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Universidad Nacional Abierta y a Distancia

Vicerrectoría Académica y de Investigación
Curso: Biotecnología I
Código: 201529_1
Estudiante: Hernando Chaves Casallas.
Cod: 11 443 586
 MEJORAMIENTO GENETICO DE LA ACTINOBACTERIA Streptomyces
diastaticus EN LA PRODUCCIÓN DE ANTIBIOTICOS TIPO POLIQUÉTIDOS
UTILES PARA EL CONTROL DE BACTERIAS Y HONGOS PATOGENOS.
.
ARTICULO SELECCIONADO:
Evaluación de la capacidad de producción de antibióticos por la cepa
Streptomyces diastaticus SQF108 modificada genéticamente.

Objetivo del artículo: Evaluar la producción de antibióticos

poliquétidos con actividad antifúngica frente a las levaduras
del grupo candidas y el hongo filamentoso Aspergillus niger;
de la cepa Streptomyces diastaticus SQF108 modificada
genéticamente por conjugación plasmídica, evaluación
realizada frente a Bacillus subtilis y Aspergillus niger
producidas en medios de fermentación y pruebas de
antibiograma.
Debido al uso indebido y generalizado de antibiótico en la medicina humana y
veterinaria, actualmente está aumentando exponencialmente el número de cepas
bacterianas y fúngicas resistentes a los antibióticos. (Lukacisinová & Bollenbach,
2017), por lo tanto, se hace necesario acudir a técnicas biotecnológicas que ayuden
en la producción de metabolitos novedosos y con potencial farmacéutico y de
control biológico en la agricultura.

Fuente propia. Flora mixta de hongos y bacterias en medio solido de crecimiento.

Medio Komada, con alto potencial de estudio en la búsqueda de metabolitos
CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ACTUAL DEL
GÉNERO STREPTOMYCES
Esquema taxonómico del nuevo filo Actinobacteria (Goodfellow et al.,
2012). Modificado de Gao et al. 2012:
• Dominio Bacteria
• Filo XXIV Actinobacteria
• Clase I Actinobacteria
• Orden XIV Streptomycetales
• Familia I Streptomycetaceae
• Género I Streptomyces
 Características del género Streptomyces
bacterias filamentosas, miceliales, Gram positivas, aerobias estrictas, grandes
descomponedores de materia orgánica en los ciclos biogeoquímicos (Chater, 1993),
debido a la gran cantidad de enzimas extracelulares que degradan polímeros, tanto de
origen vegetal como animal, por lo que su contribución a la mejora de la fertilidad del
suelo es importante., presentan una actividad secretora notable y una enorme
producción de antibióticos.
Los actinomicetos producen alrededor del 61% de todos los metabolitos secundarios
conocidos (Kieser et al., 2000), de los cuales el 70-80% son sintetizados por especies del
género Streptomyces (Challis and Hopwood, 2003).
ANTIBIOTICOS POLIQUÉTIDOS: son compuestos con estructuras químicas muy variadas,
cuya síntesis deriva de una serie de condensaciones sucesivas de metabolitos esenciales
catalizadas por una actividad enzimática conocida como poliquétido sintasas (PKSs). En
este grupo se engloban compuestos como la eritromicina, la actinorrodina, la
anfotericina B, la oleandomicina, etc.
 TECNICAS BIOTECNOLÓGICAS
MODIFICACIÓN GENETICA, MEDIANTE EL PROCESO DE CONJUGACIÓN.
Esta técnica permite introducir plásmidos con potencialidades para activar rutas
biosintéticas de producción de antibioticos.
Esta técnica fue aplicada en el estudio de interés para introducir un plásmido con un
fragmento de ADN clonado, activador de compuestos poliquétidos, con lo que se
obtuvieron los correspondientes exconjugantes
Los Actinomyces sp., son un genero bacteriano con un potente sistema de restricción
considerándose una barrera para la modificación genética o inclusión de una ADN
Foráneo con el fin de mantener cierta característica o fenotipo estable.
El uso de plásmidos y enzimas de restricción son herramientas biotecnológicas para la
Clonación del ADN . de manera sencilla el proceso es el siguiente: se selecciona el gen
de interés, se corta con enzimas de restricción y luego se pega junto con otros
fragmentos para crear un plásmido recombinante, el cual se considera un plásmido
construido con fragmentos de ADN de diferentes fuentes.
MÉTODO BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA
OBTENCION DE LAS CEPAS MODIFICADAS
• CONJUGACIÓN GENÉTICA PLASMÍDICA, se empleó una modificación
del método de Mazodier y colaboradores: .Mazodier P. et al.
Intergeneric conjugation between E. coli and Streptomyces species. J.
Bacteriol., 171, 3583, 1989:
• El ADN transferido puede ser parte del genoma bacteriano o puede
ser un elemento de ADN extra-genómico llamado Plásmido.
• La conjugación consiste en transferir información genética de una
célula a otra célula bacteriana por contacto directo en donde se forma
un puente (pili), ocurriendo una recombinación genética por medio de
plásmidos, las células obtenida de la conjugación se denomina
transconjugante.
 CEPAS DE ESTUDIO
Descripción de las cepas de estudio, útiles para la recombinación genética:
Streptomyces diastaticus Del cepario del Centro de Química Farmacéutica, aislada a partir de un tamizaje realizado en suelo
SQF108: cubano (cepa original).
Escherichia coli e ET12567 Cepa donante para la conjugación d E. coli a Streptomyces.

