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e-Gnosis

E-ISSN: 1665-5745
e-gnosis@cencar.udg.mx
Universidad de Guadalajara
Mxico

Martn del Campo M., Cstulo I.; Gmez H., Hctor E.; Alanz de la O., Ricardo
Bacterias cido lcticas con capacidad antagnica y actividad bacteriocinognica aisladas de quesos
frescos
e-Gnosis, vol. 6, 2008, pp. 1-17
Universidad de Guadalajara
Guadalajara, Mxico

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=73011197005

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2008, e-Gnosis [online] Vol. 6, Art. 5

Bacterias cido lcticas con capacidad antagnica... Martn del Campo C.I.. et. al.

BACTERIAS CIDO LCTICAS CON CAPACIDAD ANTAGNICA Y


ACTIVIDAD BACTERIOCINOGNICA AISLADAS DE QUESOS
FRESCOS.
Cstulo I. Martn del Campo M1., Hctor E. Gmez H2.Ricardo Alanz de la O.3
camarcamo@hotmail.com.mx/ hgomez@cencar.udg.mx
Recibido: septiembre 10, 2007 / Aceptado: marzo 28, 2008 / Publicado: enero 11, 2008

RESUMEN. Se aislaron 350 cepas de bacterias cido lcticas (BAL), a partir de 35 muestras de quesos frescos, fueron probadas en
contra de cuatro microorganismos patgenos, tres Gram+ (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus
pyogenes) y un Gram- (Salmonella agona). Slo 25 cepas mostraron capacidad antagnica, el mayor efecto inhibidor fue debido
al pH, por la produccin de cidos orgnicos. 8 de ellas, mostraron un efecto inhibidor diferente al pH, Todas las cepas mostraron
actividad antagnica en contra de bacterias Gram+. S. agona, no fue inhibida en su desarrollo, por ninguna de las cepas de
bacterias cido lcticas. Tres cepas que mostraron inhibicin con el sobrenadante, se trataron con enzimas proteolticas, y se
determin que el factor inhibidor es de origen proteico. 16 cepas mostraron que es necesaria la presencia de las BAL para inhibir
a los patgenos, al probar el sobrenadante libre de BAL, el efecto inhibidor no se manifest.
PALABRAS CLAVE. Antibacteriano, Pptidos, Inocuidad, Sobrenadante.

___________________________________
1-2. Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenieras, Blvd. Marcelino Garca Barragn y Calzada Olmpica, S.R.
Guadalajara, Jalisco, Mxico.
3. Carretera a Nogales, Km. 15.5. Las Agujas, Nextipac, Zapopan, Jal. www.cucba.udg.mx

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Introduccin
Las bacterias cido lcticas (BAL) estn presentes en la alimentacin del hombre desde hace mucho tiempo
y es posible encontrarlas en diferentes productos de leche fermentada como jocoque y yogurt, tambin se
encuentran en quesos frescos y madurados, en diferentes carnes y sus productos y en algunas hortalizas.
Metchnikoff, investigador del siglo XIX, relacion desde hace ms de un siglo el efecto benfico sobre la
salud humana, con el consumo de leche fermentada que contena cierto tipo de bacilos (1).
Desde hace mucho tiempo, se ha reconocido la importancia de las (BAL) como microorganismos benficos
en los alimentos y en la salud, mejora el tracto gastrointestinal de los seres humanos, evitando el desarrollo
de microorganismos patgenos capaces de producir enfermedades, por la estimulacin del sistema
inmunolgico y por consiguiente, la produccin de anticuerpos.
Con la denominacin de bacterias cido lcticas (BAL) se generaliza a un grupo de bacterias que
fermentan azcares como glucosa y lactosa para producir cido lctico. Dentro de este grupo se reconoce la
existencia de microorganismos aerobios, anaerobios y anaerobios facultativos.Los gneros representativos
de las BAL se denominan: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Bifidobacterium y Pediococcus. Con
excepcin de Bifidobacterium, todos son aerbicos (2).
Estos microorganismos se pueden clasificar adems por su metabolismo, en homofermentativos y
heterofermentativos, los primeros producen exclusivamente cido lctico, mientras que los segundos,
producen adems cido actico, etanol y dixido de carbono (2) op.cit.
La actividad antimicrobiana de las bacterias cido lcticas ha sido atribuida a la acumulacin de los
productos finales de los procesos de fermentacin, como cido lctico, dixido de carbono, perxido de
hidrgeno, etc. o a la produccin de bacteriocinas (3).
Las bacterias cido lcticas tienen una amplia aplicacin como cultivos iniciadores en una variedad de
alimentos fermentados. Los cidos orgnicos producidos, con una reduccin en el pH, se considera como el
principal agente inhibidor del crecimiento de microorganismos contaminantes en los alimentos fermentados
(4).
Las BAL se han utilizado desde hace algunas dcadas en la industria de alimentos como bioconservadores
debido a la produccin de sustancias que ejercen accin antibacteriana, que contribuyen a la prevencin de
la descomposicin de los alimentos y evitan el desarrollo de microorganismos patgenos. Otras
caractersticas deseables de las BAL, son que pueden mejorar el sabor y la textura y en algunos casos
aumentan el valor nutricional, por sus efectos sobre la digestibilidad (5), (6).
Debido a que las bacterias cido lcticas pueden ser destruidas en el tracto intestinal, son termo resistentes,
activas en pH bajos, inocuas para los consumidores y estables en los alimentos, se han utilizado como un
bioconservador natural en los alimentos (7).
Se han obtenido numerosas bacteriocinas producidas por las BAL, observando que cada una tiene espectros
de inhibicin especficos en contra de algunos microorganismos, esta particularidad se aprovecha en la
industria de los alimentos para su aplicacin en distintos procesos. En algunos casos, las bacteriocinas se
emplean para la inhibicin del crecimiento de bacterias indeseables especficas relacionadas con el
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productor de la bacteriocina; en otros casos, se aplican para inhibir el crecimiento de microorganismos


