Guía de Prácticas Pinares 2022

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS ACRARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO: BIOQUÍMICA I, II

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Capacidad es lo que te permite hacer algo

Motivación es lo que determina lo que usted hace
Actitud es lo que determina cuán bien lo hace
MVZ. MSc. Ph.D(c) Rubén Pinares Huamaní

Cusco, 2022
Rubén Pinares 2022

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DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE GANADERÍA
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO:

BIOQUÍMICA I, II
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
COPYRIGHT © 2022, 1° EDICIÓN
CUSCO, PERÚ
Rubén Pinares 2022

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PRÓLOGO
La Bioquímica es una ciencia de tipo experimental que ayuda a entender los procesos
metabólicos en el organismo animal y en otros seres vivos. Esta disciplina está en
constante desarrollo. En 1903, Neuberg fue pionero al crear la primera Cátedra de
Bioquímica. La Bioquímica no solo estudia las biomoléculas sino también las relaciones
que se establecen entre sus componentes, sus transformaciones en los seres vivos y la
regulación de esos procesos. La Bioquímica ha evolucionado rápidamente en este siglo
XXI, se divide en tres ramas importantes.
a) Bioquímica estructural: estudia la composición, conformación, configuración y
estructura de las moléculas de la materia viva, relacionándolas con su función biológica.
b) Bioquímica metabólica o metabolismo: estudia las transformaciones, funciones y
reacciones químicas que sufren o llevan a cabo las moléculas de la materia viva, así como
los mecanismos de regulación de esas transformaciones.
c) Biología molecular o genética molecular: estudia la química de los procesos y las
estructuras de las moléculas implicadas en el almacenamiento, la transmisión y la
expresión de información genética, así como los mecanismos que los regulan.
En las prácticas se emplearán los equipos básicos del Laboratorios de Bioquímica y
Biología Molecular con el fin de describir las propiedades estructurales y químicas de las
macromoléculas que conforman el organismo animal, como los carbohidratos, lípidos,
proteínas y ácidos nucleicos que son responsables de los procesos metabólicos.
El contenido está directamente vinculado a los objetivos del programa de estudio, dando
énfasis en las aplicaciones biotecnológicas. Las prácticas tienen la intención de involucrar
al estudiante en la realización de técnicas de laboratorio, que permiten reforzar la
comprensión de conceptos, procesos y la investigación en Bioquímica y Biología
Molecular. La información de algunas técnicas de laboratorio en bioquímica fue
sintetizada de muchas fuentes bibliográficas tanto impresas como virtuales. Por ejemplo
https://biomodel.uah.es/tecnicas/inicio.htm#elfo.
Hay dos maneras de ser feliz resolver el ADN o conseguir una novia (Watson, 2016).
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MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO
Objetivo: conocer los materiales de vidrio y los equipo usados en el laboratorio.
Equipos: Equipo de electroforesis
Balanzas Analíticas Microscopios
Centrífugas Estufas
Termocicladores
Materiales de vidrio:
Tubo de ensayo Matraz Erlenmeyer
Probeta Matraz volumétrico
Vaso precipitado Pipeta graduada
Reactivos:
TAE, agarosa, glucosa, dextrosa, fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina, amilasa, amilasa
pancreática, glutamato, glutamina, glicerol, hemoglobina, lactato deshidrogenasa,
fósforo, potasio, cloruro de sodio y aminoácidos.
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Fundamento teórico: Los laboratorios de Bioquímica son espacios cerrados que cuentan
con instrumentos, materiales o herramientas necesarias para hacer prácticas,
investigaciones, experimentos y proyectos científicos. Los materiales de laboratorio, son
el conjunto de materiales de vidrio, piezas insumos y reactivos que facilitan el estudio y
análisis de sustancias biológicas. En estos laboratorios se utilizan una amplia gama de
instrumentos como los que mencionare a continuación:
Matraz Erlenmeyer es un frasco de forma cónica que posee un cuello cilíndrico grueso
que luego va disminuyendo en forma cónica, su nombre se debe a que fue diseñado por
el científico alemán Emil Erlenmeyer en 1861. Este material es útil para mezclar
sustancias por agitación y para evaporar líquidos, su cuello permite la incorporación de
tapones que impiden salida de las mezclas.
Balón de destilación es un envase que se emplea para separar líquidos en el proceso de
destilación, es decir, el procedimiento de separación de los componentes de una mezcla.
Balón o Matraz de destilación tiene forma de balón, su base es esférica con un cuerpo
largo y cilíndrico bastante delgado, donde posee un tubo lateral descendente que sirve
