ESCUELA ACADÉMICA DE ODONTOLOGÍA

INFORME N° 8: BACTERIAS - MÉTODO TINCIÓN DE GRAM

INTEGRANTES:

Medrano Garabito, Richard

Talledo Trelles, Antonio Bladimir

Pérez Calle, Gloria

DOCENTE:

Mg. C.D Robles Bottoni, Frank Lenin

LIMA-PERÚ

2022
 INTRODUCCIÓN

¿A qué llamamos célula? La siguiente es una buena definición: una célula es la unidad
anatómica y funcional de los seres vivos. Las células pueden aparecer aisladas o
agrupadas formando organismos pluricelulares. En ambos casos la célula es la
estructura más simple a la que consideramos viva. Hoy se reconocen tres linajes
celulares presentes en la Tierra: las arqueas y las bacterias, que son procariotas
unicelulares, y las células eucariotas, que pueden ser unicelulares o formar organismos
pluricelulares. Las procariotas (anterior al núcleo) no poseen compartimentos internos
rodeados por membranas, salvo excepciones, mientras que las eucariotas (con núcleo
verdadero) contienen orgánulos membranosos internos. Uno de los compartimentos
membranosos de las células eucariotas es el núcleo.

Toda célula, procariota o eucariota, es un conjunto de moléculas altamente

organizadas. De hecho, poseen numerosos compartimentos con funciones definidas.

Uno de los compartimentos presentes en todas las células es la membrana

plasmática o plasmalema, que engloba a todos los demás compartimentos celulares y

permite delimitar el espacio celular interno del externo.

En este informe hablaremos acerca de las células procariotas, específicamente de las

bacterias, se definen habitualmente como células que carecen de orgánulos, al
contrario que las células eucariotas. Aunque esto es cierto, en la mayoría de los
casos existen procariotas que poseen orgánulos, considerando un orgánulo como un
compartimiento rodeado por membrana.

Las bacterias son organismos microscópicos unicelulares. Se encuentran entre las

formas de vida más antiguas conocidas en el planeta. Hay miles de tipos de bacterias
diferentes y pueden vivir en todos los medios y ambientes imaginables, en cualquier
parte del mundo.

Solo unos pocos tipos de bacterias causan enfermedades son las conocidas con el
nombre de patógenos. Las bacterias causan enfermedades mediante la producción
de sustancias nocivas (toxinas), la invasión de tejidos o ambas cosas. Algunas
bacterias pueden desencadenar una inflamación que puede afectar el corazón, los
pulmones, el sistema nervioso, los riñones o el tubo digestivo. Algunas bacterias
(como Helicobacter pylori) aumentan el riesgo de cáncer.
 LAS BACTERIAS

Una bacteria es un microorganismo unicelular. Por lo general su tamaño es de algunos

micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 µm) y se presentan de diversas formas. Además
son muy abundantes en el planeta y pueden vivir en condiciones ambientales muy
extremas. Son células procariotas con una estructura sencilla, no presentan núcleo, en
general, orgánulos membranosos internos. Suelen tener pared celular compuesta por
peptidoglicano y algunas también presentan flagelos, u otros componentes que guardan
similitud con este, que les permiten moverse.

Estos seres vivientes tienen relaciones con prácticamente todas las formas de vida del
planeta, ya sea a través de relaciones de comensalismo (como las bacterias que
proliferan sobre la piel), mutualismo (como las que colaboran con la digestión de los
alimentos en el intestino) o de parasitismo (como las causantes de infecciones y
enfermedades).

La vida bacteriana es indispensable en los procesos de descomposición de la materia

orgánica, necesarios para el reciclaje de elementos como el carbono o el nitrógeno, y
constituyen la base de las cadenas tróficas de diversos ambientes.

Las bacterias se reproducen rápidamente y mediante procedimientos asexuales, que

consisten en la replicación de la célula progenitora en dos exactamente iguales a ella
(fisión binaria). Se estima que, en un ambiente propicio, una bacteria es capaz de
dividirse en apenas 15-20 o 20-30 minutos, dependiendo de la especie.

