PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y MÉTODOS DE AISLAMIENTO

Quesada Maria Laura (2124700), Cuevas Daniela Fernanda(2124660), Ballesteros

Isabela(2124672)

Universidad del Valle, Escuela de Ingeniería de Alimentos, Facultad de Ingeniería,

Laboratorio de Microbiología de Alimentos, Cali, Valle del Cauca, Colombia

RESUMEN

En esta práctica de laboratorio se preparó un medio de cultivo, el cual fue incorporado en las

cajas Petri y en los tubos. Se sembró Proteus spp por dilución sucesiva en medio agarizado.

Se realizó la siembra por estría por agotamiento en placa a partir de un cultivo mixto. Se

utilizó Staphylococcus aureus para la siembra en tubo con agar inclinado y para la prueba de

motilidad. Además, se incorporó el cultivo puro en el caldo nutritivo. Se observó el

comportamiento de las concentraciones de las colonias a partir de la siembra por dilución,

siembra por estría y siembra por agotamiento. En el tubo de agar inclinado se presentó un

crecimiento superficial filiforme. Por otra parte, en la prueba de motilidad se encontró que el

es microorganismo inmovil y en el caso del caldo nutritivo, se evidenció el crecimiento en

sedimento granular. Finalmente, se pudieron aplicar técnicas para la preparación de los

medios de cultivo, conociendo la importancia de sus componentes para el crecimiento

bacteriano.

Palabras clave: Medio de cultivo, aislamiento, crecimiento, puro, mixto.

 1. INTRODUCCIÓN

Se considera como medio de cultivo a aquella solución que proporciona nutrientes,

multiplica, aísla e identifica a los microorganismos bajo condiciones favorables. Los medios

de cultivo son de gran importancia en los análisis microbiológicos, pues las diferencias

referentes a la calidad entre un medio de cultivo y otro pueden determinar el éxito de

cualquier análisis dentro del laboratorio. Un mal procedimiento de preparación o un mal

control de los medios de cultivo pueden resultar determinantes en los resultados de

laboratorio, los cuales pueden ponerse en duda (Cerra, et al., 2013).

El estudio de las bacterias no puede llevarse a cabo si se consideran como individuos

aislados, sino como poblaciones debido a su pequeño tamaño. Estas poblaciones bacterianas

solo deben provenir de una sola célula, y para obtenerlas se da uso de los medios de cultivo

para que suministre los nutrientes y cantidades requeridas de lo pautado para que crezcan los

microorganismos acordados (Fernández, 2017).

A los cultivos de las poblaciones mixtas, es decir las poblaciones que se forman a partir de la

agrupación de varios tipos de microorganismos, se les confiere el nombre de cultivos mixtos.

La comprensión de estos microorganismos se obtiene a través del estudio de cepas aisladas,

cultivadas en cultivos puros. Es importante tener en cuenta que la identificación del

organismo y la caracterización completa puede obtenerse sólo tras el aislamiento de la

bacteria y la obtención de cultivos puros. Tras conseguir el aislamiento se facilita la

obtención de la bacteria en cultivo puro, sin embargo resulta problemático y dificultoso su

aislamiento del resto de microorganismos presentes (Santambrosio, Ortega & Garibaldi,

2009). Al separar las poblaciones de los microorganismos sembradas en la muestra se

desplaza una colonia de cada microorganismo a un cultivo esteril nuevo. Teniendo en cuenta
lo anteriormente mencionado a este tipo de cultivos se les considera “puros” pues poseen una

sola clase de microorganismo.

2. OBJETIVO GENERAL

Aplicar métodos bacteriológicos más usuales para el crecimiento, desarrollo y

aislamiento de microorganismos mediante la preparación de métodos de cultivo.

2.1. Objetivos específicos

● Determinar la importancia de los componentes aplicables para un crecimiento

bacteriano en distintos medios de cultivo.

● Aislar colonias bacterianas mediante la siembra de un cultivo mixto.

● Caracterizar los diferentes cultivos bacterianos sembrados en caldo de cultivo,

caja petri y agar inclinado.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Instrumentos y materiales utilizados

Para el desarrollo de esta práctica de laboratorio se utilizó: medios deshidratados comerciales

(marcas GranuCult y Scharlaus), agua destilada, Erlenmeyer, balanza, probeta, plancha de

calentamiento, cajas petri, tubos de ensayo, autoclave, asa bacteriológica, mechero, cultivos

bacteriológicos (Proteus spp, Staphylococcus aureus) y caldos de cultivos bacterianos (mixto

y puro).

3.2. Procesos

3.2.1. Preparación de medios de cultivo

Se prepararon dos medios de cultivo. Un medio sólido de agar nutritivo (marca GranuCult)

el cual se preparó con una proporción de 2,70 g para 134 ml de agua destilada, estas

cantidades se obtuvieron mediante el cálculo de la regla de tres teniendo en cuenta las

indicaciones del fabricante (20 g por cada litro de agua destilada).

