UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

“Norte de la Universidad Peruana”

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

TECNICAS ANALITICAS INSTRUMENTALES EN  ALIMENTOS 

Integrantes:
•Torres Julca Osmer.
•Torres Julca Alexander.
Docente:
Palacios Gonzalez Elizabeth
 TÉ C N I CA S
ELE C T R OF OR É T IC A S
INTRODUCCIÓN
La electroforesis es una técnica que emplean los
científicos en el laboratorio utilizada para separar el
ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su
tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una corriente
eléctrica para mover las moléculas y que se separen
a través de un gel. los poros del gel actúan como un
colador, permitiendo que las moléculas más
pequeñas se muevan más rápido que las grandes.
las condiciones utilizadas durante la electroforesis
se pueden ajustar para separar moléculas en el
rango de tamaño que se desee.
FUNDAMENTO
El movimiento de partículas cargadas debido a un campo eléctrico
externo se llama electroforesis, y de este hecho se deriva la
posibilidad de separar diferentes moléculas si poseen diferentes
velocidades de migración (movilidad electroforética) en un campo
eléctrico, es decir que posean distinta carga. por tanto la
electroforesis es una técnica de separación o fraccionamiento
molecular.
Los primeros experimentos de electroforesis se realizaron aplicando
un campo eléctrico, creado mediante la colocación de dos
electrodos en los extremos de un recipiente, a una solución acuosa
homogénea. Este tipo de electroforesis, denominado electroforesis
libre, no permite la separación con una mínima resolución por lo que
no tiene ninguna utilidad, excepto su uso para obtener fracciones
preenriquecidas en un determinado rango de pi.
FUNDAMENTO
La electroforesis de zona se realiza sobre un soporte solido, que permite
evitar la falta de resolución debido a las fuerzas de convención y de
difusión que se producen en un medio acuoso. estos medios sobre los
que se realiza la electroforesis de zona son estructuras con entramado
molecular, formadas por polímeros. las características que deban poseer
estos medios son:
a) Que sean compatibles con el agua (disolvente de la muestra).
b) Que no posean carga eléctrica propia
c) El tamaño de los poros del entramado debe ser lo suficientemente
grande para que quepan las moléculas a separar. d) no deben
adsorber las moléculas, porque detendría la migración
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA
ELECTROFORESIS
La carga de la partícula va a estar vinculada a su estado de ionización, y este va a depender
del pH del medio en el que está. Cada molécula tiene una constante de disociación (pK), que
pH del Medio es característica de ella; el pK indica el valor de pH en el que se produce la disociación. Existe
un pKa, constante de disociación ácida, y un pKb, constante de disociación básica.

Si se aumenta la diferencia de potencial, se consigue que las moléculas sean atraídas con más
fuerza, y por tanto al moverse más aprisa se acorta el tiempo.
Campo
Eléctrico Si el tiempo es demasiado corto no se produce la separación de las distintas especies
moleculares, pero si es demasiado largo, puede producirse la perdida de la más móvil, y
además se aumenta el riesgo de recalentamiento.
CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO
• La conductividad, o fuerza iónica proporcionada por los iones presentes en el tampón. El
tampón debe poseer conductividad, para que se cree el campo eléctrico, si empleamos agua
destilada, sin ningún ion, se produce un efecto aislante, no hay transmisión de la electricidad y
1 por tanto no hay migración de las moléculas.

• La resistencia debida a la viscosidad del disolvente: Cada partícula tiene un coeficiente de

fricción que depende de la viscosidad de la solución y del tamaño y forma de la partícula. A
2 mayor viscosidad y mayor tamaño e irregularidad de una partícula, más lento es el movimiento.