degradadores de alimentos o de patgenos, como listerias y estafilococos (8).
Las bacteriocinas poseen un gran potencial para utilizarse en sistemas de alimentos para la inhibicin
natural de microorganismos patgenos. Esta biotecnologa puede ser implementada relativamente a bajo
costo para la conservacin de una amplia variedad de alimentos (9).
El aumento en el consumo de alimentos procesados que se elaboran con conservadores qumicos, ha
originado en los consumidores una demanda por alimentos con un mnimo procesamiento y que tiendan a
ser ms naturales. Como resultado de este patrn en el consumo, existe un gran inters en la utilizacin de
agentes antimicrobianos producidos naturalmente (10).
Considerando que las bacteriocinas son protenas naturales, existe un gran inters en su aplicacin como un
mtodo alternativo para asegurar la inocuidad de alimentos refrigerados con un mnimo procesamiento,
objetivo que se ha buscado tambin empleando mtodos combinados o tecnologa de barreras (11), (12).
En la actualidad, la nisina es la nica bacteriocina aprobada por la FDA. para incluirse en alimentos, para
inhibir el crecimiento de microorganismos patgenos. Sin embargo, se han aislado otras bacteriocinas, con
potencial para utilizarse con el mismo fin.
La mayora de las bacteriocinas, tienen un espectro de accin ms bien reducido, preferentemente en contra
de bacterias Gram+. Sin embargo, algunas bacteriocinas, pueden presentar un espectro ms amplio en
contra de algunas bacterias Gram-, por lo que existe un marcado inters por estudiar ms cepas de BAL,
para encontrar stas caractersticas (13).
Las bacteriocinas se pueden definir como pptidos biolgicamente activos que tienen propiedades
bactericidas en contra de otras especies que pueden estar estrechamente relacionadas con las cepas
productoras. No obstante, este concepto se ha visto modificado, debido a que se han encontrado efectos
bactericidas en contra de microorganismos distanciados filognicamente de las cepas de BAL productoras
de bacteriocinas (14).
Las bacteriocinas se han clasificado considerando sus propiedades bioqumicas y a sus caractersticas
genticas (15), (16), En 1996, Nes propuso la siguiente clasificacin:
Clase I. Lantibiticos: Son pptidos activos que actan sobre la membrana citoplasmtica, se caracterizan
por poseer algunos aminocidos poco frecuentes en las protenas, tales como dihidroalanina, -metillantionina y lantionina, estos se forman por una modificacin posterior a la traduccin. La transformacin es
debida a la deshidratacin de los aminocidos treonina y serina, a los que posteriormente se les adicionan
tomos de azufre, procedentes de la cistena a los dobles enlaces de los deshidroaminocidos. La nisina es
una bacteriocina tpica de esta clase (17), (18).
Clase II. No lantibiticos. Son bacteriocinas que se caracterizan por contener aminocidos que se
encuentran regularmente en las protenas, pueden ser de peso molecular variable, en este grupo se han
identificado tres subclases (19), (20) y (21).
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Subclase IIa. Son pptidos que actan en contra de Listeria, comparten la secuencia en la regin N-terminal
TGNGVXC son caractersticos de este grupo la sakacina P y la pediocina PA-1 (22).
Subclase IIb: Son pptidos que forman poros en la membrana citoplasmtica, consisten de dos pptidos
diferentes. Los dos pptidos son necesarios para una efectiva actividad antimicrobiana. En este grupo se han
caracterizado a la lactococcina G y las plantaricinas EF y JK.
Subclase IIc: Son pptidos pequeos no modificados, presentan termoestabilidad, son transportados por
medio de pptidos lder. En esta subclase nicamente se han reportado a las bacteriocinas, divergicina A y
acidocina B (23).
Clase III.- Las bacteriocinas caracterizadas en esta categora son, la acidofilicina A, las lacticinas A y B y
las helveticinas J y V. Su peso molecular es mayor de 30 kDa.
Tabla 6. Clases de bacteriocinas representativas de diferentes bacterias cido lcticas.
Bacteriocina
Clase Microorganismo productor
Nisina

Pediocina PA-1

IIa

Sakacina P

IIa

Lactococcus lactis subsp lactis


Pediococcus acidilactici y Lactobacillus
plantarum WHE92
Lactobacillus sake LTH673