para separar líquidos y hacer procesos de destilación, está diseñado para el calentamiento
uniforme de distintas sustancias.
Bureta es un recipiente bastante delgado de material de vidrio y forma alargada, su
función principal es medir el volumen de líquido con exactitud a ciertas temperaturas.
Caja de Petri (Placa Petri) es un envase redondo que cuenta con una tapa de un diámetro
mayor, lo que permite cerrar las muestras, sin dañar las muestras.
Bagueta o Varilla de agitación es un tubo cilíndrico de vidrio resistente que tiene un
diámetro de 6 mm y una longitud de 40 cm, su función es la de agitar los contenidos
manualmente con el fin de mezclarlos.
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Equipos de Laboratorio
Agitador Vortex está compuesto por un cabezal que sirve de apoyo para el tubo de
ensayo o cualquier instrumento apropiado para su uso, tiene un indicador de encendido
que se presiona para su funcionamiento y un botón que indica si el experimento debe
hacerse manual o continúo.
Balanza Analítica sirve para medir masas en rangos menores que la del miligramo,
permitiendo conocer el resultado final con exactitud.
Termociclador para PCR los actuales termocicladores son capaces de realizar rápidos
cambios de temperatura que permiten realizar los tres pasos de la reacción de PCR de
forma cíclica: desnaturalización del ADN, alineamiento o unión del cebador con la
secuencia de ADN complementaria y extensión de la cadena.
Los equipos de electroforesis separan mezclas de ADN, RNA y proteínas en base al
tamaño molecular, al aplicar una carga uniforme, las moléculas circulan por una matriz
porosa de diferentes tamaños de poro según el tamaño. Están disponibles en formato
vertical (proteínas) y horizontal (ácidos nucleicos), en una gran variedad de tamaños de
gel y de accesorios.
Las centrífugas pueden separar suspensiones o muestras biológicas, pero al requerir
una separación más fina, como por ejemplo de sustancias con peso molecular, en este
caso se pueden utilizarse las ultracentrífugas.
Espectrofotómetro es un instrumento que se utiliza en el laboratorio que tiene como
objetivo principal diagnosticar, tomando en cuenta las propiedades de la luz y la
interacción con otras sustancias. Sirve básicamente para conocer cuál es la concentración
de las sustancias en una solución y así analizar bajo el enfoque cuantitativo.
Microscopio es una de las herramientas más comunes de ver en un laboratorio de
química, tiene dos lentes ópticos graduables que permiten observar las imágenes
pequeñas que a simple vista no se pueden ver.
Estufas son comúnmente usadas para calentar y esterilizar instrumentos en el
laboratorio, pueden ser de metal o de vidrio y suelen ser expuestos a temperaturas de
180 °C durante un tiempo aproximado de dos horas.
CUESTIONARIO
¿Cuáles son los materiales de vidrio más usados?
¿Cuáles son los equipos usados en Genética Molecular?
¿Cuáles son los equipos usados en Bioquímica sanguínea?
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MÉTODO DE DESPIGMENTACIÓN QUÍMICA DE FIBRA NEGRA Y
MARRÓN OSCURO Y ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA MEDULAR
Objetivos: eliminar químicamente los pigmentos de eumelanina y feomelanina de la
fibra de color de animales y analizar microscópicamente los componentes de la fibra.
Materiales y Reactivos:
Fibra negra Crema oxigenada de 20, 30 y 40 vol
Fibra marrón oscuro Polvo decolorante de 7 y 9 tonos
Fibra marrón claro
Fibra blanca
Papel aluminio
Guantes quirúrgicos
Vaso precipitado y bagueta
Porta y cubreobjetos
Aceite de inmersión
Papel toalla
Guillette hoja
Figura 1. Polvo decolorante de 7 y 9 tonos.
Figura 2. Fibra decoloreada y teñida. Adaptado de Wang et al. (2003).
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Fundamento teórico: la pigmentación de la fibra negra se produce por la presencia de
los gránulos de eumelanina y en fibra marrón por la presencia de feomelanina. Estos
pigmentos naturales son sintetizados químicamente a partir del aminoácido tirosina,
específicamente este proceso bioquímico se denomina metalogénesis a nivel de los
melanocitos que están localizados en la capa basal de la epidermis y en el bulbo piloso.
En esta práctica se usará el peróxido de hidrógeno (H2O2) en crema y el polvo decolorante
para la decoloración o despigmentación de fibras oscuras (negro y marrón).
El H2O2 tiene que penetrar la cutícula de la fibra, de esta forma llega hasta la parte interna
de la fibra (corteza), así se eliminan los gránulos de pigmento de melanina. Durante la
reacción de oxidación, el H2O2 se convierte en perhidroxilo (H2O-), que es responsable
del blanqueo (Liu et al., 2003; Harizi et al., 2013). Los compuestos químicos generados
a partir de estas reacciones podrían dañar las propiedades mecánicas y textiles de la fibra.
Figura 3. Alpaca negra y negro intenso con pigmentación eumelánica.
Figura 4. Estructura interna de fibra de alpaca marrón oscuro y distribución de gránulos