• El disolvente iónico (el tampón) está en contacto con un sólido, aparecen en éste una serie de
cargas negativas (potencial de Helmholtz), que produce la polarización de los iones del
3 disolvente (adquieren cargas positivas).
ELECTROFORESIS EN GELES DE
POLISACÁRIDOS
Cada soporte tiene unas características especiales que le hacen más
Elección del Soporte adecuado para un determinado uso. En principio hay que ver si
queremos hacer una separación analítica o preparativa, y si son
moléculas grandes o pequeñas.
Las moléculas pequeñas, como aminoácidos, se separan en papel, que
al ser un soporte muy fino permite detectar con mayor facilidad las
pequeñas manchas que se hayan producido. Para macromoléculas, si
la electroforesis es analítica se puede emplear cualquier soporte, el
acetato de celulosa es uno de los más empleados por su facilidad de
manejo y porque tienen la ventaja de hacerse transparentes al
deshidratarlos, de forma que podemos cuantificar por densitometría las
bandas que aparezcan.
 En primer lugar, debe impregnarse el soporte en el tampón que
Elección del Soporte se vaya a utilizar para la electroforesis. Para ello se sumerge el
gel en un recipiente con tampón durante el tiempo necesario.

Para los geles de almidón y agarosa hay que

hacer otro montaje, colocando el gel
completamente sumergido en el tampón o bien
estableciendo unos puentes de papel de filtro
bien empapado en tampón, comunicando el gel
con los compartimientos de la cubeta. La
superficie del soporte debe estar
perfectamente equilibrada sobre la superficie
de apoyo, pues si un extremo está más alto
que otro pueden crearse flujos contracorriente.
 La muestra debe estar diluida en el mismo tampón en que se va a
desarrollar la electroforesis. La resolución aumenta cuanto más estrecha
Aplicación de la sea la banda de aplicación. La muestra debe aplicarse alejada de los
bordes, para evitar que se produzca el efecto de borde, debido a la
Muestra interface formada por el aire y el tampón, donde el campo eléctrico no es
homogéneo y se producen distorsiones en la velocidad de migración.

Se puede realizar una aplicación en banda o puntual. La aplicación puntual o capilar se

emplea en electroforesis analítica, ya que se consume menos muestra y se aprovecha mejor
el soporte, al permitir hacer dos o tres aplicaciones por tira. En el caso de que se hagan varias
aplicaciones en la misma tira, éstas deben estar separadas entre si, ya que la proximidad
produce un efecto similar al de borde. En geles, sobre todo si se desea procesar una gran
cantidad de muestra, esta se coloca en un pocillo o ranura excavado en el gel.
Desarrollo de la Evitar la evaporación Voltaje
Electroforesis
1 del tampón 2 constante

Voltaje Tiempo de
3 a emplear 4 Conexión 5 desarrollo

Elección
6 Medición 7 Bandas 8 de colorantes

9 Ejemplos
 Los tampones más empleados para la separación de ácidos
Elección del Soporte nucleicos son el TAE (Tris-Acetato EDTA) y el TBE (Tris-
Borato-EDTA).

• El TAE tiene menos capacidad de tamponamiento, pero

proporciona la mejor resolución en el caso de moléculas
grandes de DNA. Esto implica utilizar menor voltaje y más
tiempo, pero el resultado final es mejor.
• El tampón Litio-Borato (LB) no sirve para fragmentos
grandes, pero presenta una gran capacidad de resolución
en los pequeños. Tiene una conductividad muy baja que
permite emplear voltajes muy grandes (hasta 35 V/cm) que
permiten acortar los tiempos. Su capacidad de resolución
permite estudiar fragmentos que se diferencian en un único
par de bases
 La agarosa es fácil de manipular, ya que la gelificación es un cambio físico
Electroforesis en gel de y no químico como en el caso de la poliacrilamida. Además es fácil
agarosa - AGE recuperar las muestras después de la separación e incluso pueden
guardarse los geles refrigerados en una bolsa.

