Código: PL-007

PROCEDIMIENTO OPERATIVO
Rev. No. 04
DETERMINACION DE TRAZAS
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1. OBJETO

 Establecer el procedimiento de validación de metodología analítica por

HPLC para la determinación de trazas de principios activos en superficies
(áreas o equipos).

 Establecer los pasos a seguir para determinar trazas de principios activos en

áreas y/o equipos después de la limpieza.

2. DEFINICIONES

No aplica.

3. CONDICIONES GENERALES

Una vez solicitado el servicio de análisis de trazas, el Coordinador de área

responsable evaluará si existe metodología validada para el análisis. En caso
de que no exista, deberá junto con el Director Técnico establecer si la
metodología para el análisis de producto es aplicable.

Todas las trazas analizadas deben estar validadas por Quasfar.

Cuando no se cuente con validación, el Coordinador del área debe asignar el

analista responsable de la validación de la metodología.

FECHA DE EDICION: FECHA DE REVISION: FECHA DE APROBACION:

13-07-15 13-07-16 13-07-16
ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR:
Andrés Monroy Adriana Arrieta Luis José León
Coordinador de Laboratorio Gerente de Aseguramiento de Calidad Director Técnico
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4. PROCEDIMIENTO

4.1. RECOMENDACIONES GENERALES

 Para la preparación de la muestra de hipoclorito de sodio (NaClO) se debe

tener en cuenta que en presencia de ácidos libera Cloro que interfiere con
los análisis. Por lo tanto, cuando el diluyente ó la fase móvil del análisis
tenga naturaleza ácida, la solución del hipoclorito se debe realizar en agua.

 En el análisis de trazas siempre se deben ensayar los estándares de límite

de cuantificación para garantizar que la respuesta instrumental sea superior
al ruido del equipo y el cumplimiento del RSD.

 Para disminuir la probabilidad de interferencias en la cuantificación del

principio se debe realizar una inspección rigurosa de la muestra antes de
proceder a prepararla. En la inspección se debe evaluar: la clase de hisopo
(madera ó plástico), la presencia de partículas, suciedad, entre otros. Si el
hisopo es de madera el análisis no es viable.

4.2. VALIDACION DE METODOLOGIA ANALITICA

Una vez establecida la metodología y el analista, se procederá a desarrollar la

validación de esta, aplicada a la detección de trazas, evaluando los siguientes
parámetros en el siguiente orden:

 Especificidad/Selectividad
 Límite de cuantificación
 Precisión del sistema
 Límite de detección
 Porcentaje de recuperación
 Linealidad
 Estabilidad de la muestra
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4.2.1. Especificidad/Selectividad

Se debe realizar sobre muestras de detergentes, sanitizantes, desinfectantes e

hisopos utilizados durante la limpieza, con la finalidad de establecer que estos
no interfieren en el análisis del principio activo.

 Preparar un estándar del principio activo a evaluar en una concentración

de 10 ppm.
 Preparar las soluciones de detergentes sanitizantes y desinfectantes a una
concentración de 1%.
 En el caso de hisopos, tomar un hisopo limpio, colocarlo en un tubo de
ensayo con 5,0 ml del diluyente y agitar durante 15 minutos en el
ultrasonido.
 Filtrar las soluciones por membrana de 0,45 micras.
 Inyectar la solución filtrada y el estándar directamente.
 Comparar el tiempo de retención del estándar con las respuestas
presentadas por las soluciones evaluadas. El método es específico si la
diferencia en los tiempo de retención es mayor de tres minutos; si es
menor, mezclar en partes iguales estándar de cuantificación y solución e
inyectar ajustando la fase móvil hasta obtener una resolución igual o
mayor a dos (2,0). El factor de retención no debe ser menor de 3,0.

4.2.2. Límite de cuantificación

 Inyectar la solución del estándar preparado para especificidad.

 Evaluar la respuesta obtenida que deberá ser como mínimo 10 veces el
ruido instrumental. De lo contrario, proceda a incrementar la concentración
en factores de 1,5 hasta obtener la respuesta deseada.

Para principios activos cuya concentración en la forma farmacéutica final sea

menor o igual a 10 ppm, el límite de cuantificación se debe ajustar a la
sensibilidad del método.
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4.2.3 Precisión del sistema

 Inyectar cinco (5,0) veces el estándar de límite de cuantificación.

 Determinar el promedio y el RSD de las respuestas obtenidas. La
desviación estándar relativa debe ser menor a 2,0%

4.2.4. Límite de detección

 Realizar una dilución de 1:10 de la concentración establecida como límite

de cuantificación e inyectar. Inyectar por duplicado
 Verificar que el pico se diferencie del ruido instrumental y la respuesta sea
1/10 +/- 20% de la respuesta obtenida para la solución de concentración
100% del límite de cuantificación.

Si las condiciones anteriores no se dan ensayar una dilución 1/5 o 1/3 y

verificar que la respuesta sea proporcional.