Esta mezcla fue sometida al calor hasta que se tornó traslúcida, se vertieron 18 ml de solución

en 3 tubos de ensayo y 7 ml en otros dos. Los tubos junto con el excedente de agar nutritivo

en el Erlenmeyer se llevaron al autoclave durante 15 minutos.

De igual manera se preparó el medio líquido con caldo nutritivo (marca Scharlaus) el cual se

preparó con una proporción de 0,65 g para 50 ml de agua destilada, estas cantidades se

obtuvieron mediante el cálculo de la regla de tres teniendo en cuenta las indicaciones del

fabricante (13 g por cada litro de agua destilada). Los 50 ml de caldo nutritivo se dividieron

en 7 tubos de ensayo con 7 ml de solución para cada uno, se suministró un tubo a cada grupo

de laboratorio y posteriormente se llevó al autoclave durante 15 minutos.

3.2.2. Obtención de cultivos por dilución en agar

Después de que se esterilizaran los medios de cultivo en el autoclave se esperó a que se

enfriaran un poco. Para los cultivo por dilución se trabajó con los 3 tubos de ensayo con 18

ml de solución, con un asa previamente esterilizada se tomó un poco de muestra de una

colonia de Proteus spp, esta muestra se colocó dentro del tubo N°1 y se agitó suavemente; a

continuación se retiró el asa del tubo, sin esterilizar se sembró en el tubo N°2 y se agitó

suavemente; nuevamente se retiró el asa y sin esterilizar se continuó la siembra en el tubo

N°3 mezclando suavemente. Finalmente el contenido de cada tubo se vertió en cajas petri, se

sellaron y marcaron para ser llevadas a la incubadora.

3.2.3. Obtención de cultivos en superficie por siembra de estría

El excedente de agar nutritivo que se encontraba en el Erlenmeyer se distribuyó en 3 cajas

petri cada una con 18 ml, se dejó enfriar y se realizó la siembra con dos caldos de cultivos

bacteriológicos, uno mixto y uno puro. Con un asa previamente esterilizada se tomó muestra

del caldo de cultivo mixto, primero se realizó una siembra por estría y luego otra por

agotamiento. De igual forma en la tercera caja petri se realizó una siembra por agotamiento

del cultivo puro. Se sellaron y marcaron para ser llevadas a la incubadora.

 3.2.4. Prueba de siembra en tubo con agar inclinado

Para conseguir el medio de agar inclinado se ubicó uno de los tubos con 7 ml de agar

nutritivo con un ángulo inclinación. Posteriormente, con el asa previamente esterilizada se

tomó un poco de muestra de un cultivo de Staphylococcus aureus y se realizó una siembra en

forma de zig zag. Finalmente se flameó la boca del tubo y se tapó para llevarlo a la

incubadora

3.2.5. Prueba de motilidad en agar

En la prueba de motilidad, el tubo con agar nutritivo se solidifico de forma vertical. Con un

asa recta previamente esterilizada se tomó un poco de muestra de un cultivo de

Staphylococcus aureus, luego se introdujo de forma recta en el agar y lentamente se retiró. Se

flameó la boca del tubo y se tapó para llevarlo a la incubadora

3.2.6. Prueba de siembra en caldo de cultivo

Se tomó el tubo con los 7 ml de caldo nutritivo y con el asa esterilizada se tomó un poco de

muestra del caldo de cultivo bacteriano puro, se introdujo el asa al tubo y se agitó dentro del

caldo. Se flameó la boca del tubo y se tapó para llevarlo a la incubadora

4. RESULTADOS

4.1. Preparación de medios de cultivo

Al momento de destapar los envases con los medios deshidratados comerciales, en ambos

casos tanto con el de la marca GranuCult como el de la marca Scharlaus, se pudo percibir una

coloración amarilla, con texturas en polvo y de olor muy fuerte.

 Figura 1. Solución de agar nutritivo

4.2. Obtención de cultivos por dilución en agar

En la Figura 2 se puede observar las tres disoluciones solidificadas e incubadas con el cultivo

bacteriano de Proteus spp. En la primera caja petri correspondiente al cultivo de 10-1 no fue

posible observar separación de colonias, este cultivo tenía una superficie mate e invasiva. En

la segunda caja petri con el cultivo de 10-2 ya se puede apreciar la separación de las colonias

y su formación en gran cantidad. En la tercera caja petri con el cultivo de 10-3 se observaron

más de 300 colonias lo que no hace irrealizable el conteo para la determinación de UFC,

además en este cultivo se identificó la forma puntiforme y los bordes enteros de las colonias.