Plantaricina E/F

IIb

Lactobacillus plantarum C11

Lactococcina G

IIb

Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4

Divergicina

IIc

Carnobacterium divergens LV13

Helveticina

III

Lactobacillus helveticus

La Tabla 6 presenta algunas bacteriocinas representativas de cada una de las clases y subclases en que han
sido identificadas de acuerdo a sus propiedades, tambin se presentan los microorganismos de los que se
han aislado las diferentes bacteriocinas.
Ennhar y col. (1996), (24) aislaron 1962 cepas de 362 muestras, de queso Munster (francs). Estas cepas
mostraron efectos antagnicos en contra de L. monocytogenes; en la mayora de los casos, el efecto
antagnico fue debido a la disminucin en el pH, por la produccin de cidos orgnicos. Los autores
sealaron que slo seis de los sobrenadantes de cultivos, (tres Lactobacillus, dos Enterococcus y un
Lactobacillus) presentaron actividad en contra de L. monocytogenes por la accin de sustancias
antibacterianas diferentes a los cidos orgnicos. El extracto del cultivo de Lactobacillus fue seleccionado
por mostrar una mayor actividad antagnica (Au/ml Unidad Arbitraria de actividad con 17,017
unidades/ml). La capacidad antagnica del extracto no fue inactivado en presencia de catalasa, excluyendo
que la inhibicin fuera producida por la presencia de perxido de hidrgeno; sin embargo, el extracto fue
inactivado por las enzimas proteolticas pepsina, tripsina, alfa quimiotripsina, determinando que la sustancia
inhibidora es de naturaleza proteica y no fue inactivada en presencia de alfa amilasa y lipasa, determinando
que la inhibicin no se debe a la accin de carbohidratos o lpidos. El sobrenadante se prob en contra de
diferentes bacterias Gram+ (Lactobacillus sp, Enterococcus sp, Micrococcus sp, Staphylococcus sp y
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Bacillus sp) y Gram- (Salmonella sp, Pseudomona sp, y E. coli), inhibiendo el crecimiento de las Gram+ y
no a las Gram-. Ennhar y col. (1996) (24) reportaron adems, que la bacteriocina aislada corresponde a la
pediocina AcH, producida originalmente por P. acidolactici H, sealando que es el primer caso en que una
bacteriocina se produce naturalmente por bacterias de diferente gnero.
Carrasco y col. (2002) (2) op. cit. aislaron 27 cepas de BAL a partir de quesos artesanales y comerciales de
Argentina, probando su actividad antimicrobiana. Slo nueve cepas, presentaron actividad en contra de
contra bacterias indicadoras Gram+ y Gram- que deterioran la leche, el queso y otros alimentos. Los autores
seleccionaron nicamente tres cepas por presentar una mayor inhibicin en contra de las bacterias
indicadoras tanto Gram+ como Gram-. La sustancia inhibidora en el sobrenadante libre de BAL, fue
destruida por la accin de las enzimas tripsina, pronasa E, pepsina y papana, con una concentracin en el
sobrenadante de 0.5 l/ml, indicando la naturaleza proteica del compuesto activo.
Ennhar y col. (1998) (25) investigaron la efectividad de Lactobacillus plantarum WHE 92, productor de la
bacteriocina denominada pediocina AcH, en contra de Listeria monocytogenes 4d. La cepa de BAL fue
aislada de muestras de quesos, lo que sugiri que la cepa no afecta el proceso de maduracin; as como
tampoco altera las caractersticas sensoriales del alimento. Una suspensin de la bacteria lctica (1 X 105
ufc.) fue rociada sobre la superficie del queso previamente inoculado con el patgeno (menos de 50 ufc/g)
inhibiendo su desarrollo despus de 21 das.
Wan y col. (1997) (26) observaron los efectos de la pisicolina 126, una bacteriocina producida por
Carnobacterium pisicola JG 126, en contra del patgeno Listeria monocytogenes en la fabricacin de
quesos camembert. Utilizando leche pasteurizada, realizaron la inoculacin del patgeno (1X102 ufc ml-1)
posteriormente se agreg la pisicolina 126 en una concentracin de 2048 AU ml-1, reportaron que la
viabilidad del patgeno disminuy en 3-4 log en comparacin con los que no se agreg la bacteriocina; sin
embargo, reportaron la recuperacin de L. monocytogenes despus de 21 y 47 das posteriores a la
elaboracin del queso, debido a la posible resistencia de L. monocytogenes a la bacteriocina.
Mc Auliffe y col. (1999) (27) aplicaron lacticina 3147 producida por la cepa de Lactococcus lactis DPC
3147, como cultivo iniciador en la elaboracin de queso tipo cotagge. El microorganismo indicador de la
actividad bacteriocinognica, fue Listeria monocytogenes Scott A. La lacticina 3147 es una bacteriocina
activa en contra de microorganismos patgenos Gram+ como Listeria, Staphylococcus y Streptococcus, la
bacteriocina es activa en un amplio rango de pH, es termoestable, particularmente a pH bajos. La eficacia
del lctico redujo hasta en 99% el nmero de Listeria monocytogenes inoculada en un periodo de cinco das
y almacenada a 4 C.
En otra investigacin, Laukov and Czikkov. (1999) (28) estudiaron el efecto de la enterocina CCM 4231,
caracterizada como una sustancia termoestable, hidrofbica con un amplio espectro de accin en contra de
microorganismos Gram+ y Gram-, producida por la cepa de Enterococcus faecium CCM 4231. El efecto de
la enterocina CCM 4231, se investig en leche de soya en polvo contaminada experimentalmente con
Listeria monocytogenes Ohio y Staphylococcus aureus SA1. Enterococcus faecium mostr buen
crecimiento en la leche de soya en polvo y posteriormente la produccin de enterocina. Reportan que L.
monocytogenes fue inhibida completamente despus de 24 horas de cultivo en la muestra experimental, en
tanto que S. aureus tuvo un comportamiento diferente; a las seis horas, se observ su menor desarrollo, a las
24 horas mostr un ligero aumento, concluyendo que, en contra de L monocytogenes la enterocina 4231
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actu como un agente bactericida; en tanto que, en contra de S. aureus el efecto fue bacteriosttico. Sealan
adems, que la adicin de la enterocina CCM 4231, no tuvo influencia sobre el pH. Los resultados de este
trabajo indican que las enterocinas pueden ser ampliamente aplicadas en la industria de los alimentos como
agentes para aumentar su seguridad higinica. Se seala tambin, que actualmente el nico problema para su
aplicacin en alimentos, es legislativo.

