 -
6). Lo llamamos corbomicina (en honor a Nid de Corbeau, o Crow's Nest Pass, en Alberta, Canadá,
donde se recolectó Streptomyces sp. WAC01529), y crb denota el BGC correspondiente (Datos
extendidos Fig. 1d ).
La corbomicina y la complestatina pertenecen a la familia tipo V de GPA 11 , cuyos otros
miembros conocidos incluyen cloropeptina I, neuroprotectina A / B y kistamicinas 12 , 13 . Se ha
observado la actividad antibiótica de estos compuestos, pero no se ha investigado en profundidad 14
, 15 . Por lo tanto, la falta de determinantes resistentes conocidos en estas BGC justificaba una
mayor investigación de su mecanismo de acción.

Identificación de un modo de acción novedoso

La corbomicina y la complestatina muestran principalmente actividad contra bacterias
grampositivas, con concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) que oscilan entre 0,5 y 4 μg ml -
1,
 una potencia comparable a la de la vancomicina (Tabla de datos ampliados 1 ). Son activos contra
una variedad de cepas de laboratorio y patógenos clínicamente relevantes, incluyendo resistente a la
meticilina y daptomicina resistente aureus Staphylococcus (MIC = 0,5-2 mg ml -1 ). En particular,
también son activos contra Enterococcus resistente a vancomicina y S. aureus intermedio de
vancomicina ., lo que indica que tienen un modo de acción diferente al de los GPA típicos. De
hecho, los experimentos de calorimetría de titulación isotérmica no demostraron la unión al
pentapéptido del tallo de peptidoglicano en condiciones en las que la unión de vancomicina se
puede determinar fácilmente ( K  d  = 14,3 µM).
La actividad de la complestatina contra Enterococcus resistente a la vancomicina se ha observado
anteriormente 16 , pero estudios in vitro y en S. aureus sugirieron que el mecanismo implicaba la
inhibición de la síntesis de ácidos grasos dirigiéndose a la enoil-ACP reductasa FabI 15 . Nos
preguntamos si este era el objetivo fisiológicamente relevante dado que el tamaño (masa molecular
= 1.328 Da) y las propiedades fisicoquímicas de la complestatina hacen que sea poco probable que
penetre en la membrana celular y, por tanto, alcance el FabI intracelular. Sobreexpresión Target,
knockout y grasos exógeno experimentos suplementos de ácido (Extended Data Fig. 2 ) no apoya la
síntesis de ácidos grasos como el objetivo principal de complestatin o de corbomycin enS.
aureus o Bacillus subtilis .
Dada la actividad de los antibióticos glicopéptidos contra la pared celular, a continuación probamos
si la corbomicina y la complestatina afectan el metabolismo de los peptidoglicanos. El promotor
de ywaC en B. subtilis es activado casi exclusivamente por antibióticos que actúan sobre la
envoltura celular 17 , y fue fuertemente activado por corbomicina y complestatina
(Fig. 2a ). P ywaC también es activado por compuestos que se dirigen a la membrana celular 17 , pero
no se observó permeabilización de la membrana usando el colorante fluorescente sensible al voltaje
DiSC 3 (Fig. 2b ). Luego probamos los efectos de estos compuestos en la biosíntesis del ácido
teicoico usando unB. subtilis mutante deficiente en TagO: esta enzima está involucrada en las
primeras etapas de la biosíntesis del ácido teicoico y su eliminación anula la letalidad que se
observa al inhibir esta vía biosintética 18 . La corbomicina y la complestatina fueron igualmente
activas contra Δ tagO y B. subtilis de tipo salvaje (MIC = 1 μg ml -1 , Tabla de datos ampliados 1 ),
lo que descarta un efecto sobre la síntesis de ácido teicoico. Por lo tanto, nos centramos en el
metabolismo de los peptidoglicanos como el objetivo potencial de la corbomicina y la
complestatina.
FIGURA 2: a , complestatina y corbomicina activan fuertemente P ywaC , que controla la
expresión de genes lux en B. subtilis . RLU, unidades de luminiscencia relativa. b , La
rotura de la membrana se midió usando la liberación del colorante fluorescente sensible al
voltaje DiSC 3 de las membranas de B. subtilis , cuantificado como unidades de
fluorescencia relativa máxima (RFU). La gramicidina y la valinomicina son antibióticos de
membrana activa y se utilizan como controles positivos para este ensayo. c , Los
cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) muestran acumulación
de UDP-MurNAc-PP en S. aureusdespués del tratamiento con antibiótico 10 × MIC, como
se observa en el pico a los 23 min en las muestras de vancomicina y moenomicina. d , La
incorporación de HADA se utilizó para medir la síntesis de peptidoglicano y la actividad
transpeptidasa en B. subtilis tratada con antibióticos . Para las muestras que se muestran
de izquierda a derecha, el número de celdas individuales cuantificadas fue n  = 202, 81,
169, 138, 187. Los bigotes muestran los valores mínimo y máximo del conjunto de datos,
el cuadro muestra los cuartiles superior e inferior y la línea muestra el valor mediano. e ,
Lisis de B. subtilistratados con varios antibióticos por encima de sus CMI muestra que la
corbomicina y la complestatina son bacteriostáticas, en contraste con los inhibidores de la
biosíntesis de peptidoglicano ampicilina y fosfomicina. f , La microscopía de B.
subtilis cultivada en corbomicina o complestatina 0,6 x MIC muestra un fenotipo retorcido
característico. Los triángulos rojos en las imágenes TEM marcan sitios de formación de
tabiques de división aberrante, pared celular engrosada y formaciones
granulares. En b y e , se muestra la media de tres réplicas biológicas, con barras de error
muestran la desviación estándar. En b , los puntos de datos individuales se muestran
mediante puntos. Todos los experimentos se repitieron al menos dos veces con
resultados similares.
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Para investigar qué etapa del metabolismo de los peptidoglicanos está bloqueada por la
complestatina y la corbomicina, medimos la acumulación del intermedio citoplasmático final de la
síntesis de peptidoglicanos, el pentapéptido del ácido 5′-difosfato- N- acetilmurámico
de uridina (UDP-MurNAc-PP). El tratamiento de S. aureus con antibióticos que actúan sobre las
etapas ligadas a lípidos de la biosíntesis de peptidoglicanos, como la transglicosilación, da como
resultado la acumulación de UPD-MurNAc-PP (Fig. 2c ). La corbomicina y la complestatina no
tuvieron efecto (Fig. 2c ), lo que indica que el metabolismo del peptidoglicano se ve afectado aguas
abajo de la transglicosilación.
A continuación, probamos si la transpeptidación se inhibía mediante el uso de D -
aminoácidos fluorescentes (FDAA), como el HCC-amino- D- alanina (HADA), que se incorporan
en el peptidoglicano de crecimiento activo por las transpeptidasas 19 . A concentraciones dos veces
mayores que la concentración inhibitoria mínima (2 × CMI), la inhibición de la síntesis de
peptidoglicano por el β-lactámico ampicilina se detectó por una menor incorporación de HADA,
mientras que la corbomicina y la complestatina no causaron cambios significativos durante 1 h
( Fig.2d , Extendido Datos Fig. 3a-c). Además, mientras que todos los antibióticos que bloquean la
síntesis de peptidoglicanos dan como resultado la lisis celular a través de un desequilibrio entre la
síntesis y degradación de peptidoglicanos, la corbomicina y la complestatina son bacteriostáticas
(Fig. 2e , Datos extendidos Fig. 3d, e ). La complestatina y la corbomicina no fueron sinérgicas con
varios antibióticos activos en la pared celular y la membrana, pero fueron aditivos entre sí (Datos
extendidos, Fig. 4a ). Por lo tanto, la corbomicina y la complestatina se dirigen al metabolismo de
los peptidoglicanos a través de un mecanismo similar, que hasta donde sabemos es distinto del de
cualquier antibiótico previamente informado.