Las bacterias se pueden clasificar de distintas maneras:

● Clasificación según su forma

■ Cocos: Esféricos
■ Bacilos: En forma de barra o bastón
■ Espirilos: Helicoidales. Pared celular rígida.
■ Vibriones: Curvados, pueden ser en forma de coma (,), cachuete, etc.
■ Espiroquetas: Helicoidales. Pared celular flexible.
● Clasificación según su nutrición
■ Fotótrofas: Fotones de luz.
■ Quimiótrofas: Sustratos inorgánicos reducidos.
■ Litotrofas: Sustratos minerales.
■ Organotrofas: Sustratos orgánicos.
■ Quimiroganotrofas: Materia orgánica.

● Clasificación según la pared celular

■ Gram + (positiva) : Adquieren un color violáceo o azulado cuando se emplea el

tinte cristal violeta, debido a la presencia de una pared celular engrosada. Capa
gruesa de peptidoglucano o mureína en la pared celular.
■ Gram – (negativa) : Toman un color rosado o rojo cuando se emplea el tinte
cristal violeta, debido a la presencia de una pared celular delgada. Capa delgada
de peptidoglucano o mureína en la pared celular.

PARTES DE UNA BACTERIA Y SUS FUNCIONES

Pared celular.- Es la capa más externa de la célula bacteriana, la que le confiere

rigidez y forma,uno de los componentes fundamentales de la misma es el
peptidoglicano. Algunas bacterias como los micoplasmas, no tienen esta estructura.

Membrana plasmática.- Se encuentra debajo de la pared, en la misma están incluidos

todos las estructuras y orgánulos vitales. Está compuesta principalmente por lípidos y
proteínas; algunas contienen además pequeñas cantidades de hidratos de carbono,
ADN y ARN.
 Funciones:

1. Actúa como orgánulo limitante.

2. Concentra los nutrientes en el interior de la célula y excretando los productos de

desecho.

3. Lugar donde se biosintetizan determinados constituyentes celulares de la pared y

la cápsula.

4. Localiza ciertas enzimas, generalmente del metabolismo energético.

Mesosomas.- Son unas invaginaciones de la membrana, que también se conocen

como cuerpos periféricos. Son sitios para la respiración celular y producción de energía;
formación de la pared en bacterias grampositivas; centro para el ordenamiento de la
división celular; sitio para la toma de ADN durante la transformación.

Citoplasma.- En el mismo no hay mitocondrias, pero si organelos especiales como

vesículas de gas, constituyentes solubles, materiales de reserva nitrogenados y no
nitrogenados.

Cromosoma.- No está rodeado por membrana ni tiene forma definida, se propone que
su estructura es plegada.

Flagelos.- Estructuras compuestas por flagelina, cuya función es darle motilidad a las
bacterias.

Pilis.- Son apéndices filiformes que pueden hallarse en la superficie de bacterias

gramnegativas, que intervienen en la transferencia del ácido nucleico durante la
conjugación entre bacterias.

Cápsula.- Es un revestimiento viscoso, gomoso, mucilaginoso, que se encuentra

ocupando la porción más externa de muchas procariotas; generalmente constituida por
polisacáridos así como también puede presentar polipéptidos, su componente principal
es el agua. Su función es proteger a estos microorganismos contra la desecación, y
contra la fagocitosis.

Endospora.- Se encuentran en las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium y

también en las Sporosarcinas. Compuestas por protoplasto (ADN,ARN y enzimas),
corteza (peptidoglicano), cubiertas (de naturaleza polipeptídica, a las cuales se atribuye
sus propiedades hidrófobas) y exosporio (proteìnas, polisacáridos y pequeñas
cantidades de lípidos). Entre sus propiedades se encuentran: altos índices de
refracción, impenetrabilidad de los colorantes ordinarios y muchos desinfectantes y alto
grado de termorresistencia.