Figura 2. Cultivos por dilución en agar de Proteus spp; 10-1, 10-2 y 10-3 respectivamente

4.3. Obtención de cultivos en superficie por siembra de estría y agotamiento

Se realizaron tres cultivos sembrados en superficie. En la figura 3 se puede observar el

cultivo mixto obtenido por siembra de estría en los 4 extremos de la caja petri, en el extremo

1 se ve como hay gran concentración de bacterias por lo que no es posible identificarlas, en el

extremo 2 se ve como disminuye esta concentración y hay separación de las colonias, en los
extremos 3 y 4 no se observó el desarrollo de colonias. En la figura 4 se observa la siembra

de cultivo mixto por agotamiento, en esta se logró observar levemente la separación de las

colonias.

En la figura 5 se observa la siembra del cultivo puro por agotamiento, como es evidente en la

figura este cultivo se contaminó por errores cometidos al momento de preparar el medio de

cultivo, se pueden identificar 2 tipos de colonias que crecieron en el cultivo.

Figura 3. Siembra por estría de cultivos mixto en caja petri

Figura 4. Siembra por agotamiento de cultivo mixto en caja petri

 Figura 5. Siembra por agotamiento de cultivo puro en caja petri

4.4. Prueba de siembra en tubo con agar inclinado

En la figura 6 se puede apreciar la siembra del cultivo de Staphylococcus aureus en agar

inclinado, este presentó un crecimiento superficial filiforme a lo largo de la línea de

inoculación pero efuso con una coloración blanquecina.

Figura 6. Siembra de cultivo en agar inclinado

4.5. Prueba de motilidad en agar

En la figura 7 se puede observar el comportamiento del cultivo de Staphylococcus aureus en

la prueba de motilidad, determinando que se trata de un microorganismo inmovil.

 Figura 7. Prueba de motilidad Staphylococcus aureus

4.6. Prueba de siembra en caldo de cultivo

En la figura 8 correspondiente al caldo nutritivo con el cultivo puro se apreció el crecimiento

en sedimento granular.

Figura 8. Siembra en caldo de cultivo

5. DISCUSIÓN

La técnica más utilizada para la obtención de colonias aisladas es por diseminación en

superficie. Técnica basada en la extensión de la muestra de cultivo en la superficie del medio

agarizado y posteriormente sometida a incubación. La muestra del cultivo del

microorganismo utilizado (Proteus spp) se sembró por dilución sucesiva, de la que se

obtuvieron colonias aisladas (Figura 2). Tras el periodo de incubación las colonias pudieron

ser reconocidas en la superficie del medio sólido y se pudo observar que el número de

colonias presenta una notable disminución al ir el factor de dilución en aumento. Teniendo en

cuenta lo observado en la figura 2, las concentraciones de los microorganismos disminuyen

cuando el factor de dilución es menor al inicial, debiéndose a la finalidad misma de las

soluciones sucesivas la cual es lograr menores concentraciones de microorganismos de la

solución inicial (Cultivo de microorganismos, 2019).

La siembra por estría es un método de aislamiento de microorganismos por agotamiento, en

el caso de esta práctica se realizó a partir de un cultivo mixto de laboratorio. Este método está

basado en arrastrar con un asa, un número cada vez más pequeño de individuos. El objetivo

es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas

distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa (Domenech et al., 2009). En la

figura 3 podemos apreciar este comportamiento, en el extremo 1 se puede observar gran

concentración de bacterias y por esa razón es más difícil la diferenciación de colonias, por el

contrario, en el extremo 2 el número de individuos disminuye y está menos concentrado. A

partir de esto es más sencillo identificar las colonias que forman las bacterias del cultivo

mixto y es posible realizar una descripción de la morfología, por un lado, tenemos las

colonias del tipo 1 que son de forma circular, borde entero, color amarillo claro, convexa,

superficie lisa, brillante, cremosa y se presenta en menor proporción que las colonias del tipo

2 que tiene forma irregular, borde entero, color blanco, elevadas, con superficie lisa, brillante,

cremosa y en mayor proporción. Este es el principal método para obtener cultivos puros a

partir de muestras líquidas con varios organismos como fue el caso del cultivo mixto

(Madigan et al., 2015).

