ESPECTROS DE ABSORBCIÓN Y CURVA DE CALIBRACIÓN DE LOS COLORANTES

Rojo Congo, Azul de metileno y Verde malaquita

Forero. N1, Ciro. J2, Artunduaga. L3, Murcia. R4, Cuellar. E5
Universidad de la Amazonia. Facultad de Ciencias Básicas. Programa de Biología. Biología
Molecular. Florencia – (Caquetá). Colombia
RESUMEN
La espectrofotometría tiende a basarse en la capacidad con la que cuentan los compuestos para poder
llegar a absorber de manera selectiva la luz en lo que sería la luz ultravioleta para nuestro caso, dicho
método fue utilizado para lograr medir la cantidad de diferentes colorantes (verde malaquita, azul
metileno, rojo congo) en 5 ml de solución stock; para poder llevar a cabo esto, se prepararon 5
disoluciones en proporción 1:100 para cada colorante, determinando en el espectrofotómetro primero la
longitud de onda de cada uno de los colorantes, luego se determinó el punto de absorbancia de cada uno.
Con esta herramienta, se encontró la absorbancia de cada uno de las disoluciones, lo que facilitó el poder
correlacionar la concentración con la absorbancia, y con base en este se hizo la curva de calibración de
cada uno de los colorantes. Debido a ello, se pudo constatar la regresión lineal, que arrojó que el colorante
rojo congo presentó una concentración de 0,0808 mM, el azul metileno de 0,0655 mM y el verde
malaquita de 0,0073 mM. Los resultados variaron con la ley de Beer-Lambert , otra forma de hallar
concentración; para el rojo congo se obtuvo una concentración de 0,0089 Mm, el Azul de metileno fue
de 0,011 Mm y el verde malaquita dio 0,0103 mM, comparando estos resultados , se logró obtener una
ecuación de la función recta, donde se pudo determinar la concentración de la solución problema que
presentaría las mismas características que las disoluciones analizadas.

INTRODUCCIÓN

En el área química, la espectrofotometría es usada para poder medir cuantitativamente la reflexión o

permeabilidad que pueda poseer un material, ligada a la longitud de onda. La espectroscopia
electromagnética puede llegar a ser mucho más específica debido a que en comparación a la
espectrofotometría está se ocupa mucho más de lo que sería la luz visible, la radiación infrarroja y la UV
cercana (Cortez, 2020). En el área de Biología molecular, los espectrofotómetros son usados para poder
llegar a examinar las soluciones de muestras tales como las proteínas, los ácidos nucleicos y hasta las
células de cualquier muestra biológica, estas cuentan con un volumen ya sea de alta concentración o muy
limitado, lo que probablemente resulta generando grande problemas, en los últimos años se ha logrado
observar que ha existido un crecimiento que se ha dado exponencialmente, debido a la gran cantidad de
dispositivos que facilitan la medición de la absorción en nivele que no logran superar a los microlitros
(Cubas et al., 2018).

A la hora de querer deducir cual es el mejor método para poder llegar a medir en la espectrofotometría,
se tiene que hallar primero cuales son las características base porque ‘’se puede confundir los volúmenes
bajos con las concentraciones bajas, lo que por razones acertadas, arrojan datos dudosos, por tal razón es
sumamente importante poder llegar a comprender y hacer uso de la ley B.Lambert, que es útil a la hora
de realizar los análisis espectrofotométricos y totalmente importante a la hora de hacer uso de
biomoléculas, de las que en mayoría logran llegar a absorber luz’’ (Roca García, 2019). La concentración
de una sustancia es considerada como directamente proporcional a la luz absorbida por la muestra e
inversamente proporcional a lo que sería la luz transmitida. La absorbancia cambia de manera lineal con
la concentración (García et al., 2008).