PARED CELULAR

Las cubiertas que rodean la célula bacteriana se han identificado por medio de técnicas
de tinción en microscopía óptica y electrónica, y técnicas de aislamiento y
caracterización bioquímica de los componentes celulares.

Tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas poseen una pared celular
de peptidoglicanos que les confieren su forma característica y les provee de protección
mecánica.

La envoltura celular bacteriana tiene como función principal evitar que la bacteria pierda
iones y otras moléculas a favor de gradiente de concentración con el exterior, menos
concentrado.

En los procariontes, la función primaria de la pared celular es proteger la célula contra

la presión interna causada por las concentraciones mucho más altas de proteínas y de
otras moléculas dentro de la célula que en el medio exterior. La pared celular bacteriana
se diferencia de la del resto de los organismos por la presencia de peptidoglicano
(heteropolímero alternante de poli-N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico) y
está situada inmediatamente a continuación de la membrana citoplásmica.

El peptidoglicano es responsable de la rigidez de la pared celular bacteriana y

determina la forma de la célula. La pared es relativamente porosa y no constituye una
barrera para los substratos pequeños. Aunque todas las membranas celulares
bacterianas contienen peptidoglicano (siendo excepciones algunos parásitos
intracelulares, por ejemplo, Mycoplasma), no todas las membranas celulares tienen la
misma estructura. Esto se refleja notablemente en la clasificación Gram-positiva y
Gram-negativa de las bacterias.
 MÉTODO DE TINCIÓN DE GRAM

La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por Christian

Gramen el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera
posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y
clasificarlas.

Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen
de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se
denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por
menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la
tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras.

El cristal violeta se une a la pared bacteriana y se estabiliza con el lugol. La mezcla

alcohol-acetona disuelve la membrana externa de las bacterias Gram negativas (más
fina que la de las Gram positivas) extrayéndose el cristal violeta. Después se tiñen solo
las Gram negativas con safranina.

PROCEDIMIENTO

En primer lugar, para realizar una tinción, lo que tenemos que tener son
microorganismos sembrados. Dichos microorganismos son sembrados el día anterior
mediante la técnica de siembra de estría múltiple, se dejan durante 24 horas a 37ºC en
la incubadora para así obtener las colonias de los diferentes microorganismos.
Siempre que “destapemos” una placa con colonias, deberá hacerse en condiciones de
esterilidad. Para conseguir estas condiciones podemos utilizar un mechero Bunsen o un
mechero de alcohol. Con el mechero, conseguiremos que se forme un ambiente de
esterilidad alrededor de la llama, por lo tanto, si trabajamos cerca del mechero, tendremos un
ambiente estéril.

A la hora de comenzar con la tinción, lo primero que hay que realizar es un frotis del
microorganismo, para ello hay que añadir una gota pequeña de agua destilada (cuanto mayor
sea la gota, tardará más tiempo en secarse).

Debemos coger la muestra con el asa bacteriológica previamente esterilizada. Para ello
encendemos el mechero de alcohol y ponemos el asa en posición vertical encima del
mechero hasta que el hilo del extremo del asa se quede totalmente incandescente.
Después debemos esperar a que se enfríe porque si tocamos con el hilo incandescente las
colonias podemos matar al microorganismo.

Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el agar para comprobar que éste
está frío.

A continuación, cogemos unas colonias de las bacterias y las extendemos sobre la gota de
agua destilada.

Una vez extendido, volvemos a esterilizar el asa, ya que todo material debe ser esterilizado
antes de volver a ser guardado. A continuación, lo que tenemos que hacer es fijar la muestra,
la cual se puede fijar con metanol o se puede fijar con calor. En este caso utilizaremos la
fijación por calor.

Tenemos que hacer movimientos circulares o en zig zag por encima de la llama del mechero,
levantando constantemente la muestra para que no se nos queme el tiempo suficiente para
que la muestra quede totalmente seca y por lo tanto fijada.
Una vez fijada la muestra apagamos el mechero por seguridad.

Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de microorganismos en el portaobjeto con diferentes

tipos de tinciones para poder visualizar cada microorganismo (bacteria) al microscopio.

Las tinciones se realizan en un cristalizador, también utilizamos varillas de tinciones y el

porta con la muestra.

Vamos a utilizar diferentes reactivos para la tinción. En primer lugar el cristal violeta, en
segundo lugar el lugol,

usaremos también alcohol de 96º (el decolorante puede estar formado por una mezcla de
alcohol, alcohol-acetona y por diferentes mezclas), y por último la safranina.
Las bacterias gram positivas y las bacterias gram negativas tienen diferente grosor en el
peptidoglicano de su pared celular, de tal forma que cuando echemos el cristal violeta se nos
van a teñir tanto las gram positivas como las gram negativas. El lugol lo que hará, será fijar el
colorante del cristal violeta a las bacterias, con el alcohol (o mezcla decolorante), lo que
haremos será eliminar el cristal violeta de las gram negativas y por último, la safranina, va a
teñir solamente a las gram negativas que son las que están decoloradas. Por lo tanto, las
gram positivas estarán teñidas de cristal violeta y las gram negativas de safranina (color
fucsia).

El protocolo será aplicar a las bacterias fijadas cristal violeta durante un minuto, luego lavar
con el frasco lavador. A continuación, añadir lugol durante un minuto, volver a lavar con el
frasco lavador. Después, añadir durante 10 o 15 segundos la mezcla de alcohol o
alcohol-acetona…, lavar la muestra con el frasco lavador. Y finalmente, añadir safranina
durante un minuto y lavar con agua destilada.

Por lo tanto, tal y como hemos dicho, aplicamos el cristal violeta.

Una vez que ha transcurrido el minuto lo lavamos con agua destilada.

Ahora vamos a añadir el lugol justo por encima de la zona de la muestra y esperamos otro
minuto.

Ya ha transcurrido el minuto y lavamos con agua destilada. A continuación decoloraremos la

muestra con el alcohol. Para conseguirlo hay que incorporar el porta de un lado para ir
añadiendo el alcohol y que vaya resbalando para abajo. Cada protocolo estipula un tiempo
pero con 15 segundos aproximadamente la muestra quedará decolorada.

Tras los 15 segundos de decoloración, aclararemos con agua destilada para que el alcohol
no siga actuando, porque si no paramos el proceso de decoloración a tiempo, todas las
bacterias quedarían decoloradas, no solamente las gram negativas y por lo tanto no
podríamos diferenciar unas de otras.

Por último, aplicamos a la muestra la safranina y la dejamos actuar durante otro minuto.
Transcurrido el minuto, volvemos a aclarar la muestra con agua destilada y dejaríamos que la
muestra se secara.

Posteriormente observaremos la muestra con el microscopio.

Gram negativas Gram positivas

 CUESTIONARIO

1. ¿Qué es un frotis?

Un frotis es un mecanismo científico que consiste en el extendido de una gota de una

muestra o cultivo, sobre la superficie de un portaobjetos o de un cubreobjetos ,con el
fin de analizar posteriormente bajo el microscopio.

2. ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el portaobjetos?

Permite que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos
posible la morfología bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera
haber. Esto posibilita eliminar el movimiento que presentan los microorganismos en
las preparaciones en fresco. La retención de colorantes por las bacterias permite su
fácil observación bajo el microscopio, así mismo, que la membrana de la muestra se
quede adherida al portaobjetos.

3. ¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?

Es de gran utilidad en Bacteriología, ya que permite diferenciar la caracterización

morfológica e identificación de la muestra (tales como las bacterias en Gram positivas
y Gram negativas). Finalmente nos proporciona planificar un tratamiento adecuado
(los antibióticos no funcionan por igual para las bacterias gram positivas que gram
negativas).

4. ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los

microorganismos?