Objetivo General
Aislar bacterias cido lcticas y determinar su accin antagnica en contra de patgenos indicadores
seleccionados para este trabajo.

Objetivos Especficos
1.- Aislar bacterias cido lcticas a partir de quesos frescos de la zona metropolitana de Guadalajara
(tomando muestras de mercados, centros de acopio y distribucin de productos lcteos).
2.-Determinar la capacidad antagnica de las cepas de bacterias lcticas aisladas, en contra de los patgenos
Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus hemoltico del grupo A y Salmonella
agona.
3.-Determinar los mecanismos antagnicos de las bacterias lcticas en contra de los patgenos, incluyendo
su capacidad bacteriocinognica.

MATERIALES Y MTODOS
AISLAMIENTO DE BACTERIAS CIDO LCTICAS
Las bacterias cido lcticas (BAL), fueron aisladas a partir de muestras de quesos frescos que se expenden
en los mercados de la zona metropolitana de Guadalajara, incluyendo los municipios conurbanos de
Zapopan, Tlaquepaque y Tonal.
Se determinaron los diferentes mecanismos antagnicos propios de las bacterias cido lcticas, como pH,
produccin de perxido de hidrgeno y la produccin de bacteriocinas.
El aislamiento de las BAL se realiz de 35 muestras de quesos frescos, 14 de adobera, 11 de panela, 6 de
queso tipo ranchero y 4 de queso fresco, se pesaron 10 gramos de cada una colocndolas en bolsa para
stomacher y se aadieron 90 ml. de diluyente de peptona para su homogenizacin. Se tom 1 ml del
homogenizado, y se aadi consecutivamente a tubos conteniendo 9 ml de diluyente de peptona, hasta
alcanzar las diluciones 5, 6 y 7.
De cada una de las tres diluciones seleccionadas, se tom un ml y se sembraron por la tcnica de
inoculacin por superficie y extensin con varilla de vidrio en medio Actidiona-Polimixina-Nitrito (APN
normal) (29) y se incubaron a 30 C durante 48 a 72 horas. Despus de este tiempo, se realiz el recuento de
unidades formadoras de colonias (ufc).

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Se seleccionaron 10 diferentes colonias aisladas en el medio de APN, considerando algunas caractersticas


de las colonias como tamao, color forma, etc. sembrndose en placas de APN cc (conservacin de
colonias) (29) op. cit. Al desarrollo de las cepas se someti a las pruebas de Gram, catalasa y movilidad
confirmando su pertenencia al grupo de estos gneros. Las BAL son bacterias Gram positivas, catalasa
negativas y son inmviles.
Se seleccionaron cuatro microorganismos patgenos, que son reconocidos como causantes de enfermedades
transmitidas por alimentos (ETAs), Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella agona y
Streptococcus hemoltico del grupo A. y fueron utilizados como indicadores de actividad antagnica de las
BAL,

Determinacin de la capacidad antagnica de las BAL en contra de los patgenos.


La conservacin de los microorganismos patgenos, se realiz en tubos en el medio de Agar Soya Tripticasa
(AST), para las cepas de Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Salmonella agona. El
Streptococcus hemoltico del grupo A, se conserv en agar sangre (ASTs). Tambin se utilizaron placas de
agar para la resiembra de los patgenos, asegurando que no existiera contaminacin con otras cepas.
Cada uno de los microorganismos patgenos se inocularon en el medio APN mb en una concentracin
aproximada de 1 X 105 ufc/ml, en tubos conteniendo 14 ml del medio, se vaciaron en placas y se dej
solidificar.
La determinacin de la actividad antagnica de las BAL en contra de los patgenos utilizados como
indicadores, se realiz con la tcnica de inoculacin por picadura reportada por Galliano y Hinsdill (1970)
(30), en medio APN mb (modificado blando) (29) op. cit. Se consider como actividad antagnica positiva
la observacin de un halo de inhibicin de 1 mm mayor alrededor de la picadura de las cepas de BAL.
Las cepas de BAL que presentaron actividad antagnica, se conservaron en el medio de APN cc
(conservacin de colonias) y en tubos de agar MRS.

