Medios de cultivo

I. Siembra y aislamiento

Concepto:

La acción de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado que

permita el desarrollo de colonias se denominan siembra. Para el efecto es
necesario tener en cuenta algunas condiciones previas:

a) Marcar convenientemente los tubos o placas a sembrar.

b) Evitar las corrientes de aire. Encender el mechero.
c) Flamear el asa de Kolle y la boca de los tubos que contienen las cepas,
antes y después de la siembra.

Clases de siembra: se pueden clasificar en dos grandes clases.

I) Siembra por trasplante: ocurre generalmente cuando el material

motivo de la siembra contiene una sola especie microbiana. También
se denomina “repique”. El objetivo perseguido es el mantenimiento del
microorganismo conocido cambiando de medio de cultivo. Es el caso
del mantenimiento de los ceparios.
Esta, siembra por trasplante, puede ser:
 De un medio sólido a otro medio solido
 De un medio sólido a un medio liquido
 De un medio líquido a un medio liquido
 De un medio líquido a un medio sólido.

En cualquiera de los cuatro métodos, seguir los siguientes pasos:

1-. Esterilizar la aguja de Kolle en la llama de oxidación.

2-. Tomar el tubo de la cepa y el tubo del medio de cultivo con la mano izquierda,
cuidando que se encuentren a la misma altura y con alguna separación.

Quitar los tapones de algodón con la mano derecha, manteniéndolos entre los
dedos.

3-. Flamear la boca de los tubos por la llama del mechero.

4-. Introducir la aguja de Kolle estéril en el tubo que contiene el cultivo, introducir
en el segundo tubo, bien sea sobre la superficie del agar (hacer una línea) o en
el medio líquido (taponear los tubos).Flamear la boca de los tubos y el Asa de
Kolle.

Incubar a 37ºC X 24 hrs. Al cabo de los cuales en el medio liquido observar la

presencia de turbidez, velo, sedimento, etc; y en los medios solidos observar el
desarrollo de colonias sobre la superficie del medio y a lo largo de la estría.

II) Siembra por aislamiento: Este método se utiliza generalmente cuando

se desea hacer un estudio bacteriológico de la muestra motivo de la
siembra. Por lo común nos encontramos frente a una mezcla
bacteriana, por lo que es preciso separar (“aislar”) los gérmenes.
Luego del aislamiento se les puede mantener en cultivo puro, para
luego proceder a identificarlos merced a sus propiedades culturales y
bioquímicas.
El aislamiento puede ser:
a- Por agotamiento en superficie solida
b- Por diluciones sucesivas y agregando medio licuado.
a) Aislamiento por agotamiento en superficie: Este puede realizarse
mediante:
1) Asa de Kolle
2) Aguja de Kolle
3) Con espátula de vidrio de Drigalsky
4) Con trompa de mosca
1. Con el Asa de Kolle o con la “trompa de Mosca” sembrar.
2. Con la aguja de Kolle sembrar, teniendo, en cuenta el esquema e
indicaciones siguientes.
2.1. Con la aguja de Kolle cargada hacer cinco estrías paralelas.
2.2. Esterilizar la aguja a la llama
2.3. Enfriar en el agar (ver puntos entre las estrías)
2.4. Sin tomar nuevo inoculo, hacer segunda serie de estrías
2.5. Repetir cuatro veces esta operación, haciendo tan solamente una
estría la última vez.
 3. Con la espátula de Drigalsky, extender un volumen conocido de muestra
liquida (generalmente 0.1ml), sobre el medir solidificado en Petri.
b) Aislamiento por diluciones sucesivas:

Se pueden obtener colonias aisladas a partir de una mezcla microbiana,

diluyendo la muestra y utilizando un medio licuado y enfriado a 45ºC, el cual
luego es incorporado sobre un Petri. Este método es conocido como “siembro
por incorporación”.

El agar nutritivo se encuentra en tubos contenidos cada uno 20 ml, a una

temperatura de 40-50ºC . Sobre un petri estéril se segrega 1.0 ml de la
dilución apropiada y luego se agrega el Agar licuado, seguido de movimientos
de rotación e la placa Petri, para la dispersión de los gérmenes en forma más
o menos homogénea hasta la solidificación.

Incubar a 37ºC X 24 hrs, al cabo de los cuales hacer el recuento de colonias.

