Stability Assessment and Formulation Characterization

Aaron Arturo García Sánchez

Biotecnología Farmacéutica

Grupo 93 14/09/2022

Antecedentes

En los últimos 20 años los medicamentos biotecnológicos han ido teniendo un papel creciente en el
tratamiento de muchas enfermedades. Presentan numerosas ventajas respecto a otros medicamentos
biológicos, como una enorme disponibilidad, excelente perfil de seguridad respecto a la transmisión
de virus y otros patógenos, y la posibilidad de disponer de moléculas modificadas o combinaciones
de partes de moléculas distintas con diferente especificidad o afinidad, perfil farmacocinético o menor
inmunogenicidad. La tecnología del ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante ha permitido
obtener en grandes cantidades proteínas terapéuticas que inicialmente se lograban mediante
extracción de fuentes biológicas naturales (órganos animales o humanos), así como también se ha
podido mejorar enormemente el perfil de seguridad de estos productos (hasta la fecha ningún
medicamento biotecnológico ha sido vehículo de contaminación viral). Además, ha permitido obtener
moléculas modificadas para mejorar su actividad, vida media en circulación, su estabilidad o su perfil
de seguridad. Así, disponemos de moléculas, como insulina glargina o darbepoetina, moléculas
modificadas por la unión a otros componentes, como polietilenglicol (interferón alfa o eritropoyetina)
diseñadas para tener un diferente perfil farmacocinético o una inmunogenicidad reducida. Numerosos
anticuerpos monoclonales forman también parte de los recursos terapéuticos actuales.

La estabilidad de las proteínas tiene tanto aspectos termodinámicos como aspectos cinéticos. La
estabilidad cinética es un concepto que está ligado al tiempo promedio en que una proteína mantiene
su estructura y su función bajo ciertas condiciones. Cuando una proteína permanece en el estado
nativo funcional por un período de tiempo largo que le permite llevar a cabo su función, se dice que
es cinéticamente estable. Por otra parte, la estabilidad termodinámica se refiere a las condiciones a
las cuales un proceso cumple con el criterio termodinámico de espontaneidad. El proceso por el cual
la cadena polipeptídica de una proteína alcanza la estructura nativa se denomina plegamiento, y es
uno de los ejemplos más fascinantes y complejos de auto-ensamblaje molecular.

Discusión

Reacciones hidrolíticas en proteínas y péptidos

La desamidación es una vía común de degradación de proteínas y péptidos, esta vía implica la
conversión de las cadenas laterales de los residuos de asparagina y glutamina en los respectivos
carboxilatos de aspartato y glutamato (esta reacción depende en gran medida del pH).

- Condiciones ácidas: se inicia la reacción por el ataque intermolecular directo del agua en el
enlace amida de la cadena lateral, produciendo amoníaco y ácido aspártico para el residuo de
asparagina o ácido glutámico para el residuo de glutamina.
- Condiciones alcalinas, se produce una degradación predominante por desaminación
intramolecular con una contribución relativamente menor a una hidrólisis directa, como
productos tenemos que en la desamidación de la asparagina procede a través de la formación
de un intermedio succinimida, que implica el ataque intramolecular por el N del enlace
peptídico en el C-terminal.

La desamidación espontánea de la cadena polipeptídica en el residuo de asparagina también puede

producirse mediante el ataque del nitrógeno de la cadena lateral de la amida al siguiente carbonilo del
enlace peptídico para formar dos polipéptidos, uno de los cuales contiene un residuo de succinimida
C-terminal.

La mayoría de los productos biofarmacéuticos se formulan a pH fisiológico para su administración

parental y, por tanto, son propensos a la descomposición por desamidación, entre estos productos se
encuentran la hormona paratiroidea humana recombinante, el factor de crecimiento epidérmico
humano, la insulina, el activador tisular del plasminógeno recombinante, la inmunoglobulina
monoclonal h1B4 y el anticuerpo monoclonal murino MMA383.

El efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción de desamidación sigue generalmente la ley

de Arrhenius, ante esto, se han reportado energías de activación de desamidación alrededor de 21-22
kcal mol -1 para dos péptidos modelo bajo condiciones alcalinas. La desamidación también esta sujeta
a la catálisis general ácido/básica, como lo demuestra el aumento de la tasa de desamidación en el
aumento de la concentración del tampón. La potencia biológica no es un marcador sensible para
detectar la desamidación y la formación de isoaspartato, que pueden o no influir en las actividades
biológicas de las proteínas y los péptidos.