Modo de acción por inhibición de autolisina
Dada la actividad sin precedentes de la complestatina y la corbomicina sobre el metabolismo del
peptidoglicano, examinamos el fenotipo de B. subtilis cultivada en niveles de antibiótico por debajo
de la CMI. A 0,6 x MIC, las células formaron septos de forma eficaz, pero no se dividieron, sino
que formaron cadenas de células retorcidas y anudadas (Fig. 2f ). Las imágenes de microscopía
electrónica de transmisión (TEM) mostraron una estructura septal aberrante, la ausencia de flagelos,
una pared celular "peluda" y engrosada y distorsión del citoplasma. Este fenotipo distintivo era
diferente al observado con varios antibióticos de control (Datos extendidos Fig. 4b ), pero coincidía
con el de las cepas de B. subtilis defectuosas en autolisinas 20 , 21. Este grupo diverso de enzimas
que degradan los peptidoglicanos es esencial para el metabolismo normal del peptidoglicano al
permitir la inserción de nuevo material en la pared celular existente y la escisión del peptidoglicano
en los tabiques de división.
Intentamos seleccionar mutantes resistentes espontáneos en agar 4 × MIC y 8 × MIC, pero no
tuvimos éxito tanto para B. subtilis 168 (frecuencia de resistencia <3 × 10 −9 ) como para S.
aureus ATCC 29213 (frecuencia de resistencia <10 −10 ). En cambio, B. subtilis se pasó en serie en
niveles de antibiótico por debajo de la CMI durante 25 días. La resistencia fue lenta y difícil de
desarrollar, alcanzando un aumento máximo de MIC de sólo cuatro veces tanto para corbomicina
como para complestatina (MIC final = 4 μg ml -1 , Fig. 3a ). Observamos niveles bajos similares de
desarrollo de resistencia en S. aureus con pases seriados (Datos extendidos Fig.5a). Los mutantes
resistentes criados por separado en corbomicina (cepas COR14 y COR25) o complestatina (cepas
COM20 y COM25) mostraron resistencia cruzada entre sí, pero no compartieron resistencia cruzada
con otros antibióticos activos en la pared celular o la membrana (Datos extendidos Fig. 5b, c , Tabla
de datos ampliados 1 ); esto es consistente con que su actividad sea distinta de la de esos
antibióticos.
FIGURA 3: a , Se rastrearon y trazaron las CMI de B. subtilis sometidas a pases en serie en
concentraciones subletales de antibiótico durante 25 días. A modo de comparación, se siguió el
rápido desarrollo de un alto nivel de resistencia a la rifampicina. Los pases en serie se completaron
en dos ocasiones independientes con resultados similares. b , Mutaciones identificadas en cepas
aisladas generadas con complestatina el día 20 (COM20) o 25 (COM25), o en mutantes generadas
con corbomicina el día 14 (COR14) o 25 (COR25). Se muestran las mutaciones de aminoácidos,
con FS representando un cambio de marco. La mutación CwlO Q408 * trunca la histidina catalítica
(H431), dando como resultado una enzima inactiva. c , la corbomicina y la complestatina protegen
a B. subtilisde lisis. Las células se trataron con agentes para inducir la lisis además de corbomicina,
complestatina o control con disolvente. d , Especificidades de escisión de enlaces de varias
autolisinas. e , Se controló la digestión in vitro de peptidoglicano de B. subtilis por diversas
hidrolasas después de la preincubación con complestatina o corbomicina. Para c y e , los valores
medios y la desviación estándar de los triplicados biológicos se representan.

La secuenciación del genoma completo identificó mutaciones en las regiones codificantes de

proteínas de los  mutantes resistentes a B. subtilis (Fig. 3b ). Identificamos mutaciones en diversas
proteínas que modifican directamente la pared celular (por ejemplo, la autolisina CwlO 20 ), así
como aquellas que están ligadas a la regulación de las autolisinas (por ejemplo, la fosfodiesterasa
YmdB 22 , el regulador de CwlO FtsX 20 , 23  y homólogo de actina Mbl 20 ) oa la división celular
en general (por ejemplo, la metaloproteasa FtsH 24  y la piruvato quinasa Pyk 25 ) (ver  Discusión
complementaria). Se caracterizaron los efectos de las deleciones de un solo gen (ver  Discusión
complementaria y datos extendidos Fig. 5d ), pero conferían sólo hasta dos veces la susceptibilidad
reducida a corbomicina y complestatina (Datos extendidos Fig. 5e ). Esto está dentro del error
aceptado para las CIM e indica un posible mecanismo poligénico por el cual confieren resistencia y
una diana no proteica o de múltiples subunidades para la corbomicina y la complestatina. Sobre la
base de mutaciones resistentes y evidencia fenotípica, planteamos la hipótesis de que la
corbomicina y la complestatina bloquean la función de las autolisinas.
Para probar si la corbomicina y la complestatina inhiben las autolisinas en células completas,
examinamos los efectos de los compuestos sobre la lisis de B. subtilis . Al bloquear la síntesis de
peptidoglicano con ampicilina o fosfomicina, la degradación neta de peptidoglicano por autolisinas
conduce a lisis, pero podría ser antagonizada por corbomicina o complestatina (Fig. 3c ). Se sabe
que algunos fármacos bacteriostáticos, especialmente los que se dirigen al ribosoma, como el
cloranfenicol, antagonizan los antibióticos bactericidas al evitar la síntesis de enzimas
líticas 26 (Datos ampliados, Fig. 6a ). Por lo tanto, indujimos la lisis usando azida de sodio para
disipar la fuerza motriz del protón (Fig. 3c). La actividad de la autolisina se inhibe por un pH bajo
junto a la membrana celular, pero esta inhibición se reduce a medida que este pH aumenta con el
tratamiento con azida 27 , 28 . Se encontró que la corbomicina y la complestatina protegen las
células de la lisis inducida por la azida sódica, mientras que el cloranfenicol no (Fig. 3c , Fig. 7a
de datos extendidos ). Se observaron resultados similares para la lisis de S. aureus inducida por la
inhibición de la síntesis de peptidoglicano (Datos extendidos, Fig. 6b ). Estos resultados apoyan la
sugerencia de que la corbomicina y la complestatina inhiben las autolisinas en células completas.
A continuación, simplificamos nuestro sistema de células completas a un ensayo in vitro que
contiene peptidoglicano y varias hidrolasas de peptidoglicano con diferentes especificidades de
enlace. El peptidoglicano intacto es insoluble, por lo que la digestión se puede controlar mediante el
seguimiento de la disminución de la densidad óptica a medida que se solubiliza el
peptidoglicano. Primero probamos dos muramidasas: lisozima de clara de huevo de gallina
y mutanolisina de Streptomyces globisporus . Estas enzimas hidrolizan los enlaces β-1,4-
glicosídicos entre el ácido N- acetilmurámico (MurNAc) y la N- acetil- D -glucosamina (GlcNAc)
de la cadena principal de glucanos de los peptidoglicanos (Fig. 3d). La complestatina inhibió
fuertemente la digestión del peptidoglicano por ambas muramidasas, mientras que la corbomicina
bloqueó la digestión sólo a concentraciones más altas: 400 μg ml -1 de corbomicina por 1 mg ml -1
de
 peptidoglicano (Fig. 3e , Datos extendidos Fig. 6c ). A continuación, purificamos y probamos
dos endopeptidasas de B. subtilis , CwlK (YcdD) y CwlO (YcvE), que escinden el tallo peptídico
del peptidoglicano entre L -Ala y D -Glu o entre D -Glu ym DAP,
respectivamente 29 , 30 (Figura 3d). Elegimos estas enzimas como autolisinas fisiológicamente
relevantes representativas, ya que ambas son activas durante el crecimiento vegetativo de B.
subtilis pero se dirigen a enlaces diferentes y tienen dominios catalíticos no relacionados. La acción
de ambas enzimas sobre el peptidoglicano fue fuertemente inhibida en grados similares por
corbomicina y complestatina a concentraciones tan bajas como 10 μg ml -1 de antibiótico por 1 mg
ml -1 de peptidoglicano (Fig. 3e ). Por tanto, la corbomicina y la complestatina bloquean ampliamente
la actividad de las hidrolasas de peptidoglicano, independientemente de la familia de enzimas.