de pigmento. Adaptado de Wang et al. (2005).
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El análisis microscópico de fibras meduladas se realizará en el Laboratorio de Fibras
Textiles de Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
Por cada muestra de fibra se evaluará 600 fibras registrando el diámetro y el tipo de
médula: fragmentada, discontinua, continua y fuertemente medulada, usando el
microscopio de proyección según la norma IWTO-8-2011 (IWTO, 2011).
Figura 5. La estructura de fibra aclarada se observa al microscopio.
Figura 6. Análisis de fibras meduladas usando el microscopio de proyección.

CUESTIONARIO
¿Cuál es la concentración óptima del peróxido de hidrógeno, cuál es el tiempo y
temperatura adecuada para la despigmentación de fibra negra?.
¿Cuál es la concentración óptima del peróxido de hidrógeno, cuál es el tiempo y
temperatura adecuada para la despigmentación de fibra marrón oscuro?.
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MANEJO DE MICROPIPETAS
Objetivos: identificar las partes que componen las micropipetas y aprender a usar de
manera adecuada las micropipetas.
Materiales y Reactivos:
Tipos de micropipetas (10, 20, 100 y 1000)
Tipos de tips (puntas)
Agua destilada
Soluciones químicas
Fundamento teórico: las micropipetas son dispositivos que se caracterizan por carecer
de depósito y que se utilizan para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de
un recipiente a otro con gran exactitud, permiten medir volúmenes pequeños que van
desde 0.1 μL y comúnmente hasta 1 mL. Hoy en día existen una gran cantidad de
compañías y modelos similares que funcionan bajo un mismo principio de pistones. Por
lo anterior, es importante consultar las instrucciones del fabricante sobre el empleo
correcto de cada modelo. Una característica común a todas es que utilizan puntas
descartables plásticas que se ajustan al extremo de cada modelo de micropipeta. En estas
puntas de plástico es donde se deposita el líquido a medir.
Figura 1. Descripción de las partes de la pipeta monocanal.
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Figura 2. Mantenimiento y desmontaje de la pipeta monocanal.
Manejo de pipetas: ajuste el volumen y acople la(s) punta(s) de pipeta; en la selección

observe que la punta de pipeta sea la adecuada (código de color). Apriete hacia abajo el
botón de pipeteado hasta el primer punto de acción, y manténgalo presionado, sumerja
la(s) punta(s) de pipeta aprox. 2-6 mm (dependiendo del rango de volumen) dentro del
medio a pipetear. Manteniendo la pipeta en posición horizontal, deje que el botón de
pipeteado retroceda lentamente (de este modo se aspira el medio a pipetear).
Figura 3. Aspiracion de la muestra

Retire la(s) punta(s) de pipeta fuera del medio, y manténgala(s) contra la pared del
recipiente receptor. Presione lenta y gradualmente el botón de pipeteado hasta el segundo
punto de acción (carrera excesiva), para que la punta se vacíe por completo. Durante el
vertido, observe que la(s) punta(s) de pipeta no esté(n) sumergida(s) en la solución que
eventualmente ya se encuentra en el recipiente. Durante el vertido del líquido, con la(s)
punta(s) de la pipeta roce la pared del recipiente receptor una distancia de aprox. 10 mm.
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Figura 4. Vertido de la muestra

Mientras se retira la pipeta del recipiente mantenga presionado el botón de pipeteado.
Después suelte con cuidado el botón de pipeteado. Quite la(s) punta(s) de la pipeta
presionando la tecla de expulsión. Deseche la(s) punta(s) de la pipeta de forma adecuada.
Cuando no se utilice la pipeta, consérvela en posición vertical (soporte de mesa).
Figura 5. Deseche la punta.
CUESTIONARIO
¿Cuáles son los errores más frecuentes en el manejo de las micropipetas y cómo se mejora
la técnica del pipeteo?.
¿Qué marcas de micropipetas son las más comunes?
Defina la exactitud y precisión.
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DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS O CEBADORES
Objetivo: diseñar cebadores para la amplificación específica de fragmentos de ADN.
Materiales y recursos:
Sitio web Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Sitio web Primer3