Descripción de las cepas exconjugantes obtenidas por la recombinación genética:

Exconjugante S. diastaticus Cepa Streptomyces diastaticus SQF108 conjugada con el plásmido pOW15 que contiene el fragmento
108/pOW15: de 769 pb oriT para la transferencia conjugativa de ADN de E. coli a Streptomyces. AmpR, ThioR (Cepa
control negativo).

Exconjugante S. diastaticus Cepa Streptomyces diastaticus SQF108 conjugada con el plásmido pRET-1 que contiene el fragmento
108/pRET-1: de 760 pb oriT y el promotor del gen regulador del gen de resistencia a eritromicina ermEp, que posee
una capacidad promotora fuerte AmpR, ThioR (Cepa control negativo).

Exconjugante S. diastaticus Cepa Streptomyces diastaticus SQF108 conjugada con el plásmido pRKT-1, que contiene el pRET-1 con
108/pRKT-1: un fragmento de ADN clonado probado activador de poliquétidos proveniente de Streptomyces
rochei. AmpR, ThioR (Cepa control negativo).

Descripción de las cepas de estudio, útiles para la evaluación de antibiosis bactericida y fúngica de cada una de las cepas de
Streptomyces sp.
BACTERIA: Bacillus subtillis BACTERIA: Bacillus subtillis ATCC 6633
ATCC 6633
HONGO FILAMENTOSO: Para la determinación de la actividad antifúngica.
Aspergillus niger
 PROCESO DE LA CONJUGACIÓN BACTERIANA
Se debe aislar el ADN plasmídico en Escherichia coli empleando los antibióticos, como por ejemplo:
ampicillina 100 µg/mL, ácido nalidíxico 100 µg/mL , kanamicina 50 µg/mL, cloranfenicol 25 µg/mL y
tioestreptona, y medios de cultivo selectivos para el desarrollo de la especie bacteriana de interés, tales
como el medio MS y el LB para crecer la E. coli, el medio TSB para el aislamiento de ADN plasmídico de
Streptomyces.
Las bacterias que recibieron y transfiriendo la información reciben el nombre de Exconjugantes
bacterianos.
Los vectores plasmídicos presentan componentes fundamentales en la transferencia de la información,
tales como: tsr, resistencia a tioestreptona;ermEp*, promotor del gen regulador del gen de resistencia a
eritromicina; bla, resistencia a ampicillina; oriT, fragmento para la conjugación E. coli-Streptomyces
;

Esquema del vector conjugativo- Esquema del plasmidio conjugativo

replicativo pRET-1 recombinante pRKT-1.

 CINÉTICA DE FERMENTACIÓN EN MEDIO LIQUIDO
• Es una herramienta importante para determinar el comportamiento de la producción
de antibióticos de las cepas exconjugantes modificadas genéticamente y es un
variable cuantitativa para evaluar y seleccionar le cepa con el fenotipo de interés,
mediante el nivel de producción de biomasa y metabolitos secundarios
• en medios selectivos de crecimiento, durante las diferentes etapas de la curva de
crecimiento:
• Fase de latencia o adaptación a los nutrientes,
• fase de crecimiento exponencial en donde se obtiene la mayor biomasa de
células,
• la fase estacionaria en donde inicia un periodo de producción de metabolitos
secundarios como los de interés en el estudio, en esta fase el número de células
viables se nivela al número de células muertas, al culminar esta etapa inicia la
• fase de muerte celular o decadencia de la concentración viable.
PROCESO MEDIO DE CULTIVO
para la esporulación de las cepas de Medio SYM
estudio

Medios de producción en donde se logra el SYM líquido y II: sacarosa 2,0 %, glucosa 1
mayor porcentaje de rendimiento celular y %, extracto de levadura 0,5 %, K2 SO4 0,05
de metabolitos secundarios %, MgCl2 · 7H2 O 1,0 % a pH 7,2.