A continuación, utilizamos FDAA para medir la incorporación de peptidoglicano después del
tratamiento de B. subtilis con corbomicina 0,6 x MIC. Encontramos un aumento significativo en la
señal FDAA después del tratamiento, en contraste con el de las células tratadas con corbomicina 2 ×
MIC (Fig. 2d , Datos extendidos Fig. 3b ). Se observó un aumento similar en el marcaje de
peptidoglicano naciente usando el conjugado fluorescente vancomicina-BODIPY FL (Datos
extendidos Fig. 6d ) y se ha documentado para mutantes multiautolisina B. subtilis 31. Este fenotipo
es consistente con una ralentización de la hidrólisis de peptidoglicano sin afectar la síntesis de
peptidoglicano, lo que da como resultado la acumulación de peptidoglicano marcado. A 2 × MIC,
cuando el crecimiento se detiene por completo (datos extendidos, figura 3b ), la síntesis de
peptidoglicano puede disminuir en equilibrio con la degradación y no producir cambios
significativos en la incorporación de HADA (figura 3c , datos extendidos, figura 3b ). Combinados
con los resultados anteriores, estos hallazgos sugieren que la complestatina y la corbomicina
inhiben las autolisinas tanto in vitro como en células completas.
La corbomicina y la complestatina se unen al peptidoglicano
La capacidad de la corbomicina y la complestatina para inhibir una amplia gama de autolisinas
estructuralmente no relacionadas sugiere que se unen al sustrato común, el peptidoglicano. La
incapacidad para digerir el peptidoglicano preincubado con antibiótico y luego lavado antes del
tratamiento con CwlO apoyó aún más la sugerencia de que la inhibición resulta de una interacción
entre el antibiótico y el peptidoglicano, no entre el antibiótico y la enzima (Datos extendidos
Fig. 7a ). Probamos la unión incubando los antibióticos con peptidoglicano insoluble en un rango de
proporciones de peso a peso, recolectando material insoluble, incluido cualquier antibiótico unido, y
cuantificando el antibiótico soluble restante por HPLC. Validando nuestro ensayo, se demostró que
la vancomicina se une al peptidoglicano mientras que los controles negativos daptomicina y
rifampicina no lo hicieron (Fig.4a , Datos extendidos Fig. 7b ). La corbomicina y la complestatina
se unieron y se eliminaron de la solución mediante B. subtilis y S. aureus peptidoglicano de una
manera dependiente de la dosis (Fig. 4a ).
FIGURA 4:a , cromatogramas de HPLC de antibiótico que no se unieron después de la incubación
con B. subtilis o con peptidoglicano de S. aureus . El antibiótico y el peptidoglicano se combinaron
en varias proporciones p / p, y el acortamiento de un pico en comparación con el control de tampón
que carecía de peptidoglicano representa la unión del compuesto y la eliminación de la
solución. b , c , Imágenes de barras de B. subtilis (arriba) o protoplastos (abajo) teñidas con
complestatina fluorescente (complestatina – BODIPY; b ) o corbomicina (corbomicina –
BODIPY; c). Se utilizaron condiciones de tinción, tiempo de exposición y ajustes de imagen
idénticos para las imágenes de protoplastos y varillas. Todos los experimentos se realizaron en dos
ocasiones distintas con resultados similares.
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Para visualizar aún más la unión de peptidoglicano, sintetizamos corbomicina y complestatina
marcadas con fluorescencia derivando el extremo carboxi con BODIPY-FL-EDA para generar los
conjugados corbomicina-BODIPY y complestatina-BODIPY (Datos extendidos Fig. 7c ). Se
demostró que estos derivados retienen la actividad en el objetivo (métodos, datos extendidos,
figura 7d ). Estamos manchados B. subtilis células con 2 x MIC tinción antibiótico y observado de
la parte exterior de la célula, incluyendo los tabiques de división, que es consistente con su unión a
peptidoglicano (Fig. 4b, c ). La generación de protoplastos mediante la eliminación de la pared
celular con lisozima eliminó la tinción con corbomicina-BODIPY o complestatina-BODIPY
(Fig. 4b, c). En conjunto, estos resultados muestran una interacción específica entre peptidoglicano
y corbomicina o complestatina en un motivo que se encuentra ampliamente en peptidoglicanos de
diferentes especies, incluyendo Staphylococcus y Bacillus spp.
Hasta donde sabemos, nuestros resultados respaldan un mecanismo de acción sin precedentes
mediante el cual la corbomicina y la complestatina se unen al peptidoglicano y bloquean su acceso a
las autolisinas. Aunque las autolisinas son una familia altamente redundante de enzimas y por lo
general ninguna enzima es esencial, al unirse al propio peptidoglicano, la corbomicina y la
complestatina bloquean la mayor parte, si no toda, la actividad de la autolisina necesaria para la
expansión de la pared celular, inhibiendo así el crecimiento.
Eficacia in vivo en ratón
Investigamos la eficacia in vivo de corbomicina y complestatina en el tratamiento de una
infección. En particular, ambos compuestos no son tóxicos para las células eucariotas, incluidas las
levaduras y las células de riñón embrionario humano (HEK) (Tabla de datos ampliada 1 ). Debido a
la escasa solubilidad en agua de los compuestos, decidimos formular los antibióticos como una
loción tópica para nuestros estudios preliminares. Establecimos un Staphylococcus
aureus resistente a la meticilina(MRSA; Rosenbach ATCC 33591) infección superficial de la piel
en ratones neutropénicos y se aplicó complestatina o corbomicina en una loción a base de
vaselina. Se utilizó como comparación el ácido fusídico, un antibiótico de aplicación tópica
común. Tanto la complestatina como la corbomicina redujeron significativamente la carga
bacteriana alrededor de 100 veces a las 33 h después de la infección, con una eficacia similar al
ácido fusídico (Datos extendidos Fig. 8a ) y en línea con estudios previos 32 , 33 , 34 . La pérdida de
peso exhibida por los ratones durante la infección se redujo significativamente y la formación de
costras y la necrosis de la herida mejoraron notablemente, en comparación con los controles de
vehículo (Datos extendidos, Fig. 8b, c ).
Discusión
Aunque los actinomicetos contienen una gran cantidad de diversidad química potencial, la
priorización de las BGC para el seguimiento sigue siendo un cuello de botella. Al combinar la
divergencia filogenética con la ausencia de determinantes de autorresistencia dedicados para
priorizar las BGC, describimos el descubrimiento de una nueva clase funcional de GPA con un
mecanismo de acción novedoso. Este enfoque es similar a los que utilizan el análisis filogenético de
etiquetas de secuencia que han sido amplificadas a partir de muestras metagenómicas mediante
PCR 3 , 4 , 35., pero incorpora información de múltiples genes en una BGC intacta en lugar de
etiquetas de secuencia única. El seguimiento de la historia filogenética de BGC GPA completo
permite la identificación de BGC divergentes, porque no todos los genes dentro de un grupo siguen
el mismo linaje evolutivo. Esta estrategia también proporcionó información sobre el agrupamiento y
la ubicación de dominios en la péptido sintasa no ribosomal, así como importantes predicciones
estructurales para purificar la corbomicina. Es importante destacar que, a diferencia de los métodos
anteriores, también nos centramos en las BGC que carecen expresamente de un cierto mecanismo
de resistencia. Aunque la actividad biológica de los compuestos identificados no se puede predecir a
priori, esta estrategia da prioridad a los compuestos que tienen más probabilidades de tener nuevos
modos de acción.