Determinacin de los mecanismos antagnicos de cultivos de BAL en contra de los


patgenos.
La determinacin de los mecanismos antagnicos de las cepas de BAL, se inici con los cultivos de cada
cepa de 24 horas en medio de agar MRS, posteriormente se inocularon en caldo MRS y se incubaron por 24
horas.
Los caldos se centrifugaron a 12,000 RPM. durante 30 minutos, el sobrenadante se extrajo con pipeta
Pasteur cuidando de no tocar el paquete celular y colocndolo en un vaso de precipitado.
Por cada una de las cepa, se utilizaron ocho microtubos, el primero, se tom directamente del vaso de
precipitado esterilizndolo por filtracin e identificndose como sobrenadante sin tratamiento (ST), al resto
del contenido, se le determin el pH y se ajust a pH 6.5 para todos los sobrenadantes, con una solucin de
NaOH 1M, y fueron expuestos por 30 minutos a una solucin de catalasa (Sigma Chemical, C-100) con 500
u/ml del sobrenadante a 25 C, llenando siete microtubos por cada cepa y esterilizando por filtracin, el
resto del sobrenadante, se coloc en tubos estriles para su conservacin en congelacin.
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Los patgenos se sembraron en AST Y ASTs, incubndose por 24 horas, estos cultivos nuevos se
resembraron en caldo BHI en cultivos de 24 horas para la inoculacin del medio APN mb.
El medio APN mb se inocul con cada uno de los patgenos con una concentracin aproximada de 1 X 105
ufc/ml y se dej solidificar en placas. La tcnica utilizada, fue la de la gota sobre la superficie (spot-onlawn), que consiste en aplicar cinco microlitros del sobrenadante de los cultivos de BAL sobre la superficie
seca del medio semislido. Al medio de APN mb, previamente inoculado con cada una de las cepas
indicadoras, se le aplic una gota del sobrenadante de las BAL realizando tres divisiones en las placas e
identificndolas como control (1), pH ajustado (2) y catalasa (3), incubndose a 30 C por 24 horas,
finalmente se busc la presencia de halos de inhibicin en las reas de aplicacin del sobrenadante.

Determinacin de la capacidad bacteriocinognica de cultivos de BAL en contra de los


patgenos.
Despus de seleccionar las cepas que presentaron inhibicin en contra de los patgenos indicadores,
posterior al ajuste del pH, y a la exposicin de catalasa, se repiti el procedimiento para obtener el
sobrenadante libre de BAL, utilizndose con pH original, pH ajustado a 6.5 en estos se expusieron durante
una hora a 37 C, a la accin de las enzimas alfa quimiotripsina (pncreas de bovino, tipo II; Sigma
Chemical, C-4119), Proteinasa K (fngica, GIBCO, BRL, 25530-015) y proteasa (Streptomices griseus,
Sigma Chemical P-5147), en forma individual, a una concentracin final de 0.1 mg/ml del sobrenadante.
Todos los sobrenadantes se esterilizaron por filtracin, repitiendo la tcnica de spot-on lawn (Gratia, 1946)
(31), aplicando cinco microlitros sobre las placas, previamente inoculadas con las cepas indicadoras y se
incubaron a 30 C durante 24 horas, por ltimo se observaron las placas para encontrar zonas de inhibicin.

Resultados
Los resultados experimentales se muestran en el orden en que fueron obtenidos, iniciando con el tipo de
muestra, su identificacin, los recuentos de ufc/ml y la actividad antagnica en contra de los patgenos
utilizados como indicadores. Asimismo, se describen los factores responsables de la actividad antagnica y
de la capacidad bacteriocinognica.
De las 35 muestras de cuatro tipos de quesos frescos, los recuentos de ufc/ml, presentaron valores de 5.3 X
106 como el valor ms bajo, correspondiente a la muestra nmero 13 de queso adobera y el valor ms alto,
se obtuvo en la muestra nmero 2 de panela con 6.1 X 108, los dems valores se encuentran dentro de estos
lmites (Tabla1).
Tabla 1. Muestra de quesos y aislamiento de bacterias cido-lcticas con sus recuentos ufc/ml.
Adobera
No de m.* ufc**
1
8.4107
7
9.3107
9
1.5108
12
6.0107
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Panela
No de m.
ufc
2
6.1108
3
1.1107
8
1.1108
11
3.8107
- 8/17 -

Ranchero
No de m.
ufc
4
1.3107
6
2.8108
10
2.8108
15
1.0108

Fresco
No de m.
ufc
5
1.8107
23
1.3107
27
2.0108
33
1.1108
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13
5.3106
14
1.1108
18
2.6x107
17
1.3107
16
2.4108
24
2.2107
8
7
19
3.110
22
1.310
7
20
9.010
26
1.6108
21
1.7108
30
3.6107
8
25
1.310
31
7.5107
28
1.7108
34
1.6108
7
29
3.410
32
7.5107
35
1.3108
14 quesos
11 quesos
6 quesos
4 quesos
*No. de muestra. **ufc = Unidades formadoras de colonias/ml.
De las 350 cepas de BAL, que fueron aisladas y probadas mediante la tcnica de inoculacin por
picadura, en contra de los cuatro microorganismos patgenos utilizados como indicadores: Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella agona y Streptococcus hemoltico del grupo A, slo
25 mostraron actividad antagnica en contra de alguno de los patgenos mencionados, mostrando halos de
inhibicin de 1 mm de dimetro mayores, los resultados se muestran en la Tabla 8.
Tabla 2. Inhibicin de cepas de BAL aisladas de diferentes quesos, probadas en contra de
cuatro patgenos.
Muestra

Cepas

16 panela
17 adobera

151
162
163
170
181
183
184
190
195
206
210
245
248
249
272
277
292
293
294
299
301

19 adobera

20 adobera
21 adobera
25 adobera

28 adobera
30 panela

31 panela
ISSN: 1665-5745

Listeria
monocytogenes
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- 9/17 -

Staphylococcu
s aureus
+
+
+
+
+
-

Salmonella
agona
-

Streptococcus
-hemoltico
+
+
+
+
+
+
+

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303
+
32 adobera
316
+
33 q. Fresco
324
+
329
+
TOTALES
25
19
7
+ = Con actividad antagnica. - = Sin actividad antagnica.