Escisión del enlace peptídico en los residuos de ácido aspártico

La descomposición de las proteínas y los péptidos puede reproducirse por escisión en los enlaces
amida, aunque todos los enlaces amida son teóricamente susceptibles de hidrólisis, normalmente
presentan diferentes velocidades hidrolíticas, por ejemplo, la tasa de hidrólisis catalizada por ácidos
en los polipéptidos que contienen residuos de ácido aspártico es al menos 1000 veces mayor que la
de los otros enlaces peptídicos.

En este caso la escisión se produce a través del encale N o C- terminal adyacente al residuo de ácido
aspártico. Está bien establecido que los enlaces peptídicos ácido aspártico-prolina son particularmente
lábiles y se someten a hidrólisis en condiciones en las que otros enlaces peptídicos del ácido aspártico
son estables, por ejemplo, a pH’s bajos. La hidrólisis se produce mediante catálisis intramolecular
por desplazamiento del anión carboxilato del nitrógeno protonado del enlace peptídico.

El aumento de la velocidad de reacción, de aproximadamente 8 a 20 veces, puede atribuirse al

debilitamiento del enlace amida resultante de la mayor electronegatividad del nitrógeno protonado de
la prolina. Al igual que ocurre con los enlaces amida que contienen ácido aspártico, los enlaces
peptídicos que llevan serina o treonina suelen ser más lábiles que otros enlaces amida. La degradación
implica el ataque nucleofílico del grupo hidroxilo de la serina o la treonina sobre el enlace amida
vecino mediante la formación de un intermedio tetraédrico cíclico.

Degradación N-terminal mediante la formación de diketopiperazina y ácido piroglutámico

Si las proteínas y los péptidos poseen un penúltimo residuo de prolina en su secuencia N-terminal, el
primer aminoácido de la secuencia primaria puede ser lisado del esqueleto polipeptídico mediane la
formación de diketopiperazina (DKP). Esta reacción se denomina aminólisis n enzimática, en la cual
se produce un ataque nucleofílico intramolecular del N-terminal sobre el C carbonilo del enlace
peptídico entre el segundo y tercer residuo de aminoácido.

Los materiales farmacéuticos que se sabe siguen esta vía de degradación incluye la sustancia P, la
hormona del crecimiento humana recombinante, el RMP-7, el aspartato y la aspartilfenilalanina en
estado sólido. La tasa de formación de DKP generalmente aumente con el incremento de pka
temperatura, como se ha demostrado para la RMP-7 y la fenilalanina-prolina-para-nitroanilina (Phe-
Pro-para-NA). La manera más efectiva de evitar la catálisis de la base general o de disminuir la
concentración del tampón a pH’s altos puede minimizar esta reacción de ciclización.

Por otro lado, tenemos que el grado de ionización del grupo N-terminal, que se rige por el pKa del
grupo amino y el pH del medio, también afecta a la tasa de formación de DKP porque el primer
aminoácido del medio, también afecta a la tasa de formación de DKP porque el primer aminoácido
protonado en la secuencia no estará disponible para efectuar la reacción catalizada por bases. Sin
embargo, con Phe-Pro-p-NA y su análogo, X-Pro-p-NA (donde X es el otro aminoácido), la influencia
de la secuencia primaria en la tasa de formación de DKP parece estar mediada por la capacidad del
péptido X-Pro de someterse a la isomerización de los cistranos más que por la diferencia en el grado
de ionización o en el impedimento estérico de los aminoácidos N-terminales.

Reacciones hidrolíticas en los ácidos nucleicos

Depuración y despirimidación

La depuración se refiere a la hidrólisis del enlace N-glicosídico, es una importante vía de degradación
de los fármacos derivados del núcleo. Al inhibir la oxidación de los radicales libres, la depuración y
la beta-eliminación representan las vías más significativas para la degradación del ADN. La
depuración es mas rápida con la guanina y la adenina, mientras que la perdida de citosina y timina
procede al 5% de la velocidad de depuración. La estructura de doble hélice del ADN solo puede
ofrecer una protección limitada contra la depuración, como sugiere la diferencia de apenas 4 veces
en la velocidad de depuración observada entre los ADN’s de cadena simple y de doble cadena. La
introducción de una única rotura en la columna vertebral del ADN es capaz de convertir el ADN
plasmídico superenrollado en una forma circular abierta y, por tanto, la monitorización de esta
conversión ofrece un medio conveniente y sensible para determinar la estabilidad del ADN.