https://primer3.ut.ee/
Esta práctica se realizará en el centro de cómputo. El día de la práctica se impartirá un
taller en el cual se darán a conocer los aspectos más importantes a considerar en el diseño
de oligonucleótidos.
Fundamento teórico: los oligonucleótidos son pequeñas secuencias de ADN, muy
específicas para amplificar un fragmento de ADN, a partir de los cuales el ADN
polimerasa puede iniciar una reacción de polimerización. Un buen diseño de
oligonucleótidos es de suma importancia para obtener resultados óptimos en una reacción
de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los oligonucleótidos deben cumplir con
las siguientes características.
a) Longitud: 18-25 nucleótidos.
b) Temperatura de alineamiento: entre 55 y 65°C.
c) Temperatura de melting también llamada temperatura de fusión del ADN es la
temperatura en la cual el 50% del ADN tiene sus hebras separadas (desnaturalización del
ADN). Si de uno de sus oligonucleótidos es muy baja, trate de buscar otra secuencia
cercana que tenga un mayor contenido en GC, o ampliar la longitud del oligonucleótido
para aumentar la temperatura.
d) El contenido de GC debe ser de 40 a 60%, el extremo 3’ de cada oligonucleótido debe
terminar con una C ó una G (esto promueve la unión al molde).
e) Si incluye sitios de restricción en sus oligonucleótidos, debe añadir una secuencia de 3
a 4 nucleótidos en el extremo 5’ a partir del cual corta la enzima de restricción.
f) Se debe evitar la formación de estructuras secundarias en los oligonucleótidos,
procurando tener una distribución balanceada de regiones ricas en GC y AT.
Procedimiento:
1.- Ingresar a la página del NCBI y buscar los siguientes códigos depositadas en
GenBank: EU135880, FJ502229, MW587025, MW587026 y MW587027.
2. Copiar el código o la secuencia en formato FASTA.
3.- Diseñar una pareja de oligonucleótidos sentido (5’) y antisentido (3’) para amplificar
la secuencia especifica del gen, siguiendo las especificaciones para un buen diseño de
oligonucleótidos.
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Figura 1. Input en NCBI del código depositadas en GenBank: EU135880. EU135880.1

Gen receptor 1 de melanocortina de alpaca.
Cuadro 1. Resumen de parámetros ingresados.
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Figura 2. Resultado gráfico de los pares de cebadores.
Figura 3. Resultado detallado de los pares de cebadores.
CUESTIONARIO
¿Cómo podemos diseñar los cebadores?
Aparte del Primer-BLAST ¿qué otra herramienta conoces para diseñar los cebadores?.
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REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR)
Objetivo: amplificar secuencias específicas de ADN genómico empleando la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa.
Equipos y Materiales:
 Termociclador
 Tubos pepenador
 Micropipetas automáticas
 Puntas amarillas y blancas (tips)
Soluciones y Reactivos:
 ADN molde (ADN genómico)
 dNTPs (mezcla de dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 10 mM)
 Buffer Tris-HCl (pH 8.4) 20 mM, KCl 50 mM
 Cloruro de Magnesio 50 mM
 Oligonucleótido sentido y oligonucleótido antisentido (10 pmol c/u)
 Agua bidestilada
 Taq polimerasa (enzima)
Fundamento teórico: la reacción en cadena de polimerasa (PCR) permite la
amplificación de un fragmento específico de ADN. En la PCR se simula la replicación de
ADN que ocurre en la célula (muchas veces). Para lo cual en un tubo se prepara la Master
Mix con los ingredientes necesarios, adicionando la enzima Taq polimerasa, por último,
se adicionan las muestras de ADN. La reacción comienza al calentar la mezcla de
reacción a 94°C, a esta temperatura los puentes de hidrógeno que mantienen unidas a las
dos cadenas de polinucleótidos de la doble hélice se rompen, desnaturalizando al ADN
en moléculas de cadena sencilla. Posteriormente, se baja la temperatura a 50-60°C, lo
cual permite una cierta renaturalización de las hebras de ADN y del apareamiento de los
oligonucleótidos con su secuencia complementaria. La síntesis de ADN se lleva a cabo a
72°C. El ciclo de desnaturalización, alineamiento, extensión se repite aproximadamente
30-35 ciclos. La temperatura de alineamiento empleada es de suma importancia ya que
esta afecta la especificidad de la reacción. La hibridación ADN-ADN es dependiente de
la temperatura. Si la temperatura es muy alta, no ocurre hibridación y si es muy baja puede
haber apareamientos incorrectos, permitiendo que los oligonucleótidos se unan a más de
un sitio y se amplifiquen otras regiones no deseadas.
Componentes de la Master Mix
Agua bidestilada: depende del volumen final (25 µl) y la concentración de ADN.
Vol de agua = (volumen final de reacción * número de reacciones) - (vol de buffer + vol
de MgCl2 + vol de dNTP’s + vol de primers + vol de Taq polimerasa + vol de ADN).
Solución tampón (Buffer): solución que contiene KCl que cumple la función de
estabilizar el pH. Además, el detergente ayuda a disminuir la contaminación exógena.
Para 25 µl de reacción se requiere 2.5 µl de buffer.
MgCl2: la concentración de Mg++ es una variable importante, se debe calcular el volumen
a utilizar por titulación. Si en 1 ml de solución hay 25 mM de MgCl 2, para 25 µl de
reacción se requiere 1 µl.
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Primers: cebadores o iniciadores (forward y reverse). Tener cuidado para el diseño
(temperatura de meelting, contenido de GC entre 40 y 60%).
dNTP’s: desoxirribonucleótidos trifosforilados, son sustratos que se añaden a la Master
Mix para la síntesis de la hebra de ADN.
Taq polimerasa: la Taq polimerasa viene suspendida en glicerol, el fabricante indica el
número de unidades de actividad. Mantener en congelación.
Figura 1. La Master Mix se reparte en los tubos y en cada tuvo se adiciona el ADN.
Protocolo de PCR: antes de preparar la “Master Mix” tenemos que calcular el número
de reacciones y el volumen final de la reacción. El siguiente protocolo corresponde a un
volumen final de 25 µl, para 8 reacciones de PCR (incluye 7 muestras y 1 control
negativo). Para evitar la contaminación cruzada durante la PCR se recomienda hacer en
una cabina de flujo laminar. Existe una herramienta virtual: http://virtual-pcr.ico2s.org/
Cuadro 1. Cálculo de la Master Mix en los protocolos de los genes ASIP y MC1R.
Exón 4-ASIP 1 tubo 7 tubos + (-) CDS-MC1R 1 tubo 7 tubos + (-)
ADN (µl) 5.0 5.0 ADN (µl) 6.0 6.0