Se han descrito antibióticos que bloquean casi todos los pasos en la síntesis de peptidoglicanos,
pero, según nuestro conocimiento, la complestatina y la corbomicina son las primeras en inhibir la
remodelación de peptidoglicanos. Diferentes miembros de la familia pueden tener sitios de unión de
peptidoglicanos ligeramente diferentes, lo que podría explicar diferencias sutiles en la actividad
entre corbomicina y complestatina. Al actuar como sondas químicas para la unión de
peptidoglicanos y la inhibición de autolisina, la corbomicina y la complestatina, junto con sus
derivados fluorescentes, serán herramientas útiles para el estudio de las hidrolasas de
peptidoglicanos.
Para evitar la resistencia cruzada con los antibióticos existentes, el desarrollo de compuestos con
nuevos objetivos es un objetivo codiciado pero difícil de alcanzar. Aunque otros han explorado la
idea de inhibir las autolisinas en el contexto de la virulencia 36 , 37 y la potenciación de β-
lactámicos 38, la falta de una única proteína esencial impidió que las autolisinas emergieran como
un objetivo antibiótico primario. El hallazgo de que la corbomicina y la complestatina inhiben la
mayoría o todas las autolisinas al unirse al peptidoglicano representa, por tanto, el descubrimiento
de antibióticos con un mecanismo de acción muy buscado. La corbomicina y la complestatina son
activas contra cepas clínicas resistentes a múltiples fármacos, muestran un desarrollo de baja
resistencia y son eficaces in vivo en un modelo de ratón de infección cutánea, lo que las convierte
en una vía interesante para el desarrollo futuro.
Métodos
Cepas y condiciones de cultivo
Todas las cepas, obtenidas de este estudio y de estudios anteriores 17 , 39 , 40 , 41 , se enumeran en la
Tabla 2 de datos extendidos . Las cepas se cultivaron en condiciones de cultivo estándar a 37 ° C en
caldo Mueller Hinton (MHB; BD Biosciences) o caldo Lennox (LB; Bioshop). Los antibióticos se
suplementaron según fue necesario para las cepas de B. subtilis (7,5 μg ml -1 kanamicina para las
cepas de recolección knockout BKK, 1 μg ml -1 eritromicina y 12 μg ml -1 lincomicina para las cepas
de recolección knockout BKE, 10 μg ml -1cloranfenicol para cepas integradas pSWEET). Se
adquirieron antibióticos de Sigma, excepto moenomicina (Cayman Chemicals), ampicilina y
kanamicina (Bioshop).
Identificación de clústeres
Obtuvimos grupos de GPA BGC que constaban de secuencias previamente publicadas (31 BGC) y
usamos secuencias de huellas dactilares GPA 6 y BLASTp seguidas de antiSMASH 42 para
identificar nuevas BGC de GenBank (18 BGC) y nuestra colección interna (22 BGC). Cualquier
secuencia con un acierto ( valor e <1 × 10 −5) se ejecutó posteriormente a través de antiSMASH
(v.4.2, opciones “–smcogs – knownclusterblast – full-hmmer”), y los resultados se buscaron para un
GPA o un grupo similar a GPA, que definimos como un péptido sintasa no ribosómico (NRPS ) se
agrupan con biosíntesis de 4-hidroxifenilglicina y / o 3,5-dihidroxifenilglicina, y opcionalmente
enzimas de adaptación (halogenasa, glicosiltransferasa, acilación, metiltransferasa, etc.). Esto
generó una lista de 71 grupos completos o parciales de secuencias del genoma total o parcial, e
incluyó BGC conocidas publicadas y supuestas desconocidas. Un análisis más completo de estos
conglomerados se encuentra en un estudio previo 9 .
Construcción de árboles
Las reglas de detección de NRPS en antiSMASH identifican dominios funcionales bien conocidos
en los grandes genes de sintasa multimodular para facilitar las predicciones estructurales de los
productos de las enzimas NRPS. Estos dominios incluyen la proteína transportadora de peptidilo o
dominios de tiolación (T-), dominios de adenilación (A-) que activan los aminoácidos precursores
antes de que puedan incorporarse en el andamio peptídico, dominios de epimerización (E-) que
catalizan la conversión de aminoácidos de D a L epímeros, dominios X que facilitan la reticulación
oxidativa 43y dominios de condensación (C-) que catalizan la formación de enlaces peptídicos. Las
secuencias identificadas como dominios C se alinearon utilizando MUSCLE (parámetros
predeterminados) y se inspeccionaron manualmente para detectar la presencia de espacios y
regiones desalineadas. Esta alineación se utilizó para calcular un árbol de máxima verosimilitud
(ML) utilizando FastTree 2, utilizando el modelo de sustitución WAG y la aproximación CAT con
el número predeterminado de categorías de tasas. Cada bloque de dominios C marcados en la
filogenia para las posiciones numeradas en los andamios de GPA es robusto, con valores de soporte
tipo SH> 0,949 excepto uno (0,891 para corbomicina C + 2). Otros métodos bioinformáticos están
disponibles en un estudio anterior 9 .
Debido a la variación en el número de dominios de condensación codificados por NRPS en cada
BGC, aplicamos un sistema de etiquetado para los dominios de condensación sobre la base de la
ubicación con respecto a la 4-hidroxifenilglicina codificada centralmente compartida, posición 0,
para permitirnos visualizar las tendencias dentro de este árbol (Datos extendidos Fig. 1a ). Usando
este sistema de etiquetado, se puede observar la relación entre los dominios de condensación de
diferentes módulos y entre las cepas dentro de un módulo individual (Datos extendidos,
Fig. 1b ). La ubicación C-2 en este esquema de etiquetado de estructura de dominio se muestra
como un ejemplo en la Fig. 1a .
Prueba de susceptibilidad a antibióticos
La susceptibilidad a los antibióticos se probó utilizando procedimientos estándar en MHB para la
mayoría de las cepas. Se cultivaron cepas de Enterococcus en medio de infusión de cerebro-corazón
(BD Biosciences). Las CIM de Streptomyces se determinaron en caldo de soja tríptico (TSB; BD
Biosciences) con extracto de levadura al 0,5%. El inóculo de Neisseria gonorrhoeae para la
determinación de la CMI se preparó a partir de cepas sembradas en agar chocolate enriquecido y
resuspendido en medio líquido GW 44 , y las placas de microtitulación se incubaron con agitación a
500 rpm, 37 ° C, 5% CO 2 y 90% de humedad durante 12 h. Para la determinación de la CIM, la
daptomicina y la bacitracina se suplementaron con CaCl 2 1,25 mM o 40 μg ml -
1
 ZnCl 2respectivamente. Se montaron tableros de ajedrez bidimensionales de acuerdo con el
protocolo estándar.
Fermentación y purificación de corbomicina.
Las predicciones estructurales para la corbomicina se informaron utilizando árboles filogenéticos de
dominios de adenilación de NRPS, incluida la especificidad de 3,5-dihidroxifenilglicina, que es
notoriamente difícil de predecir para este aminoácido 45 . Se predijo que el NPRS codificaba un
nonapéptido, en contraste con la estructura heptapéptida de la mayoría de los antibióticos
GPA. Estas predicciones estructurales guiaron la purificación inicial de corbomicina,
independientemente de la actividad antibiótica.
Se inoculó micelio WAC01529 de 50 ml de cultivo de semillas de TSB en cada uno de dieciocho
matraces de 2,8 litros que contenían 600 ml de medio de Bennett (1% de almidón de patata, 0,2%
de casaminoácidos, 0,18% de extracto de levadura, 0,02% de KCl, 0,02% de MgSO 4 · 7H 2 O,
0,024% de NaNO 3 , 0,0004% FeSO 4 · 7H 2 O). Después de 4 días, las fermentaciones se
alimentaron con 0,2 mM cada una de cisteína, histidina, glutamina y tirosina. Se prepararon
suplementos de aminoácidos como reservas 100x en agua (Cys, His, Glu) o HCl 10 mM (Tyr) y se
neutralizaron con dos equivalentes de NaHCO 3 después de la adición a las fermentaciones.