Hidrolisis del enlace fosfórico

La superficie hidrofílica de los oligonucleótidos multitrenzados en los dorsos de azúcar-fosfato es un

objetivo prominente para la hidrolisis. La escisión nucleófila del fosfodiéster puede ser medida por
reacciones intermoleculares e intramoleculares, el ADN, al carecer del grupo 20-OH, es mucho menos
susceptible a la hidrolisis catalizada por bases que el ARN. En la hidrolisis catalizada por ácidos
también pude intervenir la isomerización. Generalmente, los nucleósidos pirimidínicos
3’fosfodiesteres reaccionan más rápido que sus homólogos de purina.

Desaminación de los nucleósidos de pirimidina y purina

Es una degradación hidrolítica común para los fármacos derivados de ácidos nucleicos tanto en
condiciones acidas como básicas. Las principales dianas de esta reacción hidrolítica son la citosina y
su homologa la 5-metilcitosina, mientras que la adenina y la guanina son mas propensas a sufrir
desaminación a raves de las vías de dediozoniación. En el ADN, la citosina puede convertirse en
uracilo por desaminación directa mediante una hidrólisis catalizada por la base y un ataque paralelo
de una molécula de agua a la base protonada. En consecuencia, la hidrólisis no muestra una fuerte
dependencia del pH alrededor de pH 7.4. La reacción para el ADN monocatenario es de 150 a 200
veces más rápida que la del ADN bicatenario, lo que refleja la protección considerablemente mejor
que ofrece la estructura de doble hélice.
Oxidación

Es una de las principales vías de degradación química de los productos biofarmacéuticos. La reacción
implica especies reactivas de oxigeno como OH, H2O2, O2 y el oxigeno siglete, que pueden generarse
por autooxidación, fotoactivación y oxidación catalizada por metales. La autooxidación se refiere a
la oxidación en ausencia total de oxidantes. La verdadera autooxidación, que se caracteriza por una
velocidad de reacción extremadamente lenta, normalmente no se considera una vía de degradación
importante para las proteínas. La oxidación puede ser catalizada por varios factores externos, como
la presencia de iones de metales de transición y la irradiación ultravioleta (UV). Entre ellos, la
oxidación catalizada por metales de tipo Fenton es la fuente generadora de especies reactivas de
oxígeno más relevante en las formulaciones farmacéuticas, donde los peróxidos contaminantes
pueden reaccionar con trazas de metales de transición redox activos, como el hierro o el cobre.

Oxidación catalizada por metales

Estas reacciones catalizadas por metales influyen en la estabilidad e las proteínas, los péptidos, el
ADN plasmídico y los fármacos derivados por ácidos nucleicos, al inducir cambios conformacionales
y funcionales en estos biofármacos. En proteínas y péptidos, la presencia de iones metálicos traza
puede catalizar la oxidación ya sea reaccionando directamente con las cadenas laterales de ciertos
residuos de aminoácidos para producir radicales libres o formando complejos con el oxigeno para
producir varias especias reactivas de oxígeno. Generalmente, también se requiere un donante de
electrones o agente reductor conocido como prooxidante para reducir los iones metales de transición.
El prooxidante puede estar presente como contaminante en los tampones o formulaciones, su papel
en la degradación oxidativa de proteínas y péptidos se ha verificado experimentalmente en
condiciones controladas, Aunque se ha informado de menos estudios de estabilidad para el ADN
plasmídico y otros ácidos nucleicos que para las proteínas y los péptidos, se ha demostrado claramente
la capacidad de los iones metálicos traza para catalizar muchos procesos oxidativos (incluida la
reacción de Fenton) incluso en ausencia de peróxido de hidrógeno con los fármacos derivados de los
ácidos nucleicos. La oxidación de los radicales libres es el principal proceso de degradación que
presenta el ADN plasmídico en las formulaciones farmacéuticas en ausencia de eliminadores de
radicales libres y/o quelantes específicos de iones metálicos.