II. Medios de cultivos

1. Medios de transporte

Cuando por razones de tiempo y/o distancia no se puede realizar la siembra

inmediata de la muestra, se utilizan los llamados medios de transporte, los cuales
tiene como finalidad conservar casi invariablemente la posible flora presente en
la muestra a examinar, manteniéndose en su estado de latencia.

1.1. Medio Stuard

La falta de una fuente de nitrógeno inhibe la multiplicación de los gérmenes

y la gran concentración de hidratos de carbono facilitan la viabilidad de las
bacterias presentes. Provee de una anaerobiosis suficientemente controlable
con el azul de metileno, en este caso las Neisperias se conservan hasta tres
días, las Trichononas un día, Heemophylus,Neumococos,Estreptococo, y
bacterias diptericas hasta 3 y 5 días, Salmonellas y Shigelas se conservan
hasta cinco semanas.

1.2. Caldo Hajna

El desoxicolato y citrato inhiben la flora Gram positiva, el tampón mantiene el

Ph adecuado para la viabilidad de las bacterias Gram negativas y escaso
contenido de nitrógeno proteico impide la multiplicación de los gérmenes
manteniéndose constante su número. Este medio se destina para la
conservación, recolección y transporte como Salmonellas, Shigellas,
Klebsiellas y otras Gram negativas.

2. Medios de Pre-enriquecimiento y enriquecimiento

2.1. Caldo manitol

Es un medio de pre-enriquecimiento que carece de inhibidores. La

degradación del azúcar se evidencia por el viraje del indicador.

2.2. Caldo lactosado

Es un medio libre de inhibidores que facilita el crecimiento de las bacterias,

orientando la presencia de coliformes por el metabolismo degradativo (CO2)
con formación de burbujas en la campana de Durhan. Se puede agregar
indicador rojo de fenol para visualizar producción de ácido.

2.3. Caldo selenito

El selenito de sodio inhibe el crecimiento de los coliformes, enteroccos y

estafilococos. No así a las Salmonellas, proteus, shigellas y pseudomonas.

2.4. Caldo Tetrationato

El Tetrationato inhibe el crecimiento de coliformes, mientras que las sales

biliares y el verde brillante hace propio con los Gram positivos. Originalmente
el medio no contiene tetrationato, este se forma por oxidación del tiosulfato
sódico contenido en la sal de Lugol. El tetrationato formado se descompone
en ácido sulfúrico, acido sulfuroso y azufre; el carbonato de calcio neutraliza
la acidez y coadyuva la estabilidad del tetrationato.

3. Medios de Aislamiento No Selectivos

Son medios que conteniendo fuentes de nitrógeno e hidratos de carbono

permiten el crecimiento de bacterias Gram negativas y Gram positivas, no
inhiben el crecimiento de dichas bacterias por carecer de sustancias
inhibidoras, al mismo tiempo no contienen indicadores de Ph. Se utilizan para
el aislamiento primario.
3.1. Agar Soya Tripticasa (TSA)

Es un medio sólido para usos generales, utilizado en el aislamiento e una

serie de microorganismos tanto Gram positivas como Gram negativas. El
contenido proteico (las dos peptonas) permite el fácil desarrollo de aerobios
comunes, bacterias facultativas, estreptococos, neumococos, brucellas, etc.

3.2. Agar Muller-Hinton

Al igual que el medio anterior este carece de inhibidores e indicadores,

permitiendo así el crecimiento de una gran variedad de microorganismo tanto
Gram positivos como Gram negativos.

3.3. Agar Sangre

El agregado de sangre permite el aislamiento de cultivo de microorganismo

sumamente exigentes y fastidiosos. Además permite observar el tipo de
degradación (hemolisis) del hematíe.

3.4. Agar Chocolate

Este medio se utiliza para el aislamiento de gérmenes que necesitan asimilar

rápido y fácilmente los factores X y V presentes en la sangre. El factor X es
la hematina y esta constituida por el núcleo FEM. Este factor se libera cuando
los hematíes sufren la acción del calor, liberándose también la hemoglobina.
El factor V no se destruye por el calor.

3.5. Caldo infusión cerebro corazón (BHI)

Es un medio líquido que permite el crecimiento de microrganismos

considerados generalmente como muy difíciles de cultivar, en él los
gérmenes mantienen su virulencia, antigenicidad y otras características
serológicas.