El medio gastado se extrajo con resina HP-20 (Diaion) al 8% (p / v). Los sedimentos celulares se
extrajeron dos veces con 500 ml de MeOH y se concentraron al vacío con 100 g de resina HP-20
(Diaion). Estas resinas se combinaron y se eluyeron con H 2 O (2 l), MeOH al 20% (2 l), 40% de
MeOH (2 l) y 100% de MeOH (4 l). El análisis de fracciones por HPLC y cromatografía líquida
junto con espectrometría de masas (LC-MS) identificó un pico con una masa molecular (alrededor
de 1300 a 1600 Da) y un perfil de absorción de UV (máximo a 220 nm y 280 nm) que eran
consistentes con la estructura predicha. Esta fracción (100% MeOH) se extrajo con acetato de etilo,
MeOH / H 2O (1: 4) y DMSO. Se encontró que la subfracción DMSO contenía el glicopéptido
predicho y se aplicó a CombiFlash ISCO de fase inversa (RediSep Rf C18, Teledyne) y se eluyó
con un sistema de gradiente lineal (agua al 5-100% / acetonitrilo, ácido fórmico al 0,1%) para dar
136 fracciones. Las fracciones que contenían el glicopéptido predicho se combinaron y se
sometieron a una columna de Sephadex LH-20 (400 ml), eluyendo con MeOH / acetonitrilo / H 2 O
(1: 2: 1), para un rendimiento del 36 subfracciones. Las subfracciones identificadas se combinaron y
se purificaron adicionalmente con una columna Agilent Eclipse XDB-C8 (5 µm, 9,4 x 250 mm),
para producir 23,6 mg de corbomicina.
Fermentación y purificación de complestatina.
Streptomyces sp. WAC01325 se fermentó utilizando condiciones idénticas a las utilizadas
para Streptomyces sp. WAC01529, excepto para alimentación con aminoácidos. Después de 3 días
de crecimiento a 30 ° C, 250 rpm, las fermentaciones se alimentaron con 0,2 mM de cada uno de 4-
hidroxifenilglicina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos se prepararon como una solución madre
100X en HCl 10 mM y se neutralizaron con dos equivalentes de NaHCO 3 después de la adición a
las fermentaciones. Se dejó que continuara el crecimiento durante un total de 8 días y se purificó
complestatina a partir del medio gastado y el sedimento celular de una manera similar a la
corbomicina. La espectrometría de masas de ionización por electropulverización de alta resolución
(HR-ESI-MS) y la resonancia magnética nuclear de 1 H (RMN) confirmaron que el compuesto era
complestatina.
Caracterización estructural de corbomicina
Para dilucidar su estructura, la corbomicina se sometió a experimentos 1D y 2D NMR y HR-ESI-
MS; todos los datos estructurales se muestran en las Figs. suplementarias. 1 - 6 y en la Tabla
Suplementaria 1 . Se realizaron experimentos de RMN unidimensionales y bidimensionales
utilizando un instrumento Bruker AVIII de 700 MHz equipado con una criosonda en DMSO
deuterado. Los desplazamientos químicos se informan en partes por millón (ppm) en relación con el
tetrametilsilano usando las señales de disolvente residual a 2,50 ppm en RMN de protón y 39,5 ppm
en RMN de carbono como señales internas. Los datos de HR-ESI-MS se adquirieron utilizando un
módulo de separación UPLC Agilent 1290 y un detector de masas qTOF G6550A en modo de iones
negativos. La interpretación de los datos de MS y NMR para la determinación estructural se
proporciona en la  Discusión complementaria.
sobreexpresión y knockout fab y cwlO en B. subtilis 168
FabI de longitud completa, fabL, cwlO y cwlO  1–407 truncado se clonaron a partir de B. subtilis 168
gDNA en pSWEET 46 para sobreexpresión bajo un promotor inducible por xilosa 46 . Ambos
amplicones pSWEET - bgaB y PCR se digirieron con las enzimas de restricción PacI y BamHI antes
de la ligación y electroporación en E. coli Top10 y selección con 100 µg ml -1 de ampicilina. Para la
transformación en B. subtilis 168, se digirió 1 μg de ADN plasmídico con PstI y se transformó
como se describió previamente usando selección con 10 μg ml -1 de cloranfenicol 41 . ComoB.
subtilis Δ cwlO muestra pérdida de competencia genética 47 , B. subtilis Δ cwlO Se generaron cepas
de combinación pSWEET transformando posteriormente 2 μg de ADNg de BKE34800 en las
respectivas cepas que contienen pSWEET y se seleccionaron con los antibióticos apropiados. Para
las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos, se indujo la sobreexpresión de genes utilizando
xilosa al 3% p / v en medio LB.

Ensayo de  luminiscencia P ywaC
La activación de P ywaC se probó en B. subtilis EB1385 como se describió previamente con
modificaciones menores [ 17] . EB1385 se cultivó durante la noche en MHB con 1 µg ml- 1
de
 eritromicina, luego se diluyó hasta una densidad óptica a 600 nm (DO 600 ) de 0,15 en MHB
reciente. Se dispensaron 100 µl de inóculo en una placa blanca de 96 pocillos con fondo
transparente. Los antibióticos se añadieron por triplicado en una dilución en serie doble de 16 µg
ml -1 a 0,125 µg ml -1 . La placa se cubrió con una película ópticamente transparente y se incubó a
37 ° C con agitación, con una DO 600y la luminiscencia (tiempo de integración de 0,1 s)
monitorizada utilizando un lector de placas EnVision Multilabel (PerkinElmer) a intervalos de 10
minutos. La luminiscencia se informa para la concentración más baja que inhibió completamente el
crecimiento en este inóculo (2 μg ml -1 de vancomicina, 4 μg ml -1 de corbomicina, 8 μg ml -1
de
 complestatina, 1 μg ml -1 de triclosán).
Ensayo de fluorescencia de colorante DiSC 3
La permeabilidad de la membrana se probó utilizando el colorante sensible al voltaje DiSC 3 . La
fase logarítmica media de B. subtilis 168 cultivada en LB (DO 600 ≈ 0,6) se lavó dos veces en
HEPES 5 mM (pH 7,3) y finalmente se resuspendió en HEPES 5 mM con glucosa 20 mM (pH 7,3),
ajustando la DO 600 a 0,1. Se dispensó una porción de la suspensión celular (200 μl) en una placa
negra de 96 pocillos y DiSC 3Se añadió tinte en DMSO hasta una concentración final de 1 µM. Las
células se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min con agitación para permitir la
absorción del tinte y se controló la extinción de la fluorescencia usando un lector de microplacas
Synergy H1 (excitación / emisión 600 nm / 660 nm). Cuando la fluorescencia se estabilizó, los
compuestos de prueba se agregaron a una concentración final de 10-12 μM (18 μg ml -1
de
 gramicidina, 11 μg ml -1 de valinomicina, 16 μg ml -1 de vancomicina, corbomicina y complestatina)
y se controló la fluorescencia. Se informa la fluorescencia máxima, observada 250 s después de la
adición del compuesto para todos los antibióticos. El experimento se realizó por triplicado en dos
ocasiones independientes.