Para la conjugación medio MS,

Para crecer la E. coli, LB

el aislamiento de ADN plasmídico del TSB

microorganismo de interés.
para las pruebas microbiológicas de Agar Müeller-Hinton MHA
actividad antibacteriana
para las pruebas microbiológicas de Agar Saboraoux MSA
actividad Antifungica
 PROCEDIMIENTO DE LA PRODUCCIÓN EN MASA.
• Es necesario conocer la concentración inicial del inoculo que aprovechara la
carga nutritiva del medio de cultivo, teniendo en cuenta demás factores como la
concentración de nutrientes, condiciones de operación de la fermentación y de
los propios mecanismos intracelulares de biosíntesis.
• Se debe proponer un modelo matemático para el proceso de producción de
Antibioticos, realizando balances de masa en un sistema por lote para la
biomasa, el sustrato y el producto. Para la velocidad de crecimiento específica
se puede proponer el modelo de Contois.
• La cinetica o curva de crecimiento se logra si se tienen en cuenta parámetros de
temperatura, pH, concentración de sales (Conductividad eléctrica), nivel de
oxigeno, disponibilidad de agua, en los medios de cultivo durante el tiempo
optimo de cada etapa o fase, para esto se deben medir variables de
concentración (ufc/ml), producción metabolitos.
 Métodos para medir el crecimiento de bacterias
• métodos e para medir y monitorear los procesos de crecimiento.
• Métodos turbidimétricos: hacer incidir con una luz (monocromática con una dada
longitud de onda ) a la suspensión de microorganismos en el medio líquido. Se mide la
luz transmitida a través de la suspensión, la que es proporcional a la concentración de
biomasa. Presenta inconveniente en distinguir entre células vivas o muertas o entre
células y otro tipo de material particulado.
• El conteo de colonias. se utiliza un medio de agar conteniendo los nutrientes para lograr
el crecimiento de las bacterias, se realizan diluciones seriadas de la muestra hasta
obtener una menos concentrada, ejemplo: 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4……..en la caja de petri
se forman colonias que se pueden contar como UFC (colony-forming units, CFU)..
TÉCNICA APLICADA EN PROCESAMIENTOS MICROBIOLOGICOS
DE MUESTRAS LIQUIDAS Y SOLIDAS.
ENSAYOS MICROBIOLOGICOS DE ACTIVIDAD
ANTIBIOTICA (BACTERICIDA Y FUNGICA)
Esta técnica permite medir la Actividad antibiótica y antifúngica frente
microrganismos de interés (medicina o en el control biológico), para
este es necesario realizar siembras en medio con técnicas de
enfrentamiento, antibiogramas, impregnando vehículos con el
antibiótico o sustancia de interés.
Métodos de prueba:
Método de difusión por disco y la prueba de concentración inhibitoria
mínima (CIM). Para esto es necesario interpretar los rangos de control:
resistente, intermedio y susceptible, dependiendo del diámetro de
inhibición. Se puede interpretar utilizando los escatogramas
(scatterplots).
En la siembra en el medio de cultivo se debe dejar el producto se
difunda en el medio de cultivo, dejando a la temperatura ideal si es
para bacterias y/o Hongos. Bacterias: 37oC por un periodo de 18 h a 24
h para prueba de antibiosis bacteriana, y para la prueba de
antagonismo con el hongo se lleva a incubación por una temperatura
de 26oC por un periodo de 5 días, transcurrido este tiempo, se
realizaron las mediciones del halo de inhibición.
—Escatograma
evidenciándose que las cepas modificadas
genéticamente tienen una buena actividad
antibiótica fúngica (lo esperado) y baja antibiosis
bacteriana y que el medio II resulta selectivo para
el principio activo no reportado.
Se observó un aumento significativo de la
producción de los metabolitos con actividad
antifúngica en la cepa conjugativa Streptomyces
SQF108 pRKT-1 a las 72 h, con lo que se logra
aumentar la producción mediante modificación
genética y obtención del metabolito secundario
para la extracción de los antibioticos de interés.
• Nombre del artículo: Evaluación de la capacidad de producción de antibióticos por
la cepa Streptomyces diastaticus SQF108 modificada genéticamente

• Revista que lo publica: Revista CENIC. Ciencias Biológicas.

• Año de publicación:2005

• Cita bibliográfica completa en formato APA: Rodríguez Valdés, Caridad,

• Carlos (2005). Evaluación de la capacidad de producción de antibióticos por la

cepa Streptomyces diastaticus SQF108 modificada genéticamente. Revista CENIC.
Ciencias Biológicas, 36(2),93-96.

• [fecha de Consulta 3 de noviembre de 2020]. ISSN: 0253-5688.

• Disponible en: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181220438005