· Integrantes: Samantha Hernández 20152030527,

Ana Lucía Vásquez 20162030456,

Ana Sabillón 20162031342.

· Fecha de entrega: viernes, 16 de octubre del 2020.

· Asignatura: Bioquímica.

· Laboratorio de Bioquímica

· Sección: 1800.

· Asignación: Reporte II: Cromatografía de proteínas

· Instructor: Omar Mejía.

Objetivos

Objetivo general

Analizar algunos de los diferentes tipos de cromatografía de proteínas.

Objetivos específicos

1. Aprender la correcta implementación de las técnicas cromatográficas de

intercambio iónico y exclusión molecular, utilizando un simulador en línea.

2. Realizar una comparación a profundidad de las diferencias entre las técnicas y

sus similitudes, analizando la eficiencia de las matrices cromatográficas
utilizadas para ambas técnicas.
Resumen

La práctica de Cromatografía de proteínas fue ejecutada en dos partes:

Para la primera parte, exclusión molecular, con ayuda del simulador fueron separadas
determinadas proteínas luego de escoger un pH, un tampón y una matriz cromatográfica
aleatorios. Se realizaron varias mediciones en las que iban variando las matrices
cromatográficas de tipo Superdex y Sephacryl en conjunto con los tampones a manera
de obtener distintos cromatogramas. El proceso fue repetido un total de nueve veces.

Para la segunda parte, intercambio iónico, en esencia se realizó el mismo proceso que en
la primera parte en donde varían las matrices cromatográficas y los tampones para cada
medición realizada; la diferencia reside en el tipo de matrices utilizadas (DEAE-
celulosa y CM- celulosa) para las seis mediciones que se hicieron y de cada una se
obtuvo un cromatograma diferente.
Procedimiento experimental.

Parte I. Exclusión Molecular.

1. En el simulador, se seleccionó la matriz cromatográfica.

2. Seguidamente se escogió el tampón a un pH cualquiera.
3. Se cargó la muestra en la columna cromatografía.
4. Se inició el proceso de separación por medio de la cromatografía.
5. Se detuvo la cromatografía cuando las proteínas se habían separado.
6. Se repitió este proceso con diferentes matrices cromatográficas y tampones.

Resultados.

Se obtuvieron los siguientes cromatogramas:

1.
Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Superdex 200 acetato 4.76

2.
Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Superdex 75 acetato 4.76
3. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Superosa 6 acetato 4.76

4. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Superdex 200 carbonato 9.6

5. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Superosa 6 carbonato 9.6
6. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Sephacryl 300 Glicina-HCl 3.1

7. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Sephacryl 100 Glicina-HCl 3.1

8. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Sephacryl 100 Glicina-NaOH 9.4
9. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
Sephacryl 300 Glicina-NaOH 9.4

Parte II. Intercambio iónico.

1. En el simulador, se seleccionó la matriz cromatográfica.

2. Seguidamente se escogió el tampón a un pH cualquiera.
3. Se cargó la muestra en la columna cromatografía.
4. Se inició el proceso de separación por medio de la cromatografía.
5. Se detuvo la cromatografía cuando las proteínas se habían separado.
6. Este proceso se repitió con diferentes matrices cromatográficas y tampones.

Resultados.

Se obtuvieron los siguientes cromatogramas:

1.
Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
CM-Celulosa Glicina-HCl 3.1
2. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
CM-Celulosa cacodilato 6.27

3. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
CM-Celulosa piperidina 11

4. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
DEAE-celulosa Glicina-HCl 3.1
5. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
DEAE-celulosa cacodilato 6.27

6. Tampón de
Matriz cromatográfica pH
elución
DEAE-celulosa piperidina 11
Análisis de resultados
Las proteínas son herramientas moleculares que realizan una variedad de funciones
como la catálisis, regulación metabólica, transporte y defensa, y también sirven de
materiales estructurales para los organismos vivos, estas se componen de uno o más
polipéptidos. El constante incremento en las aplicaciones de estas macromoléculas en
diversos campos ha generado un interés especial en el desarrollo de procesos para el
análisis y purificación de las mismas. Es aquí donde la cromatografía de líquidos ha
sobresalido debido a su versatilidad. La resolución de mezclas de proteínas por
cromatografía de líquidos se basa en que bajo un conjunto de condiciones específicas,
los solutos disueltos en una fase móvil interactúan con una fase estacionaria.
Dependiendo de la naturaleza química de la fase y del tipo de estas interacciones,
existen diferentes tipos de técnicas cromatográficas.

La cromatografía por exclusión molecular involucra todos aquellos procesos de

separación de biomoléculas de acuerdo a su tamaño cuando una solución fluye a través
de una columna compuesta por un medio poroso. Para la separación mediante esta técnica,
se utilizan las propiedades de tamiz molecular de una variedad de materiales porosos. El
proceso de separación depende directamente del tamaño y el volumen hidrodinámico, el cual
define la capacidad de la molécula de penetrar o no en los poros de la fase estacionaria. De tal
forma que, las moléculas de alto peso molecular son excluidas de los poros debido a un efecto
estérico y pasan rápidamente a través de la columna. En el caso de biomoléculas pequeñas, estas
tienen diferente accesibilidad en las cavidades de la matriz porosa. Mediante la experiencia en
el simulador se pudo determinar que de las matrices utilizadas, aquella con la porosidad
de menor tamaño fue la Superosa 6, puesto que es la que reflejó un volumen de elución
mayor, por otro lado, la matriz Sephacryl 100, fue la que presentó un menor volumen de
elución menor, por ende, es la que posee un mayor tamaño en su porosidad. Además, se
pudo corroborar que factores como el pH no son influyentes en este tipo de
cromatografía.

La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas en base a su carga iónica

neta. La separación se ejecuta mediante la competencia entre proteínas con diferente
carga superficial por grupos cargados opuestamente sobre una matriz de intercambio
iónico. En una separación utilizando esta técnica, las interacciones hidrofóbicas
reversibles entre los solutos se controlan con el objetivo de favorecer la unión o elución
de moléculas específicas logrando así, su separación. Una proteína que no tiene carga
neta a un pH equivalente a su punto isoeléctrico (pI) no podrá interactuar con la matriz
cargada. Sin embargo, a un pH por encima de su pI, podrá ligarse a una matriz cargada
positivamente o intercambiador aniónico mientras que a un pH por debajo de su pI,
una proteína podrá unirse a una matriz cargada negativamente o intercambiador
catiónico. La separación se logra por una interacción electrostática entre los residuos
cargados de la matriz y los residuos de la proteína con carga contraria. Es importante
recalcar que esta interacción se puede romper por cambios en fuerza iónica o de pH. En
el caso de la CM-celulosa, al ser una resina negativa, se utiliza en intercambios
catiónicos, entonces al aplicar condiciones de pH bajo, la retención fue sumamente
marcada, esto debido a la diferencia de cargas, sin embargo, al aumentar el pH, la fuerza
de retención decreció. Contrario a lo sucedido con la DEAE-Celulosa que al ser una
resina positiva, es un empleado aniónico, que en condiciones de pH alto tiene una
retención más marcada debido a la diferencia en las cargas, sin embargo, al tomar
valores de pH menores, la retención fue decreciendo.