Acumulación de UDP-MurNAc-PP en S. aureus
La acumulación de UDP-MurNAc-PP se midió en S. aureus como se describió previamente 48 . En
resumen, S. aureus ATCC 29213 en fase logarítmica media, pretratado con 130 μg ml -1
de
 cloranfenicol, se dividió en alícuotas de 10 ml y se expuso a un antibiótico de prueba 10 × MIC
(10 μg ml -1 de corbomicina, 20 μg ml -1 complestatina, 1,25 μg ml -1 ampicilina, 10 μg ml -
1
 vancomicina, 1,25 moenomicina, 160 μg ml -1 bacitracina zinc, 20 μg ml -1 fosfomicina, 160 μg
ml -1 carbenicilina, 80 μg ml -1 mecilinam, 640 μg ml −1aztreonam). Después de 1 hora de incubación
a 37ºC, 250 rpm, las células se sedimentaron y se extrajeron con agua hirviendo. Los extractos
solubles se liofilizaron, luego se resuspendieron en 100 μl de agua y 20 μl se analizaron en una
columna Inertsil ODS-4 4 × 150 mm corrida con elución isocrática (0,5 ml min -1 , tampón fosfato
de sodio 50 mM, pH 5,2) a 37 ° C. Los resultados informados son representativos de dos
experimentos independientes.
Determinación de unidades formadoras de colonias para fármacos bacteriostáticos.
 Se dispensó la fase de registro medio B. subtilis 168 (DO 600 = 0,25) en LB en alícuotas de 1,5 ml y
se trató con 4 × MIC (4 μg ml -1 ) o 8 × MIC (8 μg ml -1 ) complestatina, corbomicina o
cloranfenicol, o si no se trata. Las células se incubaron a 37 ° C durante 6 h, luego las células se
lavaron dos veces con LB para eliminar el antibiótico que podría inhibir el crecimiento, la DO 600 se
ajustó a 0,4 y las unidades formadoras de colonias (ufc) se enumeraron por triplicado. Para las
curvas de crecimiento, estas células se inocularon 1: 200 en LB reciente y se distribuyeron en una
placa de microtitulación. La placa se cubrió con una película transparente y transpirable y se
controló la DO 600 en un lector de microplacas Tecan Sunrise a 37ºC con agitación.
Selección de un solo paso de mutantes resistentes espontáneos
La selección en un solo paso de mutantes resistentes en B. subtilis 168 y S. aureus ATCC29213 en
medio sólido se realizó de acuerdo con el protocolo estándar. Medio Mueller Hinton con 1% de
agarosa y 4 × o 8 × complestatin MIC sólido o corbomycin (32-64 mg ml -1 ) se sembraron con
10 9 -10 10 ufc a partir de un cultivo de una noche. Las UFC se enumeraron directamente de este
cultivo durante la noche. Las placas se incubaron durante 48 ha 37 ° C y no se detectaron colonias
resistentes. El experimento se realizó en dos ocasiones independientes.
Crianza de mutantes resistentes mediante pases en serie
Se generaron mutantes resistentes a complestatina y corbomicina comenzando con la cepa de
laboratorio B. subtilis 168 o S. aureus ATCC 29213. Para comenzar, se inoculó una sola colonia en
1 ml de MHB en un tubo de ensayo estéril con 0,25 × MIC, 0,5 × MIC, 1 × MIC y 2 × MIC (donde
MIC = 1 μg ml −1 para complestatina y corbomicina, y 0,0625 μg ml −1para rifampicina). Después de
24 h de crecimiento con agitación, la concentración más baja sin crecimiento se tomó como la
nueva MIC, y las células se subcultivaron en tubos nuevos 1 en 100 de la concentración más alta
que apoyó el crecimiento. Este proceso se continuó durante 25 días y se tomaron reservas de
glicerol cada vez que hubo un cambio en la CIM. Al final de los 25 días, las reservas de glicerol se
sembraron en un medio no selectivo (agar Mueller Hinton) y se aislaron colonias individuales
durante dos generaciones. La MIC de las cepas purificadas se midió mediante dilución en
microcaldo. El pase en serie se realizó por duplicado biológico utilizando dos líneas independientes.
Para una línea de las células pasadas en serie, se realizó la secuenciación del genoma completo en la
cepa el último día (COM25 y COR25), o en el punto de tiempo más temprano en que se alcanzó la
CIM más alta. Para la corbomicina, esta cepa surgió el día 14 ( B. subtilis COR14) y para la
complestatina, el día 20 ( B. subtilis COM20). La secuenciación del genoma completo en mutantes
resistentes, así como nuestro laboratorio B. subtilis 168, se realizó con Illumina MiSeq (300 pb,
lecturas de extremos emparejados) por Farncombe Genomics Facility. Para identificar mutaciones
exclusivas de nuestros mutantes evolucionados en comparación con el tipo salvaje, cada una de las
tres cepas secuenciadas se comparó con el genoma de referencia publicado de B. subtilis 168
(número de acceso de GenBank AL009126.3) utilizando breseq (v.0.33.1)49 para generar una lista
de diferencias. Seidentificaroncambios en las regiones codificantes de proteínas que eran exclusivos
de los mutantes resistentes y que no estaban presentes en lacepa de B. subtilis 168 denuestro
laboratoriopara el seguimiento. La secuenciación de dos colonias individuales aisladas desde el día
25 dio genotipos idénticos.
Ensayo de lisis celular
Se dispensó la fase exponencial temprana B. subtilis 168 o S. aureus ATCC 29213 (DO 600 0,25)
cultivada en medio LB (100 µl por pocillo) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se
suplementaron antibióticos o MgSO 4 a la concentración apropiada y se añadieron agentes líticos
apropiados (50 µg ml -1 de fosfomicina, 100 µg ml -1 de ampicilina, 75 mM de azida sódica). El exceso
de Mg 2+ inhibe la lisis inducida por azidas mediante un mecanismo que no se comprende bien, pero
que se cree que se debe parcialmente a la modulación de la actividad de autolisina 50 , 51 . La placa
se cubrió con una película transparente y transpirable y OD 600 se controló en un lector de
microplacas Tecan Sunrise durante 10 ha 37 ° C con agitación.
Sobreexpresión de autolisina y purificación de E. coli
CwlK y el dominio CwlO catalítica con péptidos señal retirados fueron clonados en pET28a (EMD
Biosciences) usando cebadores CwlK_Full-F
(GTCACCCATGGGCCATGAATGGCATTCTCAAAA) y CwlK_Full-R
(GTCACCTCGAGGTTAGGAATCATCTCCAAGTG), o CwlO_Cat-F
(GTCACCCATGGGCACTGTTATCAGCAACTCTGG) y CwlO-R
(GTCACCTCGAGTTGAACAACACGTCTTACAAC), respectivamente y sitios de restricción
NcoI y XhoI para la introducción de 6 × His C-terminal. La clonación se realizó en E. coli Top10
seguida de transformación en E. coli BL21 (DE3) pLysS para la expresión. Para la expresión, se
inoculó 1 l de medio LB suplementado con 50 μg ml -1 de kanamicina y 35 μg ml -1 de cloranfenicol
1:50 de un cultivo durante la noche y se cultivó a 37 ° C, 250 rpm hasta una DO 600alcanzó 0,6. Las
células se indujeron con isopropil β- D -1-tiogalactopiranósido (IPTG) 2 mM a 37 ° C durante 3 h
(CwlO), o 18 ha 18 ° C con IPTG 1 mM (CwlK). Los sedimentos celulares se resuspendieron en 20
ml de tampón de lisis (HEPES 25 mM (pH 8), NaCl 300 mM, imidazol 10 mM) y se congelaron a -
80ºC. Para la purificación, los gránulos se descongelaron, se trataron con tabletas inhibidoras de
proteasa Pierce (Thermo Fisher Scientific), 10 mg ml -1 de lisozima y 5 μg ml -1 DNase, and lysed on
ice by sonication. Clarified lysates were loaded onto equilibrated 2 ml Ni-NTA agarose (Qiagen),
washed (25 mM HEPES (pH 8), 300 mM NaCl, 25 mM imidazole) and eluted (25 mM HEPES (pH
8), 300 mM NaCl, 250 mM imidazole). Elutions were dialysed overnight in buffer A for
downstream anion or cation exchange. CwlO was purified by cation exchange with a HiTrap SP HP
5 ml column (GE Healthcare) on an AKTA Explorer system (buffer A: 25 mM HEPES (pH 8);
buffer B: 25 mM HEPES (pH 8), 1 M NaCl). CwlK was similarly purified by anion exchange on a
HiTrap Q HP 5 ml column (GE Healthcare) (buffer A: 25 mM Tris-HCl (pH 8); buffer B: 25 mM
HEPES (pH 8), 1 M NaCl). Buffer exchange and concentration of fractions containing pure protein
was performed using Amicon Ultra centrifugal filters with a 3,000 Da cut-off. Protein purity was
>95% as assessed by SDS–PAGE analysis.