4.2.5. Porcentaje de recuperación

 Pesar 10 mg del principio activo a evaluar y dispersarlos de manera

homogénea sobre una superficie de 100 cm2
 Recoger la mayor cantidad de activo posible con hisopos humedecidos con
el diluyente.
 Colocar los hisopos en un tubo de ensayo y adicionar 10,0 ml de diluyente.
Agitar en el ultrasonido durante 15 minutos.
 Filtrar por membrana de 0,45 micras, diluir hasta obtener una concentración
igual a la del estándar de límite de cuantificación e inyectar por duplicado.
 Determinar el porcentaje (%) de recuperación mediante la fórmula:

Am x Pst x P x D
% recuperación 
Ast x Pm
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Donde:

Am: Lectura de la muestra

Ast: Lectura del estándar
Pst: Peso del estándar de la solución de límite de cuantificación
D: Factor de dilución: 5/dilución del estándar
P: Potencia del estándar en porcentaje
Pm: Peso del principio activo tomado para distribuir en la placa

Para Vitrofarma este parámetro debe ser determinado por triplicado.

Criterio de Aceptación: Porcentaje de recuperación Mayor al 60%

4.2.6 Linealidad:

Se debe evaluar la proporcionalidad de la respuesta en un rango del 60 al

140% del límite de cuantificación establecido.

 Una vez establecido el límite de cuantificación, preparar soluciones del

estándar a 60, 80, 100, 120 y 140% siendo el 100% la concentración
establecida como límite de cuantificación, e inyectar por duplicado.

Criterio de aceptación r mayor a 0,99

4.2.7 Estabilidad

4.2.7.1 Estabilidad del estándar: Se debe determinar la estabilidad del

principio activo, almacenando un estándar equivalente al límite de
cuantificación a temperatura ambiente durante 24 horas.

4.2.7.2 Estabilidad del activo en la matriz: Se debe establecer la estabilidad

del principio activo en el hisopo o solvente empleado para la toma de muestra.
Se reconstituye el hisopo previamente enriquecido con una cantidad de
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principio activo conocido y se almacena a temperatura ambiente durante 24

horas.

Comparar respuesta instrumental contra un estándar recién elaborado.

Límite de aceptación 90-100%

4.3. DETERMINACION DE TRAZAS

4.3.1. Preparación de estándares de Límite de cuantificación y detección

Proceder como se describe en los numerales 4.2.2 y 4.2.4.

4.3.2. Preparación de las muestras

 Para aguas de lavado, filtrar las muestras por membrana de 0,45 micras e
inyectar directamente.

 Para hisopos, colocar cada una de las muestras en tubos de ensayo con 5,0
ml de solvente y agitar en el ultrasonido durante 15 minutos.

 Filtrar por membrana de 0,45 micras e inyectar por duplicado.

 Determinar el contenido de activo mediante la fórmula:

Am x Pst x P x D x 10
µg de activo / muestra 
Ast

Donde:

Am: Lectura de la muestra

Ast: Lectura del estándar
Pst: Peso del estándar de la solución de límite de cuantificación
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D: Factor de dilución: 5/dilución del estándar

P: Potencia del estándar en porcentaje*

* Si la potencia del estándar esta dada en µg/mg, en el numerador se elimina el

factor de 10. Si la potencia esta dada en UI/mg, en el numerador se elimina el
factor de 10 y los resultados serán UI/muestra.

OBSERVACION: en caso que las muestras de trazas evaluadas presenten una

respuesta instrumental en tiempos de retención diferentes a los establecidos
para el principio activo evaluado, blanco de hisopo, blanco de diluyente,
blancos de detergentes, blanco de sanitizantes y/o blanco de agentes
desinfectantes, se debe notificar al cliente para que este investigue la
naturaleza del compuesto detectado y/o establezca las acciones a seguir para la
determinar la identificación del mismo.

5. DIRIGIDO A

Los analistas que determinen trazas de activos, Coordinador de laboratorio y

Director Técnico.

6. FRECUENCIA DE USO

Cada vez que se validen o determinen trazas de activos.

7. REFERENCIAS

 PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology. Vol. 52, No. 6.

November - December, 1998, Supplement.
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 LEBLANC, Destin A. “Establishing scientifically justified acceptance

criteria for cleaning validation of finished drug products”. En:
Pharmaceutical Technology. USA, October 1998.

 APIC, Guidance on aspects of cleaning validation in active pharmaceutical

ingredients plants. December 2000.

 Nowafak Nassani, Institute of Validation Technology. Cleaning Validation

in the pharmaceutical Industry. 2005.

 FDA, Validation of Cleaning Processes (7/93). GUIDE TO

INSPECTIONS VALIDATION OF CLEANING PROCESSES

8. CONTROL DE VERSIONES

REVISION CAMBIOS REALIZADOS NUMERAL

Se incluyen los parámetros de linealidad y estabilidad 4.2
Se establece procedimiento para la preparación de 4.3
estándares y muestras
Se incluye el criterio de aceptación para el porcentaje de 4.2.5
recuperación.
02 Se incluye observación del análisis para vitrofarma.
Se amplía el alcance del procedimiento a DT y 5
coordinadores
Se actualizan las referencias 7

Se incluye cuadro de control de versiones 8