+
+
+
9

La cepa indicadora de Listeria monocytogenes, fue la que mostr mayor inhibicin, con un total de 19 cepas
de BAL que inhibieron su desarrollo, seguido por Streptococcus hemoltico grupo A con 9, y
Staphylococcus aureus con 7 cepas.
De las cepas probadas, ninguna mostr efectos antagnicos en contra de Salmonella agona, que fue el
microorganismo Gram-, seleccionado para el presente estudio.
Ninguna de las cepas de BAL que presentaron actividad antagnica, mostraron inhibicin en contra de tres
cuatro de los patgenos utilizados como indicadores.
Las cepas de BAL aisladas que mostraron inhibicin en contra de un slo patgeno fueron: nueve en contra
de Listeria monocytogenes; tres en contra de Streptococcus hemoltico; y dos cepas en contra de
Staphylococcus aureus.
Once cepas mostraron inhibicin en contra de dos patgenos.
Seis cepas inhibieron a Listeria monocytogenes y a Streptococcus hemoltico. Cuatro cepas, inhibieron a
Listeria monocytogenes y a Staphylococcus aureus. Una cepa, inhibi a Staphylococcus aureus y a
Streptococcus hemoltico.
Todas las cepas seleccionadas, se colocaron en tubos con medio APN cc sembradas por puncin y en placas
de agar MRS para su conservacin en refrigeracin.
La determinacin de los factores de antagonismo, se prob con los sobrenadantes libres de BAL, ajustando
el pH a 6.5, con objeto de poder excluir que la inhibicin fue debida a la produccin de cidos orgnicos, y
por la exposicin de los sobrenadantes a la accin de la enzima catalasa, para descartar que la inhibicin
fuera debida a la produccin de perxido de hidrgeno. El sobrenadante de cada una de las cepas, se coloc
en un microtubo sin ajustar el pH, utilizndose como control, al resto se le determin su pH, como se puede
apreciar en la Tabla 3.
Tabla 3. Valor del pH del sobrenadante del cultivo de las cepas de BAL antes de ajustar el pH
a 6.5 para todos los tratamientos.
Cepa
Ba-1
Ba-2
Ba-3
Ba-4
Ba-5
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pH
4.5
5.8
4.8
5.5
3.8

Cepa
Ba-10
Ba-11
Ba-12
Ba-13
Ba-14
- 10/17 -

pH
6.1
4.5
4.3
4.3
4.3

Cepa
Ba-19
Ba-20
Ba-21
Ba-22
Ba-23

pH
4.4
4.4
4.5
4.4
4.8
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Ba-6
Ba-7
Ba-8
Ba-9

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3.7
3.7
3.7
3.7

Ba-15
Ba-16
Ba-17
Ba-18

4.4
4.5
4.4
4.4

Ba-24
Ba-25

4.3
4.5

Como se puede apreciar en la Tabla 3, el pH de cada uno de los sobrenadantes obtenido a partir del cultivo
de las cepas de BAL aisladas, se encuentra entre 3.7 como el valor ms bajo, se apreci en las capas Ba-6,
Ba-7, Ba-8 y Ba-9. En tanto que, el valor ms alto de 6.1 se observ en la capa Ba-10. Los datos del pH sin
ajustar, sugieren que la acidez por s misma podra ser la causa de la inhibicin microbiana.
Los patgenos fueron inoculados en APN mb y colocados en placas de Petri para su solidificacin,
posteriormente ya solidificadas, se aplicaron cinco microlitos de los sobrenadantes. Los resultados se
muestran en la Tabla 4.
De las 25 cepas que se probaron en contra de los patgenos indicadores que exhibieron actividad
antagnica; slo se presentan las que exhibieron actividad antagnica, despus de haber ajustado el pH y
que fueron expuestos a la actividad de la enzima catalasa.
Tabla 4. Determinacin de los mecanismos antagnicos de las bacterias cido-lcticas aisladas
de quesos frescos de la zona metropolitana de Guadalajara.
CEPA
PATGENO
Listeria
monocytogenes
Staphylococcus
aureus
Streptococcus.
hemoltico

BA-1
ST1 pH2 Cat3

BA-11
ST pH Cat

BA-18
ST pH Cat

BA-19
ST pH Cat

PATGENO
Listeria

monocytogenes
Staphylococcus
+

aureus
Streptococcus.

hemoltico
1 = Sin tratamiento. 2 = pH ajustado. 3 = Catalasa.
+ = Inhibicin. + = Inhibicin parcial. = Sin inhibicin.