La actividad específica de las enzimas purificadas se confirmó realizando digestión con
peptidoglicano, como se describe a continuación, con enzima inactivada. CwlK,
una metaloproteasa 30 dependiente de Zn 2+, podría inhibirse mediante la adición de EDTA 0,5 mM,
mientras que CwlO, una cisteína peptidasa 29 de NplC / P60, podría inhibirse mediante la
preincubación con maleimida 4 mM.
Aislamiento y digestión de peptidoglicanos
Para preparar peptidoglicano como sustrato para experimentos de unión o digestión, se cultivó B.
subtilis 168 o S. aureus ATCC 29213 hasta una DO 600 0,6-0,7 en medio LB y se purificó el
peptidoglicano como se describió previamente con una modificación menor 52 . En resumen, los
sedimentos celulares se hirvieron en SDS al 4%, luego se lavaron, se sonicaron para romper los
sáculos, se trataron con α-amilasa y DNasa y finalmente se digirieron con pronasa durante la
noche. El peptidoglicano se hirvió de nuevo en SDS al 2%, se lavó y los ácidos teicoicos se
hidrolizaron con HCl 1 M. El peptidoglicano puro se lavó con agua hasta que el pH alcanzó 6 y se
liofilizó.
Para la digestión enzimática de peptidoglicano, las condiciones para cada enzima se optimizaron de
la siguiente manera: mutanolisina (20 μg ml -1 , 1 mg ml -1 de peptidoglicano, acetato de sodio 20
mM, pH 6,5), lisozima (100 μg ml -1 , 1 mg ml -1 peptidoglicano, acetato de sodio 20 mM, pH 6,5),
CwlO (20 μg ml -1 , 0,5 mg ml -1 peptidoglicano, MES-NaOH 20 mM, pH 5,5), CwlK (16 μg ml -1 ,
1 mg ml - 1 peptidoglicano, ZnSO 4 10 μM, Acetato de sodio 20 mM, pH 6,5). Para probar el efecto
de la corbomicina y la complestatina en la digestión, se preincubaron 100 μl de peptidoglicano en
tampón, como se indica, con antibiótico o un volumen correspondiente de DMSO con agitación
durante 30 min, luego se distribuyeron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y enzima
añadida. La placa se cubrió con una película transparente y transpirable para evitar la evaporación,
y se rastreó la DO 600 en un lector de microplacas Tecan Sunrise agitando a 37 ° C. Los resultados
muestran la desviación estándar y promedio de pozos triplicados.
Imágenes FDAA
B. subtilis 3610 (tipo salvaje) se cultivó en medio LB a 37 ° C hasta la fase exponencial (DO 600 0.1-
0.2), luego se diluyó con medio LB fresco 1:10 y se dejó crecer hasta una DO 600 de 0,2. Se
añadieron complestatina y corbomicina a cultivos celulares de crecimiento exponencial (0,3 ml)
hasta una concentración final de 0,6 x o 2 x MIC y se incubaron durante 5 min a
37ºC. Alternativamente, se añadió ampicilina a CIM 0,5 x, 1 x, 2 x y 5 x y se incubó durante 1 min
a 37 ° C. Se añadieron FDAA (solución de DMSO 100 mM) a los cultivos hasta una concentración
final de 0,5 mM y se incubaron a 37ºC con agitación durante 1 h (complestatina y corbomicina). Se
utilizó un tiempo de incubación más corto (5 min) para las células tratadas con ampicilina para
prevenir la lisis. Las células se fijaron mediante la adición de etanol puro a los cultivos hasta una
concentración final del 70% (v / v), se incubaron en hielo durante 1 hora y finalmente se lavaron
dos veces con PBS. No marcar las células con el isómero L HCC-amino- L-alanina (HALA)
confirmó que la incorporación fue realizada por transpeptidasas (Datos extendidos Fig. 3c ).
Para la obtención de imágenes de células, las células se aplicaron a un cubreobjetos (24 x 50 mm;
1,5) y se cubrieron con una almohadilla de agarosa-PBS de 8 x 8 mm de ancho y 2 mm de espesor
(SeaKem LE Agarose). La combinación de cubreobjetos y almohadilla se colocó en un soporte de
portaobjetos personalizado en el microscopio con la almohadilla hacia arriba. Las imágenes de
contraste de fase y fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio invertido Nikon Ti-E
equipado con un objetivo de aceite Plan Apo 60 × de apertura numérica de 1,4 y una cámara Andor
iXon EMCCD. Se utilizó NIS-Element AR (v.5.02) para la adquisición de imágenes. Se aplicaron
condiciones idénticas (exposición, potencia de la fuente de luz y ganancia de multiplicación de
electrones) a todas las muestras para realizar comparaciones válidas. Los filtros para la formación
de imágenes HADA fueron los siguientes: excitación 395/25 nm (DAPI) y emisión 435/26 nm.
El procesamiento de imágenes se realizó en FIJI (v.1.51). Las imágenes se escalaron sin
interpolación, se recortaron y se rotaron. Se realizó un ajuste lineal para optimizar el contraste y el
brillo de las imágenes. La medición cuantitativa de la intensidad del etiquetado FDAA se logró
utilizando un complemento FIJI, MicrobeJ, en el que las células se identificaron en el canal de
contraste de fase con un límite de ancho de 0,3 μm a 2 μm y una longitud superior a 1 μm. A
continuación, se cuantificó y promedió la intensidad del etiquetado de la FDAA de modo que n  >
100 para cada afección.
Ensayo de unión de peptidoglicanos
Para evaluar la unión de peptidoglicano, se diluyeron 1,6 mg ml -1 de antibiótico disuelto en DMSO a
0,1 mg ml -1 en tampón fosfato 20 mM (pH 7,1) con 0 mg ml -1 , 0,1 mg ml -1 , 0,5 mg ml -1 , 1 mg
ml -1 , 5 mg ml -1 o 10 mg ml -1 de peptidoglicano para proporciones p / p de 0, 1: 1, 5: 1, 10: 1, 50: 1
y 100: 1 p / p, respectivamente. B. subtilis 168 y S. aureusEl peptidoglicano ATCC 29213 se ensayó
de forma similar. Los volúmenes de reacción se ajustaron de modo que se usó un mínimo de 24 µg
de peptidoglicano en la condición de relación más baja para permitir que se formara un sedimento
visible de peptidoglicano. Las mezclas se incubaron durante 1 a 2 ha 37 ° C, luego se centrifugaron
durante 10 minutos para sedimentar completamente el material insoluble. Se inyectaron 50 μl de
sobrenadante que contenía antibiótico no unido (máximo 5 μg) y se detectaron mediante HPLC
utilizando una columna WAT094269 Symmetry Shield RP 8 3,5 μM 4,6 × 150 mm y el siguiente
gradiente a 0,8 ml min -1 , 40 ° C: 0-2 min 0% de B, 2-12 min 0-95% de B, 12-18 min 95% de B,
18-20 min 95-0% B (tampón A: H 2 O + 0,1% de ácido fórmico, tampón B: acetonitrilo + Ácido
fórmico al 0,1%).