El aceite de inmersión es un líquido viscoso y transparente que tiene un alto índice

refractivo. Por este motivo es muy utilizado en las observaciones microscópicas ya
que brinda la propiedad de concentrar la luz, reduciendo la refracción del mismo que
distorsiona la imagen de la muestra. Cuando la luz pasa a través del objetivo de 100X
del microscopio, aumenta su poder de resolución.
5. De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿cuál es el que funciona
como colorante primario?

El lugol, fijará el colorante del cristal violeta a las bacterias, con el alcohol (o mezcla
decolorante), lo que haremos será eliminar el cristal violeta de las gram negativas y
por último, la safranina, va a teñir solamente a las gram negativas que son las que
están decoloradas.

6. ¿Qué función tiene el Yodo en la tinción de Gram?

La solución yodada de Lugol es necesaria para formar el complejo colorante-yodo de

las bacterias Gram-positivas, su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia
oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por
los colorantes básicos.

7. ¿Qué color se tiñen las bacterias Gram (+) y Gram (-)?

Las bacterias Gram positivas, se tiñen de color violeta.

Las bacterias Gram negativas, se tiñen de color rojo.

8. Menciona tres bacterias Gram (+) y escribe la enfermedad que causan.

Staphylococcus aureus.- Responsable de abscesos, dermatitis, infecciones

localizadas y posibles gastroenteritis.

Streptococcus pyogenes.- Causante de infecciones supurativas en el tracto

respiratorio, así como de fiebre reumática.

Streptococcus agalactiae.- Frecuente en casos de meningitis neonatal, endometritis

y neumonía.

9. Mencione tres bacterias Gram (-) y escriba la enfermedad que causan.

Neisseria meningitidis.- Peligrosa bacteria causante de meningitis y

meningococcemias, coloniza las vías respiratorias humanas y asciende a las
meninges por vía sanguínea.
Klebsiella pneumoniae.- Es una bacteria Gram negativa, encapsulada, no móvil,
fermenta la lactosa, anaerobio facultativo.

Escherichia coli.- Habitante usual del colon humano, está involucrada en las
llamadas “diarreas del viajero”,así como en meningitis neonatal e infecciones
urinarias.
 CONCLUSIONES

1. Las bacterias son muy importantes para el desarrollo de la vida del hombre, no
necesariamente generan enfermedades sino que ayudan por sus roles químicos a
combatirlas.

2. Las bacterias presentan un organismo que sintetiza rápidamente los nutrientes

adquiriendo así energía para su desarrollo, por ello su éxito evolutivo .

3. Es por esta razón que debemos cuidar nuestro cuerpo, alimentarnos muy bien, hacer
ejercicio por lo menos tres veces a la semana, lavarnos las manos antes y después
de realizar cualquier actividad, dentro o fuera de casa.

4. Las tinción Gram, a través de sus procedimientos nos ayudan a determinar el tipo de
bacterias, tanto Gram positivas y Gram negativas, diferenciándose ambas por grosor
de su pared celular de peptidoglicano.

5. El determinar correctamente el tipo de bacteria nos permitirá otorgar un adecuado

plan de tratamiento.

6. Los microorganismos más frecuentes son Escherichia coli (44%), Staphylococcus

aureus (24%) y Klebsiella pneumoniae (7%).
 BIBLIOGRAFÍA

1. Audesirk T., Audesirk G., Byers B. BIOLOGÍA LA VIDA EN LA TIERRA CON

FISIOLOGÍA. Novena Edición. México: Pearson; 2013. 1000 páginas.

2. Ministerio de Educación y Formación profesional [Internet]. España: Kapital

inteligente; 2022. [Consultado 24 de Octubre de 2022]. Disponible en
https://www.kapitalinteligente.es/tincion-de-gram/ .

3. Lozano J.,Galindo J., García-Borrón j., Bioquímica y Biología Molecular para

ciencias de la salud. 3era Edcición. España: McGRAW-HILL; 2005. 803 páginas.

4. Castañeda M. Microbiología aplicada, Manual de laboratorio. México:

AZCAPOTZALCO. 2019. 240 páginas.