3.6. Medio Ruiz Castañeda

El medio consta de dos fases, una sólida y otra liquida. La parte solida puede
ser el agar nutritivo o los descritos en 3.1. , en el que se pueden observar la
morfología de las colonias y en la parte liquida que puede ser el medio
descrito en él se observara enturbiamiento si hay crecimiento. Se puede
proporcionar CO2 al medio.

3.7. Caldo Nutritivo

Es un medio altamente enriquecido que permite crecimiento de la mayoría de

bacterias.

3.8. Agar Nutritivo

Es el caldo nutritivo pero adicionado de AGAR-AGAR. El medio solido permite

estudiar la morfología de colonias.

4. Medios de aislamiento poco selectivos

Son aquellos que contiene sustancias inhibidoras e indicadores de Ph,

generalmente permiten el crecimiento de las bacterias Gram negativas
inhibiendo a los Gram positivo, con excepción del Agar Brolacin, que si
permite el crecimiento de los Gram positivos

4.1. Agar Mac Conkey

La presencia de las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de

las bacterias Gram positivas. En lactosa está presente y el indicador rojo
neutro permiten diferenciar los gérmenes fermentadores de este azúcar de
aquellos que no lo hacen.

4.2. Agar eosina azul de metileno (EMB)

La presencia de los colorantes eosina y azul de metileno inhibe el crecimiento

de la flora Gram positiva, estos mismos colorantes permiten la diferenciación
de los Gram negativos e indican los germenes que fermentan la lactosa de
aquellos que no lo hacen.

4.3. Agar Lactosa purpura de Bromocresol

La alta concentración de lactosa facilita el crecimiento de las bacterias

entéricas. Permite diferenciar a los fermentadores de lactosa de los no
fermentadores. La flora Gram positiva es inhibida por la presencia del
colorante cristal violeta.

4.4. Agar lactosa rojo de fenol

La alta concentración de lactosa facilita el desarrollo de bacterias entéricas y
la presencia del rojo de fenol permite diferenciar a las fermentadoras de
lactosa de aquellas que no lo hacen.

5. Medios de aislamiento selectivos

Todos ellos contienen sustancias inhibidoras. Inhiben crecimiento de

gérmenes Gram positivos y además de algunos Gram negativos como el
grupo coliforme aunque no en su totalidad ni con rigurosidad señalada para
los Gram positivos.

5.1. Agar manitol salado

El alto contenido de sal suprime el crecimiento de la mayoría de otras

bacterias que no sean Estafilocos. El paso del carbohidrato manitol hasta
acido hace virar el indicador rojo de fenol a un color amarillo, esta propiedad
es por lo general sinónimo de patogenicidad para el caso de los Estafilococos.

6. Medios de aislamiento altamente selectivos

Como su nombre lo indica son medios que contienen entre sus componentes
sustancias inhibitorias y en algunos casos, indicadores. Inhiben el
crecimiento de los gérmenes Gram positivos, de la mayoría de coliformes de
algunas Salmonellas, Porteus y Shigellas.

6.1. Agar Desoxicolato Citrato

La flora Gram positiva, los coliformes y a gérmenes que son inhibidos por la
presencia de altas concentraciones de citrato, tiosulfato y desoxicolato;
permitiendo el libre crecimiento de Salmonellas y algunas Shigellas. La
degradación de la lactosa produce una acidificación de la zona, ocasionando
el viraje del indicador neutro. La reducción del tiosulfato a sulfuro se
comprueba con el sulfuro de hierro de un color negro.

7. Medios especiales de cultivo y aislamiento

7.1. Agar Saboraud

Es un medio recomendado para el cultivo de hongos, particularmente de

aquellos asociados a infecciones dermatológicas. El contenido de glucosa y
 el Ph bajo facilitan el rápido desarrollo de los hongos y levaduras presentes
en la muestra.

7.2. Medio de Lowestein Jensen para Micobacterium

Es un medio altamente nutritivo pero contiene un inhibidor de la mayoría de

bacterias, permitiendo el desarrollo de bacilos tuberculosos humanos y
bovinos.