Por otro lado, se realizó la siembra del mismo cultivo mixto por agotamiento como se ve en

la figura 4, en este caso el resultado del aislamiento no fue tan efectivo como en el de

siembra por estría, no hubo una buena separación de las colonias lo que hizo más difícil su

identificación. Por lo general la técnica por agotamiento es más efectiva con cultivos puros ya

que en medios sólidos se inmovilizan las células y les permiten crecer y formar colonias más

visibles y aisladas (Madigan et al., 2015). Pero teniendo en cuenta esta afirmación se puede
inferir que el resultado obtenido en la siembra por agotamiento del cultivo puro

correspondiente a la figura 5 es erróneo ya que el cultivo se encuentra contaminado, se

observa la presencia de otra colonia (colonia 1) diferente a la que se sembró principalmente

correspondiente al cultivo puro (colonia 2), esta contaminación se puede deber a factores

externos como la exposición al aire, pero en este caso sucedió por un error cometido al

momento de preparar el medio de cultivo que se transfirió de forma incorrecta en la caja

petri, este tipo de contaminación sería por manipulación y de fácil detección ya que en este

caso generó otra colonia fácilmente identificable (Otero, 2014).

En la figura 6 se observa la siembra de Staphylococcus aureus en agar inclinado, este

crecimiento superficial filiforme se presentó positivo a lo largo de la línea superficial de

inoculación encontrándose efuso, se trataría de un organismo no criogénico debido a su

coloración blanquecina. La siembra en tubo con agar inclinado es una técnica que permite

aumentar la superficie en donde se va a producir un crecimiento bacteriano, este al ser

sembrado en zig-zag puede observarse el tipo de crecimiento presente en la siembra, pero no

presenta las mismas características que en una caja petri,lo cual dificulta la identificación y

visualización de las bacterias sin embargo es útil para la conservación de las bacterias las

cuales pueden ser visualizadas en el microscopio (López Tévez & Torres, 2006). Lo cual no

es posible continuar con la caracterización de la colonia sembrada en la práctica realizada

debido a que no es medio indicado para ello, pero si para la conservación de la bacteria.

Se puede observar el comportamiento de Staphylococcus aureus en la figura 7, este se

presenta como un organismo inmovil debido a la caracteristica que se presenta; crecimiento

solo en la línea de siembra y el medio circundante se mantiene claro, lo que indica que el

microorganismo sembrado en el agar nutritivo por punción no presenta la presencia de

flagelos. Según (Montoya, 2008)se afirma que si las bacterias no poseen flagelos, su

crecimiento se limita únicamente al lugar o trayecto donde se realizó la punción, si por el

contrario son flageladas, su crecimiento además de aparecer en el trayecto de la picadura, se

extiende por todo el medio de cultivo, incluso en la superficie.

En la figura 8 se puede observar el caldo de cultivo puro reflejando un crecimiento en

sedimento granular. El crecimiento de microorganismos en un caldo de cultivo puede darse

de diferentes tipos, un ejemplo de esta son las bacterias aerobias estrictas que necesitan de un

ambiente que contenga oxígeno para poder desarrollarse, en este caso se observaría su

presencia sobre el agar nutritivo del tubo. También puede ser del tipo bacterias anaerobias

estrictas que para crecer requieren un medio de cultivo sin oxígeno, por lo tanto, estas solo se

desarrollan en el fondo del tubo (Rojas Triviño, 2011), lo que indica que el microorganismo

puro sembrado en el caldo de cultivo es una bacteria anaerobia estricta.

6. CONCLUSIONES

● El método de siembra que se le realice a una bacteria va a depender de la necesidad o

resultado que se desee esperar.

● La siembra por medio de punción es utilizado para la movilidad de la bacteria

mediante la presencia de flagelos

● La técnica de siembra por estría permite aislamiento de microorganismo a partir de

muestras líquidas con varios organismos.

● El método del caldo de cultivo se emplea si es necesario un crecimiento bacteriano

rápido o la preservación del mismo.

● El método de disolución en superficie permite disminuir la concentración del

microorganismo a medida que aumenta el favor de disolución.

 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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cultivo en un laboratorio de microbiología.

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Domenech, A., López, A., Oliver, A., & Ramírez, A. (2009). Prácticas de microbiología

Fernández, O. (2017). Cultivos de Bacterias. Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de La

Salud, Universidad Nacional de La Patagonia San Juan Bosco, 385–388.

López Tévez, L., & Torres, C. (2006). El tamaño, forma y tipos de agrupaciones bacterianas.
Universidad Nacional Del Nordeste, Facultad de Agroindustrias.

Madigan, M., Martinko, J., Bender, K., Buckley, D., & Stahl, D. (2015). Medios de cultivo y
laboratorios. In BROCK Biología de los microorganismos (14th ed., Vol. 1, pp. 81–82)

Montoya V., H. H. (2008). Microbiología básica para el área de la salud y afines. 2.a edición.
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Rojas Triviño, A. (2011). Conceptos y Práctica de Microbiología General.

Otero, J. (2014). Tipos de contaminación en cultivos celulares y su prevención.

Santambrosio, E., Ortega, M., & Garibaldi, P. (2009). Siembra y recuento de

microorganismos. Universidad Tecnológica Nacional, Cátedra de Biotecnología, 1, 1–9.