Es muy empleada para la separación de proteínas y de

fragmentos de DNA a partir de 50 pb. Los geles
preparados al 0,7% son óptimos para la separación de
fragmentos grandes de DNA 5-10 kpb, y para
fragmentos pequeños se emplea la agarosa en
proporción de hasta el 3%, siendo lo más habitual
prepararlos al 1% . Los geles con baja proporción son
muy frágiles y difíciles de manipular. Para fragmentos
pequeños de DNA es mejor la PAGE
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA - PAGE
El soporte (gel) se construye en el momento de su utilización mezclando dos monómeros:
Preparación acrilamida y bisacrilamida. La acrilamida produce polímeros lineales que van formando una
del soporte malla, y la bisacrilamida produce entrecruzamientos entre ellos, de modo que fija la
estructura. La concentración de acrilamida se escoge en función del tamaño de las partículas
que vayamos a separar.
• Se colocan dos placas de vidrio, separadas mediante espaciadores de 1 ó 2 mm de ancho, y
se deposita entre ellas la mezcla de acrilamida y bisacrilamida, a la que se añade un
iniciador de la polimerización.
• Se obtiene de esta manera el gel de separación. Se añade ahora sobre este gel, otra
cantidad de monómeros, pero con baja concentración de acrilamida (3%), para obtener un
gel concentrante de amplio tamaño de poro, que va a aumentar la capacidad de
resolución.
• Antes de que se polimerice este gel, se cierra la parte superior con una pieza dentada
(peine) y se pone a polimerizar. Puede favorecerse la polimerización mediante radiación
UV.
 • La muestra suele ir disuelta en sacarosa al 40% o en glicerol, para
hacer que la solución sea densa, y la difusión menor.
Aplicación de la muestra
• Se deposita la cantidad adecuada (10-100 ul) en uno de los pocillos
creados por el peine, y se comienza la electroforesis

La diferencia de potencial aplicada a la electroforesis, va a depender del

tamaño del gel, por lo que hay que referirlo a Voltios/cm.
Para calcular el tiempo de desarrollo, se recurre a un marcador, que
Desarrollo de la
consiste en una sustancia coloreada, de alta velocidad electroforética,
electroforesis que va disuelta con la muestra. Cuando el marcador abandona el gel
separador, se termina con la electroforesis. El tiempo aproximado es de
1-2 horas y para localizar la muestra, se recurre también a la tinción.

La PAGE tiene grandes aplicaciones, pero no tienen un excesivo interés

en el campo de los análisis clínicos, son más de investigación.. En primer
Aplicación lugar, el hecho de que la separación dependa del tamaño, y no solo de la
carga, permite separar moléculas que de otra forma sería imposible,
como los ácidos nucleicos.
ISOELECTROENFOQUE - IEF
Es una variante de PAGE en la que la el gel (poliacrilamida) posee
un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue
incluyendo en su preparación moléculas ionizables con valores de
pK diferentes.
Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a
lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente, y
eventualmente alcanzan una región en la cual el pH local es igual
al punto isoeléctrico de la molécula muestra y ésta detiene su
avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la
separación de los componentes de la muestra de acuerdo con su
punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues se conoce la
geometría del gradiente de pH fijado al gel. Habitualmente es
empleado para la separación de proteínas.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Tras realizar una primera
separación, su resultado se somete
a otra de diferente mecanismo en
dirección perpendicular.
Generalmente la primera es un
isoelectroenfoque en un gel
estrecho que luego se coloca como
muestra para una SDS-PAGE.
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE - PFGE
Las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a
20-40 kb no se pueden resolver empleando la electroforesis
convencional en gel de agarosa.
Esto se debe a la dificultad de manejo de los geles
preparados con las bajas concentraciones de agarosa que
requerirían (inferior al 0,4%) y a que las moléculas de DNA
poseen un tamaño excesivamente grande para atravesar
los poros del gel y no se separan en función de su tamaño.
Para solventar este problema se ha ideado una
modificación de la técnica, conocida como electroforesis de
campo pulsante (pulsed-field gel electrophoresis).
Se utiliza para genotipado y es muy empleado en estudios
epidemiologicos.
 INMUNOELECTROFORESIS - IEF
IEF unidimensional IEF bidimensional Contrainmuno
cuantitativa cuantitativa electroforesis
Se realiza una electroforesis en un gel
Se realiza una primera separación de las Similar a una inmunodifusión, pero
impregnado de Ab. Los Ag van precipitando
proteínas en una dimensión y después, en la migración es acelerada por la
hasta que se agotan. El electroforetograma
una segunda dimensión, en un gel con Ab. aplicación de un campo eléctrico.
tiene aspecto de cohete.

Inmunofijación
electroforética (IFE)
Tras realizar la migración electroforética en distintos campos, se pone sobre el gel una
“máscara” y se aplica en cada campo un anticuerpo para fijar los Ag que se
correspondan. A continuación se eluyen las proteínas no fijadas y se tiñen para observar
las bandas.
GRACIAS!!!