Reacciones de oxidación especificas en proteínas y péptidos

Los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie de las proteínas son mas susceptibles a la
oxidación que los enterrados en el núcleo hidrofóbico, por ejemplo, los diferentes residuos de
metionina en las proteínas pueden mostrar diferencias sustanciales en la tasa de oxidación. Estas
diferencias en la reactividad de la metionina son coherentes con la ubicación y a accesibilidad al
disolvente de los residuos de metionina. Los residuos que son susceptibles de oxidación se dividen
generalmente en dos grupos, los que contienen un átomo de S (metionina, cisteína) y los que tienen
una cadena lateral aromática (histidina, triptófano y tirosina).

Eliminación b en ácidos nucleicos, proteínas y péptidos

El proceso de dos pasos de depuración y beta-eliminación es importante vía de degradación del ADN
en medio acuosos. Tras la depuración, el sitio apurínico contiene azúcar químicamente alterado que
alterna contra una forma cíclica de furanosa y una forma acíclica que contienen un grupo aldehído en
el carbono 1’. La forma aldehídica del azúcar sufre entonces beta-eliminación, que comienza con la
abstracción de un protón del carbono 2’ por el OH-, lo que lleva a la ruptura de la cadena en el carbón
3’ del sitio básico. En proteínas y péptidos, el paso de eliminación implica la abstracción de un protón
del carbono alfa de un residuo de aminoácido en la cadena peptídica para formar un carbanión
intermedio. La raquemización puede producirse entonces mediante la adición de un protón opuesto
del intermedio. Alternativamente, el carbanión se somete a una reacción posterior para formar un
residuo dehidroalanina. La cisteína, la serina, la treonina, la fenilalanina y la lisina son los residuos
de aminoácidos que se sabe que sufren βeliminación en péptidos y proteínas. Los productos
farmacéuticos proteicos que pueden descomponerse por esta vía de reacción incluyen la leuprolida,
la calcitonina de salmón y la insulina.

Inestabilidad física

Desnaturalización

Nos referimos a la alteración del pliegue de un biofármaco con estructuras de orden superior sin que
se produzca un cambio en la estructura primaria, en el caso de las proteínas, estas estructuras de orden
superior se refieren a las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias con diferentes niveles de
complejidad. Cualquier cambio conformacional en estas estructuras puede provocar la
desnaturalización de estos biofármacos. La integridad conformacional de la proteína nativa se
mantiene gracias a un equilibrio adecuado de fuerzas débiles no vinculantes. Conceptualmente, existe
un equilibrio entre la forma nativa plegada y la forma desnaturalizada no plegada de la proteína, con
o sin la participación de intermedios de despliegue, o glóbulos fundidos, en estados termodinámicos
definibles.

Esta perturbación estructural, que puede ser permanente o temporal, conduce a un cambio de las
propiedades físicas sensibles a la conformación (por ejemplo, la rotación óptica, la viscosidad y la
absorción de rayos UV) y, lo que es más grave, a una pérdida concomitante de las actividades
biológicas. Si el proceso de desnaturalización es reversible, la pérdida de la estructura nativa puede
recuperarse una vez eliminada la tensión. La desnaturalización irreversible también conduce a la
agregación y la precipitación, con los consiguientes cambios en las estructuras secundarias y/o
terciarias de las proteínas.