H2O (µl) 13.6 108.8 H2O (µl) 12.3 98.4
Buffer (µl) 2.5 20.0
Buffer (µl) 2.5 20.0
MgCl2 [2mM] (µl) 2 16.0 MgCl2 [1.5mM] (µl) 2.5 20.0
dNTP [5mM] (µl) 1 8.0 dNTP [5mM] (µl) 1 8.0
Primer forward (µl) 0.4 3.2 Primer forward (µl) 0.31 2.5
Primer reverse (µl) 0.4 3.2 Primer reverse (µl) 0.31 2.5
Taq polimerasa (µl) 0.125 1.0 Taq polimerasa (µl) 0.125 1.0
Master Mix (µl) 20.0 20.0 Master Mix (µl) 19.0 19.0
Total (µl) 25 25 Total (µl) 25 25
En el mercado existen Master Mix comerciales, por ejemplo, amaR OnePCR™ contiene
todos los reactivos, solamente se agregan los cebadores, ADN y H2O.
https://www.genedirex.com/wp-content/uploads/2020/11/SM213-0250.pdf
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El ciclado de la PCR tiene tres etapas, desnaturalización inicial a 94°C durante 3 min,
seguido con 35 ciclos que incluye la desnaturalización durante 1 min a 94°C, alineamiento
(annealing) durante 1 min entre 55 y 61°C y la extensión durante 1 min a 72°C,
finalizando con una extensión durante 5 min a 72°C.
En los 35 ciclos el termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas,
que se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción).
1. Desnaturalización. El ADN bicatenario puede desnaturalizarse, llegando a
separarse las 2 hebras, esto se logra elevando la temperatura hasta 95oC.
2. Alineamiento (annealing). En esta etapa la temperatura desciende entre 50 y 60oC
(dependiendo de diversos parámetros como la secuencia de los primers y su
especificidad). Los primers se sitúan en extremos opuestos de una región particular e
inician el cebado, para que la Taq polimerasa, pueda iniciar la extensión.
3. Extensión. En esta etapa la temperatura sube hasta los 72°C de esta manera
favorece que la Taq polimerasa realice la extensión.
En los 35 ciclos que incluyen la desnaturalización, alineamiento y extensión, la PCR
puede producir mucha amplificación de las secuencias (amplicones). El ADN de doble
hebra se calienta para separarlo en hebras individuales. Estas se unen a dos cebadores
distintos que están dirigidos a secuencias específicas en hebras opuestas y que definen el
segmento a amplificar.
Figura 2. Programación en el termociclador
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Figura 3. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa se utiliza para amplificar