BA-16
ST pH Cat

BA-17
ST pH Cat
-

+
+

BA-20
ST pH Cat

BA-21
ST pH Cat

Los nmeros 1, 2 y 3, de la Tabla 4, representan los tratamientos que se hicieron de cada uno de los caldos,
el nmero 1, se aplic sin ningn tratamiento y fue utilizado como control para la determinacin del
mecanismo antagnico. El nmero 2, se refiere al ajuste del pH a 6.5 del caldo probado contra los
patgenos, y el nmero 3, muestra el comportamiento del caldo tratado con catalasa para eliminar el
perxido de hidrgeno.
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Se consider como inhibicin, cuando se observ un halo ntido de inhibicin en el lugar en donde se coloc
la gota del sobrenadante de los cultivos de las BAL sobre la superficie del medio. En la observacin al
microscopio, no se apreci ningn desarrollo de colonias de las cepas indicadoras sobre el rea tratada.
Se determin como inhibicin parcial, cuando a la observacin macroscpica, la presencia del halo fue
ntida. Sin embargo, en la observacin al microscopio, se apreci un desarrollo de colonias de las cepas
indicadoras, en menor cantidad que en el resto del medio que no recibi tratamiento, sin inhibir
completamente su desarrollo.
No se report alguna inhibicin, cuando no se encontr ningn halo en la superficie tratada y cuando las
colonias de las cepas indicadoras, no mostraron cambios en su desarrollo.
En todos los casos en donde no se apreci inhibicin en el control (No.1) en la etapa primaria de seleccin
del antagonismo, sugiere ampliamente que la presencia del lctico es necesaria para inhibir a los patgenos,
el mecanismo de accin puede ser debido a la competencia por el sustrato, en donde los lcticos,
probablemente tienen una mayor capacidad de adaptacin al medio y no permiten el desarrollo de otros
microorganismos.
Las cepas indicadoras, en todas las observaciones, fueron Listeria monocytogenes, Staphilococcus aureus y
Streptococcus hemoltico.
Las cepas BA-1, BA-20 y BA-21, presentaron inhibicin positiva por el sobrenadante, nicamente en contra
de Listeria monocytogenes, en el control, pH ajustado y en presencia de catalasa, sugiriendo que existe otro
factor inhibidor, probablemente una bacteriocina. Staphylococcus aureus y Streptococcus hemoltico, no
presentaron inhibicin en ninguno de los tratamientos.
La cepa BA-11, Present inhibicin positiva en contra de Listeria monocytogenes, en el control y pH
ajustado, mostrando que el efecto inhibidor fue debido a la produccin del perxido de hidrgeno. En las
cepas indicadoras de Staphylococcus aureus y Streptococcus grupo beta hemoltico, se observ inhibicin
positiva, slo en el control, en el pH y en presencia de catalasa, se observaron con inhibicin parcial,
indicando la probable presencia de otra sustancia responsable de la inhibicin.
Las cepas BA-16 y BA-17, mostraron un comportamiento similar, el antagonismo slo se manifest en
contra de Streptococcus grupo beta hemoltico, en el control, la cepa BA-16, present inhibicin positiva; en
tanto que en la cepa BA-17, se observ inhibicin parcial. En el ajuste de pH, y la inhibicin por perxido
de hidrgeno, en ambas cepas, fue inhibicin parcial, por lo que se considera que es posible que exista
alguna bacteriocina, que se demuestra por la persistencia de la inhibicin en contra de este patgeno.
La cepa BA-18 present inhibicin apreciable en contra de Listeria monocytogenes solamente en el
control, por lo que se considera que los mecanismos de inhibicin fueron debidos al pH y a la produccin de
perxido de hidrgeno. En el caso de Staphylococcus aureus, la inhibicin positiva se observ en el control,
en el pH ajustado la inhibicin fue apreciable, con el tratamiento de catalasa, no hubo inhibicin,
considerndose que el factor inhibidor, fue el perxido de hidrgeno. En el Streptococcus grupo beta
hemoltico, es probable la existencia de una bacteriocina, por la persistencia de la inhibicin.
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La cepa BA-19 mostr actividad antagnica positiva slo en contra de Staphylococcus aureus en el control,
en el pH ajustado y en presencia de la enzima catalasa, para inhibir al perxido de hidrgeno, la inhibicin
fue apreciable, se considera, que es probable la presencia de una bacteriocina.
De las cepas, de las que se obtuvo el sobrenadante y que mostraron una inhibicin positiva, an con el ajuste
de pH y de la accin de la catalasa sobre el perxido de hidrgeno, nicamente se seleccionaron tres, ello
debido a que presentaron una inhibicin ms definida que en las dems, correspondiendo a las cepas BA-1,
BA-20 y BA-21 en contra de L. monocytogenes. stas se probaron nuevamente, ajustando el pH y
exponiendo los sobrenadantes a la accin de enzimas proteolticas, resultando ser cepas bacteriocinognicas,
se pudo corroborar que su efecto antagnico despareci por la actividad enzimtica, al probarse en contra de
los patgenos indicadores, como se puede observar en la tabla 5.
Tabla 5. Determinacin de la naturaleza proteica de la sustancia inhibidora en los
sobrenadantes de BAL en contra de L. monocytogenes.
Cepa
Control pH
Catalasa 1
BA- 1
+
+
+
BA-20
+
+
+
BA-21
+
+
+
1= Alfa quimiotripsina; 2= Proteinasa K; 3= Proteasa

2
-

3
-

Los resultados obtenidos del presente estudio, fueron debidos al efecto del pH sobre los patgenos
indicadores, como el principal inhibidor. La actividad antagnica, provocada an por los efectos del pH
ajustado y de la enzima catalasa, permiti observar que existi una sustancia inhibidora, diferente a la
acumulacin de cido lctico, o a la presencia de perxido de hidrgeno respectivamente. Finalmente, se
demostr la presencia de las bacteriocinas al exponer el sobrenadante a la accin de las enzimas
proteolticas, manifestndose por la desaparicin de la actividad antagnica.