En el espectrofotómetro de rayos ultravioleta la luz pasa por medio de un prisma y luego por la rendija,
que puede llegar a resaltar regiones estrechas de frecuencias, sumado a esto, la luz puede pasar por medio
de una cubeta, en este caso es un recipiente con las paredes transparentes y paralelas que se logra llenar
con la solución que sería usada de prueba, para luego entrar en una fotocélula (Ramos Ascue, 2018). La
espectrofotometría es usada a gran escala en los rangos ultravioleta para lograr determinar los
compuestos coloreados en metales, tanto y como en diferentes sustancias, tales como el As y P,también
para lograr determinar los grupos más funcionales de los fenoles y los distintos compuestos que poseen
múltiples enlaces químicos (Moreno et al., 2021). Los colorantes poseen grupos metilo (en la molécula,
lo que les permite formar cadenas de doble dobles enlaces conjugado con átomos impares en números
de carbono, entre lo que serían los grupos donadores y aceptores de electrones terminales. Los colorantes
poseen una amplia gama de usos industriales, en Biología molecular son usados de indicadores ópticos
puesto a que poseen afinidad con algunos tejidos celulares.

RESULTADOS
1. Preparación de reactivos:
Se emplearon los colorantes: Rojo Congo, Azul de Metileno y Verde Malaquita, donde se les realizó
búsqueda literaria sobre las longitudes de onda para cada una, de los cuales se realizaron soluciones
stock a una concentración 0,1M en 5 mL de etanol, la cantidad para la preparación de cada solución
se realizó empleando estequiometria en donde se relacionó: volumen de solución final, conversión
mL a L, concentración de la solución final en 1 L y peso molecular. Posteriormente se prepararon 5
disoluciones en proporción 1:100, empleadas en espectroscopia para la determinación de sus
espectros de absorción.

2. Determinación de espectros de absorción:

Preparadas las disoluciones se destinaron para la determinación de su punto máximo de absorbancia

en el espectrofotómetro, para ello se calibró el instrumento utilizando etanol en la cubeta de muestra,
posterior a ello se agregó una muestra de cada disolución preparada, sin embargo, se realizó lectura
únicamente a las disoluciones con proporción 1:100. La gráfica 1 refleja los picos máximos de
absorbancias por cada colorante y en base a ello se determinó la absorbancia de cada disolución por
colorante (Tabla 1, 2 y 3).

3. Curvas de calibración:

Determinada la absorbancia para cada una de las disoluciones empleadas por los tres colorantes, se
realiza una relación de concentración-absorbancia en gráficas para su adecuada correlación y para la
determinación de valores en la ecuación correspondiente a recta, la curva de cada colorante se refleja
en las gráficas 2, 3 y 4

Grafica 1. Picos de absorbancia para los colorantes, rojo Congo, azul de metileno y verde malaquita.

Tabla 1. Absorbancia Teóricos / Experimental (nm)

 Picos de Absorbancia Experimental
Colorantes Picos de Absorbancia Teorico (nm) (nm)
Rojo Congo 497/498 503
Azul de Metileno 664/665 661
Verde Malaquita 616/620 621

Tabla 2. Absorbancias determinadas para las disoluciones del colorante rojo congo, empleando el
pico de absorbancia evidenciado a los 503 nm

ROJO CONGO
Concentración (M) Absorbancia
0,1 0,475
0,01 0,145
0,001 0,099
0,0001 0,088
0,00001 0,081
Grafica 2. Curva de calibración de acuerdo a las 5 disoluciones del colorante Rojo Congo

y = 3.8425x + 0.0922
ROJO CONGO R² = 0.9968
0.6
0.475
0.5
ABSORBANCIA

0.4
0.3
0.081
0.20.088 0.145
0.10.099
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
CONCENTRACIÓN (M)

Tabla 3. Absorbancias determinadas para las disoluciones del colorante azul de metileno, empleando
el pico de absorbancia evidenciado a los 661 nm

AZUL DE METILENO
Concentracion Absorbancia
0,1 0,991
0,01 0,462
0,001 0,138
0,0001 0,109
0,00001 0,073
 Grafica 3. Curva de calibración de acuerdo a las 5 disoluciones del colorante azul de metileno

AZUL DE METILENO y = 8.4474x + 0.1669

R² = 0.903
1.2 0.991
1
ABSORBANCIA

0.8
0.6 0.462
0.4
0.138
0.109
0.20.073
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
CONCENTRACIÓN (M)