8.
8.1. Caldo Glucosado
Fundamento :Es un medio de diferenciación que utiliza capacidad de los
microorganismos de degradar la glucosa , con un ph de 4.4.
8.2. Agar Fenil Alanina

Fundamento Se aprovecha la desaminación oxidativa de la alanina con

formación de acido fenil pirúvico, que algunas bacterias puedes descomponer .

8.3. Caldo de Cianuro

Fundamento En los microorganismos existe sistemas respiratorios sensibles al

cianuro,principalmente los que no requieren citocromooxidasa,ni de los
citocromos , no son afectados por la presencia de cianuro.

8.4. Caldo Malonato

Fundamento Se produce su utilización del malonato sódico lo cual se

manifiesta por la aparición de un color azul de Prusia por ciraje del indicador
azul de bromotinol del medio alcalino.

8.5. Hidrolisis del almidón

Fundamento: La molécula de almidón es muy compleja y para su asimilación

por las bacterias estan las deben de descomponer en sustancias mas simples.
La enzima amilasa puede dar la demostración de la hidrolisis en un medio
liquido como el sodio solido.

8.6. Hidrolisis por gelatina

Se aprovecha la enzima gelatinasa para degradar la gelatina.

Investigacion de B-Galactosidasa
 Fundamento :La bacterias que fermentan el disacárido lactosa ,van a
poseer una enzima responsable de esta transformación, esta enzima es la
tonitrofenil beta-d-galacto piranosido .

8.7. Agar Fosfatasa

Fundamento: La prueba se funda en la capacidad del microrganismo para

liberar fenoltaleina del fosfato de fenolftaleína por producción de la enzima
fosfatasa.

8.8. Agar Desoxirribonucleasa

Fundamento:Viene a ser el agar tripticase de soya al cual se a incorporado

el acido desoxirribonucleico con la finalidad de determinar la actividad
desoxirribonucleasa de las bacterias y hongos.

8.9. Medio Base para la fermentación de azucares y alcoholes

Fundamento:Se evitaría por el cambio de color del indicador,propiedad

dependiente del ph del medio.La producción del gsd consta mediante un
tubo.

8.10. Producción de la Catalasa

Muchas bacterias producen peróxido de hidrogeno en presencia de oxigeno

libre. La acumulación del peróxido de hidrogeno en cultivos es controlado
mediante mecanismos: La catalasa bacteriana y por ausencia de
sensibilidad de gérmenes .

8.11. Citocromooxidasa

Fundamento: Esta enzima conocida también con el nombre de

indofenoloxidasa,nadoxidasa , citocromo c oxidasa ,etc. El sustrato dimetil-
p-fenilendiamina en presencia del oxigeno molecular y del citocromo C.

9. Otras pruebas bioquímicas

Prueba de la Coagulasa

Fundamento: La coagulasa es una enzima que esta producida por el mas de

96% de estafilococos,procedentes de infecciones humanas.
 10. Composición

Caldo hidrolizado de Caseina

Composición :

Hidrolizado Pancreatico de caseína 20 gm

Lecitina de soya 5 ml

Polisorbato 40ml

Agua destilada 960 ml

Agar Hidrolizado Soya-Caseina

Composición:

Hidrolizado Pancreatico de caseína 15g

Lecitina de soya 5 g

Agar 15g

Agua destilada 960 ml

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato

Composición:

Xilosa 3.5g

L-lisina 5.0g

Lactosa 7.5g

Cloruro de sodio 5.0g

Rojo Fenol 0.080g

Citrato férrico amoniacal 0.800

Agua 1000ml

Agar Fierro Triple Azúcar

Composición:
Caseina 10.g

Animal tejido 10.0g

Lactosa 10.0g

Dextrosa 10.0g

Sulfato ferroso aminoacal 0.200g

Cloruro de sodio 5.0

Tiosulfato de sodio 0.200

Agar 13.0

Agua 1000ml

Agar Mac Conkey

Composición:

Gelatina 17.0g

Caseina 1.5g

Tejido animal 1.5g

Lactosa 10.0g

Sales Biliares 1.5g

Cloruro de sodio 5.0

Agar 13.5

Cristal violeta 0.001g

Agua 1000ml.

Agar Eosina Azul de metileno Serine

Composición

Gelatina 10.0g

Fosfato Potasico 2.0

Agar 15.0

Lactosa 10.0

Eosina 0.400

Azul de Metileno 0.065

Agua 1000ml