secuencias génicas específicas.
Recursos online: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
CUESTIONARIO
¿Cómo surgió la idea del PCR?
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ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Objetivo: evaluar las amplificaciones de PCR mediante electroforesis y observar las
bandas de ADN en gel de agarosa.
Equipos y Materiales:
 Cámara de Electroforesis de ADN
 Fuente de poder
 Matraces para preparar soluciones
 Balanza analítica
 Probetas para medir los volúmenes
 Micropipetas automáticas
 Puntas blancas y amarillas (tips)
 Sistema fotodocumentador de geles
Reactivos
 Agarosa en polvo
 Tampón de corrida TAE 1X
 Tampón de carga (loading buffer)
 Safe Green/Hi-SYBr Safe Gel Stain/GelRedTM (colorante)
 Marcador de peso molecular de 1.5 kb (ladder)
Fundamento teórico: la electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar
fragmentos de ADN u otras macromoléculas, como ARN y proteínas, según su tamaño y
carga. Las moléculas de ADN tienen carga negativa, cuando se someten a un campo
eléctrico migran hacia el polo positivo. La tasa de migración de una molécula depende de
dos factores: de su forma y de su relación masa/carga. La electroforesis en geles
preparados con agarosa, poliacrilamida o una mezcla de ambos, genera una red compleja
de poros a través de los cuales las moléculas de ADN deben migrar en su tránsito al polo
positivo. Las moléculas de ADN más pequeñas migraran más rápido a través del gel. Por
lo tanto, la electroforesis en gel separa las moléculas según el peso molecular.
Figura 1. Esquema del equipo de electroforesis.
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La electroforesis en gel de agarosa es un método simple y rápido para la separación,
identificación y purificación de fragmentos de ADN. Los factores que afectan la
migración del ADN son:
Tamaño del ADN: En el campo eléctrico (electroforesis) la migración de los fragmentos
es inversamente proporcional a su peso molecular (fragmento grande migra más lento).
Concentración de la agarosa: La migración depende del tamaño de poro formado por la
agarosa, la cual depende de la concentración de agarosa. Existe una relación lineal entre
el logaritmo y la movilidad electroforética del ADN y la concentración del gel, descrita a
través de fórmulas matemáticas (Cariaga-Martínez y Zapata, 2007). Así a medida que
aumentamos la concentración de agarosa permitimos la separación de fragmentos más
pequeños de ADN.
Voltaje aplicado: Las moléculas de ADN expuestas al campo eléctrico migran hacia el
ánodo (polo positivo) debido a la carga negativa aportada por los grupos fosfato del
esqueleto molecular. La velocidad de migración está limitada por la fuerza de fricción
impuesta por la matriz del gel.
Presencia de colorantes: El GelRedTM se intercala entre las bases a los ácidos nucleicos
pudiendo ser así visualizados los mismos a la luz ultravioleta.
Composición de la solución tampón (buffer) de corrida electroforética: La movilidad
electroforética del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de
electroforesis.
El protocolo de electroforesis del ADN en gel de agarosa consta de cuatro etapas. María
Pérez de Castro de la Universidad Politécnica de Valencia explica esta metodología,
disponible en el siguiente enlace: https://youtu.be/U1g2qt3juZw
A) Se prepara un gel de agarosa de 1.5% de concentración: Para un gel pequeño
se pesa 0.3g de agarosa y se disuelve en 75 ml de solvente buffer de corrida concentrado
(1X), usando microondas se logra homogenizar la solución. Luego se vierte la solución
en una cama donde está puesto el peine.
Figura 2. La solución bien homogeniza se vierte en la cama donde está puesto el peine.
Una vez solidificado el gel, se debe colocar el soporte en la cuba, llenar la cuba con buffer
de corrida sumergiendo al gel, y proceder a retirar los peines.
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B) Preparación de las muestras: La muestra debe ser mezclada con un buffer de
carga (loading buffer), el cual cumple con 3 funciones:
 Aumenta la densidad de la muestra.
 Asegura que el ADN se deposite directamente en el pocillo.
 Otorga color a la muestra, que se ha utilizado como frente de corrida.
Para el frente de corrida se utilizan distintos colorantes, siendo el más común el azul de
bromofenol. En general se conoce la tasa de migración de los colorantes, asegurando una
distancia prudencial con la muestra.
Otro colorante utilizado es el xileno-cianol. El esquema de abajo muestra la siembra de
las muestras que incluye un control positivo para la corrida electroforética.
Una composición para el buffer de carga muy económica, sencilla y comúnmente
utilizada es la siguiente proporción: Buffer de carga: Glicerol 60%; EDTA 0,01 M; SDS
1%; Azul de bromofenol 0,1%
Figura 3. El producto de PCR (4 µl) y el buffer de carga (2 µl) suman 6 µl.