Semisíntesis antibiótico-BODIPY
La vancomicina-BODIPY FL se sintetizó como se describió anteriormente 53 . Se derivatizaron
complestatina y corbomicina combinando cantidades equimolares de antibiótico, etilendiamina
BODIPY FL (Invitrogen), N , N -diisopropiletilamina y reactivos de acoplamiento. Para la
complestatina, se utilizó 2- ( 1H -benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato
(HBTU) más cianohidroxiiminoacetato de etilo (oxyma), y para corbomicina N , NSe utilizó ′ -
diisopropilcarbodiimida (DIC) más oxima. Todos los componentes se disolvieron en
dimetilformamida (DMF), excepto corbomicina y complestatina, que se disolvieron en DMSO. La
reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 24-48 h, luego se purificó mediante HPLC
semipreparativa utilizando una columna XSelect CSH Prep C18 5 μm 10 × 100 mm con un
gradiente de H 2 O + ácido fórmico al 0,1% y acetonitrilo + 0,1% ácido fórmico. Los derivados se
verificaron mediante HR-ESI-MS utilizando un sistema HPLC Agilent 1290 Infinity II Series y
6550 iFunnel QTOF LC – ESI / MS de la siguiente manera: corbomicina – BODIPY [M + 2H] 2+ :
calculado 912.3092, encontrado 912.3094; complestatina – BODIPY [M + H] + : calculado
1.642,2856, encontrado 1.642,2832.
La complestatina-BODIPY y la corbomicina-BODIPY tenían MIC contra B. subtilis 168 de 16 μg
ml -1 , y mostraron un aumento similar de cuatro veces en la MIC contra sus respectivos mutantes
resistentes ( B. subtilis COM20 y COR14 = 64 μg ml -1 ). El crecimiento a niveles sub-MIC produjo
cadenas de células retorcidas (Datos extendidos, Fig. 7d ), similar a los antibióticos no
derivatizados. Por tanto, estos derivados tienen el mismo mecanismo que los compuestos originales.
Microscopio fluorescente
Para etiquetar la síntesis de peptidoglicano activo en células tratadas con antibióticos, la fase
logarítmica media de B. subtilis 168 (DO 600 alrededor de 0,5) cultivada en medio LB se pretrató
primero con 10 × MIC durante 30 min a 37 ° C (10 μg ml -1 de corbomicina , 20 μg ml -
1
 complestatina, 0,039 μg ml -1 ampicilina, 640 μg ml -1 aztreonam). A continuación, se añadió
vancomicina-BODIPY junto con vancomicina sin marcar cada uno a 1 μg ml -1 , como se informó
anteriormente 53 . Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min con agitación,
luego se lavaron tres veces con tampón HEPES 20 mM (pH 8) para eliminar el compuesto no unido.
Para la tinción con complestatina-BODIPY y corbomicina-BODIPY, B. subtilis 168 se cultivó de
manera similar hasta la fase logarítmica media en LB, luego se recogió por centrifugación y se
resuspendió en tampón HEPES 20 mM (pH 8) para la tinción de varillas, o tampón MSM (20 mM
MgCl 2 , 0,5 M de sacarosa, ácido 20 mM de ácido maleico, pH 7) para la generación de
protoplastos. Para los protoplastos, las células en tampón MSM osmóticamente protector se trataron
con 4 mg ml -1 de lisozima durante 1 ha 37 ° C, luego se centrifugaron y se resuspendieron en tampón
MSM fresco antes de la tinción. Las varillas o protoplastos se tiñeron con 2 × MIC complestatin-
BODIPY o corbomycin-BODIPY (32 μg ml -1 ) durante 15 min con agitación, luego se lavaron
cuatro veces en sus respectivos tampones para eliminar el compuesto no unido.
Las células preparadas se montaron sobre vidrio tratado con polilisina y se obtuvieron imágenes
usando un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti con un filtro de fluorescencia de isotiocianato de
fluoresceína para BODIPY (excitación / emisión 470/520 nm). Se utilizaron ajustes de imagen y
tiempo de exposición equivalentes para células teñidas con bastoncillos y protoplastos. Se utilizó
FM 4-64FX (Invitrogen) donde se indica con el correspondiente filtro de fluorescencia.
Microscopio de transmisión por electrones
Para preparar las células para la obtención de imágenes, se cultivó B. subtilis 168 en medio LB con
0,6 μg ml -1 de corbomicina o 1 μg ml -1 de complestatina a una DO 600 de 0,5-0,7, luego se recogió por
centrifugación y se resuspendió en glutaraldehído al 2% (2% v / v) en tampón fosfato 0,1 M (pH
7,4) y se dejó fijar durante la noche a 4ºC. Las muestras se prepararon para TEM como se describió
previamente 54 y se observaron en un microscopio electrónico de transmisión (JEOL) JEOL JEM
1200 EX TEMSCAN que opera a un voltaje de aceleración de 80 kV. Las imágenes se adquirieron
con una cámara digital AMT de 4 megapíxeles (Advanced Microscopy Techniques).
Modelo de infección de piel de ratón
Todos los experimentos con ratones se realizaron en la Central Animal Facility en la Universidad
McMaster bajo el protocolo de uso animal 17-03-10 aprobado por el Animal Research Ethics
Board. Hemos cumplido con todas las regulaciones éticas relevantes. Se utilizaron ratones hembra
BALB / c de seis a diez semanas de edad (Charles River, 028) para todos los experimentos. La zona
herida se preparó como se describió anteriormente 34 . En resumen, la anestesia se indujo con
isoflurano al 5% y se mantuvo al 2,5%. Se eliminó un área de aproximadamente 2 cm 2 en la región
dorsal del cuello usando 25 tiras de cinta de autoclave (3M) hasta que la piel estaba visiblemente
brillante pero no sangraba. Para la preparación bacteriana, se cultivó S. aureus ATCC 33591
durante la noche en medio TSB y se subcultivó hasta una DO 600≈ 0.4. Las bacterias se ajustaron a 5
x 10 6 cfu ml -1 y un volumen de 20 μl (10 5ufc) se aplicó al área herida. Los ratones en grupos de
dos, tres o cuatro fueron reubicados aleatoriamente de jaulas de alojamiento a jaulas de tratamiento
y de control alojadas individualmente. Los antibióticos de prueba se formularon en vaselina
(vaselina) al 1% (p / p) y los animales se trataron 8 veces durante un período de 33 horas en los
siguientes momentos posteriores a la infección: 1, 4, 8, 12, 20, 24, 28, 32 h. Cada tratamiento fue
una formulación de vaselina de 30 mg en peso, excepto el tratamiento a las 12 h que fue de 50
mg. Se eligió una dosis de ácido fusídico para dar concentraciones molares similares a la
complestatina y la corbomicina y para imitar su efecto bacteriostático, ya que el ácido fusídico es
principalmente bacteriostático pero se vuelve bactericida a altas concentraciones 55. Los ratones de
control recibieron DMSO al 10% en vaselina. Los ratones se sacrificaron a las 33 h después de la
infección. En el punto final, se cortó un área de piel de aproximadamente 2 cm 2 y se homogeneizó
en 1 ml de PBS durante 15 min a 30 rps (Retsch MM400). Los homogeneizados se diluyeron en
serie y se colocaron en placas sobre agar de soja tríptico que contenía oxacilina (2 µg ml -1 ) para la
determinación de ufc. Se utilizaron seis animales (réplicas técnicas) en cada grupo de tratamiento,
divididos en dos experimentos realizados en ocasiones independientes (réplicas biológicas). Se
utilizaron nueve ratones de control con vehículo con al menos dos ratones de control en cada lote de
réplicas biológicas realizadas.
análisis estadístico
El análisis estadístico del modelo de infección de piel de ratón se realizó utilizando GraphPad
v.6. La significancia se probó mediante ANOVA unidireccional en rangos con la prueba de
Kruskal-Wallis y el análisis post hoc de Dunn para comparaciones múltiples ( n  = 6 para
complestatina, corbomicina y ácido fusídico, n  = 9 para vehículo). Los rangos medios son los
siguientes: vehículo 27,78, complestatina al 1% 10,33, corbomicina al 1% 11,67, ácido fusídico al
0,25% 6,5.