Consideraciones en la prueba de estabilidad de los biofarmacéuticos

- Temperatura: para la materia de las moléculas orgánicas, la degradación térmica suele seguir
la cinética de Arrhenius, sin embargo, muchos biomateriales, por ejemplo, las proteínas, no
muestran una cinética de degradación de Arrhenius ni siquiera en un estrecho rango de
temperaturas, lo que puede atribuirse a transiciones de fase, cambios de pH, mal control de
la humedad relativa a temperaturas elevadas o subambientales, y a la participación de
mecanismos de reacción complejos.
- Humedad: la presencia de agua aumenta la movilidad y la flexibilidad de las macromoléculas
bioactivas en la matriz del excipiente sólido, facilitando así su reorganización y aumentando
su susceptibilidad a la degradación química, por ejemplo, la desamidación de la asparagina
par acere correlacionarse estrechamente con el grado de plastificación inducido por el agua
de las matrices de PVA y PVP, lo que sugiere que la estabilidad química del péptido puede
predecirse por el estado físico de la formulación.
- Luz y radiación ionizante: la radiación, que se emplea habitualmente con fines de
esterilización, puede generar radicales libres y provocar la escisión de la cadena peptídica y
la agregación en productos farmacéuticos proteicos sólidos. En solución acuosa, la proteína
también puede degradarse mediante la destrucción de los residuos de aminoácidos por los
radicales hidroxilos y los electrones producidos por las moléculas de agua.
- Estrés físico: los productos biofarmacéuticos pueden ser inactivados por el estrés físico
asociado al llevado de los viales, el envió, el almacenamiento y la manipulación Para evaluar
el impacto adverso de la agitación en la estabilidad de las preparaciones de insulina, se han
aplicado dos pruebas automatizadas de estrés físico, a saber, la prueba de ciclos de
temperatura y resuspensión (TCRT) y la prueba de alta temperatura y agitación extrema
(HTEAT), a un dispositivo comercial portátil de cartuchos de insulina.
- Liofilización y secado por aspersión: la congelación puede provocar la desnaturalización en
frio e introducir adicionales en las proteínas a través de la cristalización del hielo, del mismo
modo, el secado puede provocar la degradación de las proteínas, al eliminar la cascara de
hidratación que cubre la superficie de la proteína, el estado nativo de la misma puede verse
alterado, lo que provoca su desnaturalización.
 - Excipientes: la inclusión de excipientes puede inhibir o ralentizar la reacción de degradación
en los productos biotecnológicos, algunos azúcares y polialcoholes pueden inhibir la
oxidación catalizada por metales mediante la formación de complejos con los iones de los
metales de transición, mientras que los aditivos poliméricos como el dextrano pueden
funcionar como eliminador de radicales OH.

Conclusiones

Los productos biofarmacéuticos han producido un gran impacto en la sociedad, esto debido a sus
multiples aplicaciones con ello es su importancia y la gran relevancia que han tenido en los últimos
años, un ejemplo de la importancia de un biofarmacéutico es la insulina, ya que este producto ha sido
de gran utilidad en el tratamiento contra la diabetes. Al ser muy utilizado este producto ha conferido
diferentes vías de degradación, lo cual es muy importante ya que hablamos de condiciones químicas
como físicas, y ante ello es de gran variedad la forma en la que no solo la insulina sino la mayoría de
productos biotecnológicos en los cuales se emplea antioxidantes, azúcares, excipientes, polisacáridos,
y condiciones físicas como la humedad, el contacto con la luz, el estrés etc.

Es importante tener en cuenta cada una de estas vías de degradación ya que así podemos prevenir que
exista un efecto desconocido en el paciente, también es interesante tener en cuenta que estos productos
biotecnológicos deben cumplir con los requisitos de estabilidad, ahora sabemos que usamos las guías
ICH para cumplir con la reglamentación necesaria y poder ser comercializados.

Referencias

- Ruiz S., et al. (2011). Biotechnological medicinal products; from dream to reality.
Farmacéuticos de Atención Primaria. Vol. 9, Núm. 3. Disponible en:
https://www.elsevier.es/es-revista-farmaceuticos-atencion-primaria-317-articulo-
medicamentos-biotecnologicos-from-dream-reality-X2172376111012362
- Romero S., et al. (2018). Estabilidad termodinámica de proteínas. Educación Química. Vol.
29, Núm. 3. Disponible en:
https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-
893X2018000300003#:~:text=La%20estabilidad%20de%20las%20prote%C3%ADnas%20
tiene%20tanto%20aspectos%20termodin%C3%A1micos%20como,su%20funci%C3%B3n
%20bajo%20ciertas%20condiciones.
- Chapter: 4.3 Stability Assessment and Formulation Characterization. Albert H.L. Chow,
Henry H.Y. Tong, and Ying Zheng. From: Handbook of pharmaceutical biotechnology.
Edited by Shayne Cox Gad. 2002. Wiley-Interscience a John Wiley & Sons, Inc.,
Publication.