C) Corrida electroforética: Luego de conectar la fuente de poder a la cuba, si esta
conexión es correcta podremos observar la formación de burbujas en los electrodos y en
unos minutos el azul de bromofenol (que constituye la mayoría de bufferes de carga)
comenzará a migrar desde el pocillo.
La electroforesis se lleva a cabo hasta que el frente haya migrado una distancia apropiada
a lo largo del gel, que dependerá del tipo de muestra aplicada y de la experiencia y criterio
del operador. Se recomienda una corrida a un voltaje apropiado entre 45 y 60 minutos.
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Figura 4. Equipo de electroforesis horizontal donde las muestras migrarán hacia el ánodo
(polo positivo). La electroforesis se corre hasta que los s de corrida se separen bien.
Las bandas de ADN son analizadas en un sistema de fotodocumentación: Las bandas
sintetizadas del ADN se evalúan en luz UV con el transluninador Gel DocTM (Quantity
one) o bajo en luz azul con cámara integrada RunDOC.
Figura 5. Sistema de documentación en gel con el transluninador Gel DocTM (izquierda)

y con cámara integrada RunDOC (derecha).
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En las siguientes figuras se observan las corridas electroforéticas de buena calidad,
siguiendo la metodología propuesta:
Figura 6. Las bandas corresponden al gen MC1R, ordenadas numéricamente de 1 a 7 y

los 2 controles negativo y positivo (8=marcador del peso molecular).
Las bandas corresponden al gen MC1R, ordenadas numéricamente de 1 a 7, en el segundo
grupo son más intensas, porque en este grupo se aplicó el doble de la concentración de
magnesio (las bandas son más intensas). En ambos grupos se depositaron 6 µl de muestra.
Figura 7. Las bandas de buena calidad, gen ASIP Exón 4, se observa las delesiones
homocigotas y heterocigotas de 57pb. D = deleción, I = inserción.
CUESTIONARIO
¿Cómo se inició la aplicación de PCR?
Describa los tipos de PCR.
Rubén Pinares 2022

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MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER Y APLICACIÓN
BIOINFORMÁTICA
Objetivos: entender el secuenciamiento del ADN y la aplicación bioinformática.
Fundamento teórico: en la determinación de secuencias de nucleótidos de un fragmento
de ADN (secuenciación) se corren, cuatro reacciones (una para cada nucleótido A, C, G
y T) de polimerización controladas y la posterior electroforesis de cada reacción, como
se observa en el esquema de abajo.
Figura 1. Esquema de la secuenciación de ADN.

Las matrices en forma de escalera representan, de abajo hacia arriba, todos los fragmentos
sucesivamente más largos de la hebra de ADN original (Figura 2). Sabiendo qué reacción
de didesoxinucleótido específica se realizó para producir cada mezcla de fragmentos, se
puede determinar la secuencia de nucleótidos desde el extremo no marcado hacia el
extremo marcado (*) leyendo el gel. Las reglas de emparejamiento de bases de Watson y
Crick (A-T, G-C) dictan la secuencia de la otra hebra (complementaria). Los asteriscos
indican el sitio del radiomarcaje.
Se muestra de manera esquemática (izquierda, en el medio) los productos de síntesis
terminados de un fragmento hipotético de ADN, la secuencia enumerada (centro, parte
superior). Autorradiograma (derecha) de un conjunto real de reacciones de secuenciación
de ADN que utiliza los cuatro didesoxinucleótidos marcados con 32P indicados en la parte
superior del autorradiograma escaneado (es decir, didesoxy (dd) G, ddA, ddT, ddC). La
electroforesis fue de arriba hacia abajo. La secuencia de ADN deducida se enumera en el
lado derecho del gel. Tenga en cuenta la relación log-lineal entre la distancia de migración
(es decir, de arriba a abajo del gel) y la longitud del fragmento de ADN. Los
secuenciadores de ADN de última generación ya no utilizan la electroforesis en gel para
el fraccionamiento de productos de síntesis marcados. Además, en la mayoría de las
plataformas de secuenciación de NGS, la síntesis es seguida por la incorporación de
monitoreo de los cuatro dXTP marcados con fluorescencia.
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Figura 2. Secuenciación de ADN, método de terminación de cadena ideado por Sanger.
Figura 3. Reporte en formato pdf del servicio de secuenciamiento del exón 4 gen ASIP.
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Herramientas usadas para el alineamiento de secuencias
Las secuencias biológicas a menudo se agrupan en familias. Los genes relacionados de
un organismo (parálogos), los genes relacionados de distintas especies (ortólogos) y las
secuencias dentro de una población (variantes polimórficas). A continuación, se
mencionan las herramientas computacionales que fueron usadas:
Los electroferogramas fueron ensamblados obteniéndose las secuencias alineadas, los
SNPs se identificaron en los electroferogramas mediante el programa Geneious v.11.1.5.
Figura 4. Alineamiento de electroferogramas del gen MC1R usando Geneious.
Figura 5. Alineamiento de secuencias de nucleótidos usando el programa MEGA.
Figura 6. Análisis y alineamiento de secuencias de aminoácidos con el programa MEGA.