Tabla 4. Absorbancias determinadas para las disoluciones del colorante verde malaquita, empleando el
pico de absorbancia evidenciado a los 621 nm

VERDE MALAQUITA
Concentracion Absorbancia
0,1 0,875
0,01 0,729
0,001 0,198
0,0001 0,106
0,00001 0,099

Grafica 4. Curva de calibración de acuerdo a las 5 disoluciones del colorante verde malaquita

VERDE MALAQUITA y = 6.6038x + 0.2546

R² = 0.6033
1 0.875
0.729
0.8
ABSORBANCIA

0.6

0.4
0.198
0.106
0.20.099

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
CONCENTRACIÓN (M)
 4. Solución problema:

Obtenida las curvas de calibración se procede a emplear el método en función matemática de

regresión lineal o la ecuación propuesta en la ley de Beer-Lambert, con ello se determina de dos
maneras diferentes las concentraciones de las soluciones problema, soluciones realizadas con
concentraciones aleatorias de cada colorante. La absorbancia de cada solución se expresa en la tabla
5, dato necesario para la determinación de su concentración real.

Tabla 5. Absorbancias de las soluciones problema determinadas por medio de espectrometría.

Solución problema Absorbancia

Rojo Congo 0,403
Azul de metileno 0,721
Verde de malaquita 0,303
Tabla 6. Concentración y valores derivados de la Ecuación de regresión lineal para cada uno de los
colorantes de la solución stock

Rojo Azul de Verde

Ecuaciacion Variables Congo Metileno Malaquita
y = Absorbancia 0,403 0,721 0,303
Y= m*x + b
m = Pendiente 3,8425 8,4474 6,6038
Despejando
b = Punto corte con eje
x
Y 0,0922 0,1669 0,2546
X = (y -b) /
x = Concentración
m
(mM) 0,08088 0,06555 0,00732

Rojo Congo Azul de Metileno Verde Malaquita

0,403 0,721 0,303
45000 65000 29300
1cm 1cm 1cm
 0,0089 Mm 0,011mM 0,0103 mM
Tabla 7. Concentración y valores derivados de la Ecuación de Beer- Lamber para cada uno de los
colorantes de la solución problema.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en esta práctica de laboratorio podemos observar en la
grafica 1 y Tabla 1 los picos de absorbancia experimental para los colorantes cuyos valores
corresponden a , rojo Congo (503 nm) , azul de metileno (661nm) y verde malaquita (621 nm) obtenidos
mediante el barrido espectral , donde se realizó una comparación respecto a los valores teóricos rojo
Congo (497/498 nm) , azul de metileno (664/665nm) y verde malaquita (616/620 nm) buscado una
mayor exactitud en la lectura del espectrofotómetro; Un haz de luz está compuesto por diferentes
longitudes de onda que pueden estar entre los 400 y los 700nm. Aquellas longitudes de onda que se
encuentran dentro del rango entre los 400-700nm pertenecen a una región visible que por su parte afectan
la retina y es lo que provoca la visualización de las gamas de colores. Si bien se menciona que la energía
de la radiación es inversamente proporcional a su longitud de onda, por lo que los rayos visibles presentan
menor energía que los rayos ultravioletas, pero mayor energía que los rayos infrarrojos. (Lorenza, 2019)
Dichas longitudes de onda son correspondientes a un máximo de absorción, en este punto se presenta
una máxima sensibilidad.