DISCUSIN
Las BAL se han utilizado en la alimentacin desde hace mucho tiempo, es posible encontrarlas en diferentes
alimentos, en la leche y sus derivados como en el jocoque y yogurt, en quesos frescos y madurados;
tambin, es posible aislarlas de carnes y sus productos y en algunas hortalizas. Metchnikoff, investigador
del siglo XIX, relacion el efecto benfico sobre la salud humana, con el consumo de leche fermentada que
contena cierto tipo de bacilos (1) op. cit.
En el presente estudio, se aislaron BAL a partir de quesos frescos por considerar que es una fuente
importante por el proceso de fermentacin de estos productos, como se pudo corroborar al aislar 350 cepas
de 35 muestras de quesos.
Los factores de antagonismo probados en el presente estudio, fueron el pH, el perxido de hidrgeno y la
produccin de bacteriocinas. Se considera que la reduccin en el pH es el principal efecto inhibidor debido a
la produccin de cidos orgnicos de acuerdo a lo sealado por Carrasco y col. (2002) (4) op. cit. Los
resultados obtenidos en este trabajo, coinciden con los autores mencionados, de las 25 cepas aisladas que
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presentaron actividad antagnica, slo ocho mostraron un efecto diferente, despus de ajustar el pH en 6.5
para todos los tratamientos.
La Inhibicin de microorganismos ha sido atribuida; adems, a la acumulacin de los productos finales de
la fermentacin, como son: el cido lctico, el dixido de carbono, el perxido de hidrgeno y a la
produccin de bacteriocinas de acuerdo a lo sealado por Lindgren y Dobrogoz (1990) (3) op. cit. Los
resultados de este trabajo muestran que despus de exponer los sobrenadantes a la enzima catalasa para
inhibir el perxido de hidrgeno, permiti su identificacin como la causa de inhibicin de los
microorganismos indicadores, encontrando slo tres de los sobrenadantes de las cepas de BAL que
continuaron mostrando actividad antagnica despus de ajustar el pH y exponer los sobrenadantes a la
accin de la catalasa, sugiriendo ampliamente la presencia de otras sustancias responsables de la inhibicin,
posiblemente bacteriocinas, las cuales fueron identificadas posteriormente al exponer los sobrenadantes a la
accin de enzimas proteolticas.
De acuerdo a los resultados observados, la actividad antagnica de las BAL, se manifest en contra de las
bacterias Gram+ Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Streptococcus grupo beta hemoltico, el
microorganismo Gram- fue Salmonella agona, no se observ inhibicin en su desarrollo, en donde se pudo
corroborar que las BAL actan preferentemente en contra de bacterias Gram+, como afirma Klaenhamer
(1998) (13) op. cit.
Tambin se encontr, que la presencia de las BAL es necesaria para inhibir a los patgenos indicadores en
este estudio, al probar los sobrenadantes libres de BAL, el efecto antagnico no se manifest, este efecto se
puede atribuir a la capacidad de las BAL para adaptarse al medio y/o a la presencia de dixido de carbono,
no permitiendo el desarrollo de otros microorganismos, como lo sealan Lindgren y Dobrogoz (1990) (3)
op. cit.
Las perspectivas para la aplicacin de las BAL o de la produccin de bacteriocinas en la industria de los
alimentos son prometedoras, debido al inters de utilizar conservadores biolgicos como lo demandan los
consumidores y por el inters de los industriales de emplear estas sustancias como una biotecnologa
relativamente econmica, factible de aplicarse a diversos alimentos que requieren de procesos de
fermentacin, al reconocer que es necesario apoyar ms investigaciones para superar los problemas de tipo
legal, para su aplicacin.
Ennhar y col. (1996), (24) op. cit. aislaron 1962 cepas de BAL a partir de 362 muestras de queso tipo
Munster, El sobrenadante se prob en contra de diferentes bacterias Gram+ (Listeria monocytogenes,
Lactobacillus sp, Enterococcus sp, Micrococcus sp, Staphylococcus sp y Bacillus sp) y Gram- (Salmonella
sp, Pseudomona sp, y E. coli), inhibiendo el crecimiento de las Gram+ y no a las Gram-.
Observando que los efectos antagnicos en contra de L. monocytogenes, en la mayora de los casos fue
debido a la disminucin en el pH, por la produccin de cidos orgnicos. Slo seis de los sobrenadantes de
cultivos, (tres Lactobacillus, dos Enterococcus y un Lactobacillus) presentaron actividad en contra de L.
monocytogenes por la accin de sustancias antibacterianas diferentes a los cidos orgnicos.
La capacidad antagnica del extracto no fue inactivado en presencia de catalasa, excluyendo que la
inhibicin fuera producida por la presencia de perxido de hidrgeno; sin embargo, el extracto fue
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inactivado por las enzimas proteolticas pepsina, tripsina, alfa quimiotripsina, determinando que la sustancia
inhibidora es de naturaleza proteica y no fue inactivada en presencia de alfa amilasa y lipasa, determinando
que la inhibicin no se debe a la accin de carbohidratos o lpidos.
Los resultados obtenidos en el presente estudio, son similares a los sealamientos de los obtenidos por
Ennhar y col. (1996), (24) op. cit. de las 25 cepas aisladas que mostraron actividad antagnica en contra de
los microorganismos patgenos indicadores, slo ocho mostraron inhibicin diferente al pH y a la
acumulacin de perxido de hidrgeno. Tambin en el presente estudio los sobrenadantes de las BAL,
fueron inactivados por la accin de enzimas proteolticas, lo que permite considerar que el factor inhibidor,
es de naturaleza proteica.

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