El alineamiento múltiple es la colección de tres o más secuencias de aminoácidos o
nucleótidos. Las herramientas computacionales, a través de estos softwares facilitan
comparar simultáneamente múltiples secuencias. El programa de alineamiento de
ClustalW está basado en el método progresivo. http://www.ebi.ac.uk/clustsalw
Para comparar las secuencias de nucleótidos con las bases de datos de secuencias
depositadas en GenBank y NCBI, se usa el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
El BLAST busca las regiones de similitud entre secuencias biológicas.
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
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Figura 7. Alineamiento de nucleótidos del gen MC1R usando BLASTN (*=similitud).
Figura 8. Alineamiento de nucleótidos del gen MC1R usando BLAST, MSA Viewer 1.10.
Para analizar la estructura secundaria de la proteína se usa el programa Protter -

interactive protein feature visualization. Omasits et al. (2013).
http://wlab.ethz.ch/protter/#
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Figura 7. Estructura 2D de la proteína con 7 dominios transmembranas del gen MC1R.
Para el análisis de bioinformática también se pueden usar los siguientes medios:

Geneious (https://www.geneious.com/)
GenBank en el NCBI - NIH (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
European Nucleotide Archive (ENA) del EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/ena)
ADN DataBank of Japan (DDBJ) (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)
OMIA: Herencia mendeliana en línea en animales https://www.omia.org/home
BIBLIOGRAFÍA
Cariaga, A.E. y Darío, P. (2007). El laboratorio de biología molecular: edición ampliada
1a ed. Editorial Universitaria de la Universidad Nacional de Misiones. 160 p.
ISBN 978-950-579-073-9
Pinares et al. (2021). Polimorfismos de nucleótido simple (PNSs) del gen MC1R en
alpacas negras y marrones. Revista Peruana de Biología 28 (1), e19742.
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Capacidad es lo que te permite hacer algo

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Figura 1. Polvo decolorante de 7 y 9 tonos.

Figura 2. Fibra decoloreada y teñida. Adaptado de Wang et al. (2003).

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Figura 3. Alpaca negra y negro intenso con pigmentación eumelánica.

Figura 4. Estructura interna de fibra de alpaca marrón oscuro y distribución de gránulos

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Figura 5. La estructura de fibra aclarada se observa al microscopio.

Figura 6. Análisis de fibras meduladas usando el microscopio de proyección.

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Figura 1. Descripción de las partes de la pipeta monocanal.

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Figura 2. Mantenimiento y desmontaje de la pipeta monocanal.

Manejo de pipetas: ajuste el volumen y acople la(s) punta(s) de pipeta; en la selección

Figura 3. Aspiracion de la muestra

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Figura 4. Vertido de la muestra

Figura 5. Deseche la punta.

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Sitio web Primer3

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Figura 1. Input en NCBI del código depositadas en GenBank: EU135880. EU135880.1

Cuadro 1. Resumen de parámetros ingresados.

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Figura 2. Resultado gráfico de los pares de cebadores.

Figura 3. Resultado detallado de los pares de cebadores.

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Exón 4-ASIP 1 tubo 7 tubos + (-) CDS-MC1R 1 tubo 7 tubos + (-)

ADN (µl) 5.0 5.0 ADN (µl) 6.0 6.0

Total (µl) 25 25 Total (µl) 25 25

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Figura 2. Programación en el termociclador

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Figura 3. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa se utiliza para amplificar

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Figura 1. Esquema del equipo de electroforesis.

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Figura 3. El producto de PCR (4 µl) y el buffer de carga (2 µl) suman 6 µl.

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Figura 5. Sistema de documentación en gel con el transluninador Gel DocTM (izquierda)

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Figura 6. Las bandas corresponden al gen MC1R, ordenadas numéricamente de 1 a 7 y

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