Teniendo en cuenta las curvas de calibración (grafica 2,3,4) de los respectivos colorantes se realizó una
relación entre absorbancia y concentración de cada disolución en los diferentes colorantes se obtiene una
ecuación de la función recta, en donde al extrapolar los datos se puede determinar la concentración de
una solución problema que presente las mismas características que las disoluciones analizadas. En donde
Y y X hacen referencia a los valores absorbancia y concentración respectivamente; m representa la
pendiente y b el punto en donde la recta intercepta. Debido a que las absorbancias de las soluciones
problema ya se han establecido previamente, se requiere conocer las concentraciones de dichas
soluciones. En los datos presentes a tener en cuenta el R2 viene siendo el control estadístico para la curva
de calibración, este valor debe ser lo más cercano a 1, por lo que los datos arrojados para los colorantes
respectivamente fueron de Rojo Congo 0.9968, Azul de Metileno= 0.903, Verde Malaquita= 0.6033por
lo que, la sensibilidad del método no es exacta teniendo en cuenta que el coeficiente de correlación
optimo tendría que estar cercano a 1, sin embargo los datos no están tan inferiores al dato esperado, el
más lejano seria el verde malaquita, este colorante presenta una leve tendencia a subir, sin embargo el
coeficiente es casi la mitad por lo que no se esperaría que se utilizara este dato pues no presente una
calidad en la tendencia. (Hardesty, 2010)

Por otra parte en la tabla 7 la ecuación de Beer-Lambert permite determinar las concentraciones de cada
solución problema empleando variables estándar como el coeficiente de absorción molar, la cual se
considera como una constante y fue dado por la Monitora de acuerdo a datos en la literatura; la
absorbancia de cada solución y la longitud de onda máxima. En donde A representa Absorbancia, ε
constante de absorcion molar, C concentración y λ longitud de onda máxima. De acuerdo a ello se debía
determinara la concentración; la cual fue par Rojo Congo 0,0089 Mm, Azul de Metileno= 0,011mM,
Verde Malaquita=0,0103 mM. En esta ley observamos que, el tipo de sustancia que atravesara la luz va
a depender de la distancia que recorre la luz y la concentración de la sustancia.

CONCLUSIÓN
Se logró obtener el espectro de la absorbancia de los colorantes y establecer de este modo la curva de
calibración, la cual permitió determinar la concentración de la muestra problema, todo lo anterior se
realizó teniendo en cuenta las absorbancias que emiten cada una; la cual consistió en el análisis a partir
de la captación de la longitud de onda que genere cada compuesto y así se produjeron datos cuantitativos.

Referencias

• Cortez, P. M. M. (2020). Los principios de la espectroscopia de infrarrojo. Principios y

aplicaciones de la espectroscopia de infrarrojo en el análisis de alimentos y bebidas (2020).
Guadalajara, Jalisco: CIATEJ.
• Cubas, J. M., Pimentel, R. G. C., Merlín, I. E. M., & Martínez, E. S. M. (2018). La espectroscopia
UV-Vis en la evaluación de la viabilidad de células de cáncer de mama. Latin-American Journal
of Physics Education, 12(2), 7.

• Hardesty, J. (2010). Spectrophotometry and the Beer-Lambert Law: An Important Analytical

Technique in Chemistry. Jon H. Hardesty, PhD and Bassam Attili, PhD Collin College
Department of Chemistry, http://vfsilesieux.free.fr/1Seuro/BeerLaw.pdf.

• Invernizzi, F., D’Amato, I., Jensen, P. B., Ravaglia, S., Zeviani, M., & Tiranti, V. (2012).
Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion,
12(2), 328–335. https://doi.org/10.1016/j.mito.2012.01.001
• Roca García, A. A. (2019). Estudio comparativo del poder biosorbente de la cáscara de naranja y
hojas de Neem para la remoción de colorantes en soluciones acuosas (Doctoral dissertation,
Universidad de Guayaquil. Facultad de Ciencias Químicas).
• García, Y., Núñez de Villavicencio, M., Rodríguez, J. L., Borrego, I., & Cruz, L. (2008). Efecto
de los parámetros en la extracción alcalina de colorante de bija. Parte 1.
• García, R. D. (2018). Instrumentos que revolucionaron la química: la historia del
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• Ramos Ascue, J. D. (2018). Medición en línea de la DQO mediante correlación del coeficiente
de absorción espectral de luz uv. Producción+ limpia, 13(2), 67-76.
• Moreno, W. X. I., Logroño, J. P. A., & Brito, J. M. N. (2021). Técnicas espectroscópicas
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profesional, 6(9), 45-58.