 Integrantes: Samantha Hernández 20152030527,

Ana Lucía Vásquez 20162030456,

Ana Sabillón 20162031342.

 Fecha de entrega: viernes, 16 de octubre del 2020.

 Asignatura: Bioquímica.
 Laboratorio de Bioquímica
 Sección: 1800.
 Asignación: Reporte I: Factores que determinan la actividad
enzimática.
 Instructor: Omar Mejía.
Objetivos

Objetivo general
Investigar qué factores influyen, o no, la actividad enzimática.

Objetivos específicos

1. Realizar variaciones, haciendo uso de un simulador en línea, en factores clave

como ser la temperatura, la escala de pH y la concentración de una muestra y
cómo estos tienen efectos directos en la actividad enzimática.

2. Analizar en qué medida los factores mencionados influyen en la actividad

enzimática mediante estadísticas gráficas.
Resumen
Durante la práctica Factores que afectan la actividad enzimática se llevaron a cabo
una serie de pruebas en un simulador en línea con el fin de determinar el grado de
influencia que tiene la temperatura, el pH y la concentración de una muestra de 6-O-
α-L-ramnosil-D-glucosidasa en la forma en que se desarrolla la actividad de las
enzimas en un organismo y como este grado de influencia puede sufrir alteraciones
a medida se realizan modificaciones en los factores ya mencionados.

Dicho grado de influencia fue medido mediante la absorbancia en un

espectrofotómetro y se rellenaron tres tablas con los valores arrojados por este. La
primera prueba consistió de tomar temperaturas y pH aleatorios, en la segunda se ha
variado la temperatura mientras el pH permanecía constante, y para la tercera prueba
el pH fue modificado y la temperatura fue constante. Para cada prueba se realizaron
6 mediciones diferentes con las que se llenaron las respectivas tablas. Se pudo
visualizar que a un pH de 9, ligeramente básico, la absorbancia fue mayor que en la
mayoría de las pruebas realizadas.

Para culminar se realizó una última prueba con el objetivo de encontrar la

mínima absorbancia a un pH y temperatura determinados.
Procedimiento experimental

La muestra en este experimento fue 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, en un simulador

donde se buscó el pH y la temperatura optima de esta enzima.

1. En la primera prueba se tomaron pH y temperaturas al azar.

2. Se añadió la muestra de la enzima a la cubeta (en donde el tiempo de incubación es
de 1 hora) y seguidamente se añadió el tampón DNS (toma 10 minutos y a 100°C).
3. Al notarse un cambio de coloración se midió la absorbancia por medio de
espectrofotómetro y se anotaron los valores.
4. Se repitió el proceso seis veces hasta llenar una tabla.
5. Se hicieron tres tablas diferentes, en las cuales la primera se hizo de prueba piloto
con valores de pH y temperaturas al azar, en la segunda con pH constante y
temperatura diferente y la tercera con temperatura constante y pH diferente.
6. Se hizo una cuarta tabla para identificar la absorción mínima en un pH y
temperatura dada.
Resultados

Tabla 1. Medición de absorbancia con pH y T al azar.

# pH T (°C) A(nm)
1 10 50 0.007
2 7 80 0.639
3 3 75 0.075
4 5 60 0.092
5 9 65 2.044
6 11 75 0.055

En esta primera tabla puede observarse que la mayor absorbancia se obtuvo en un pH de

9 y valor de 65 °C de temperatura, con A=2.044.

Tabla 2. Medición de absorbancia con T constante.

# pH T (°C) A(nm)
1 11 55 0.028
2 10 55 0.018
3 9 55 1.099
4 8 55 0.587
5 7 55 0.392
6 6 55 0.221

En esta segunda tabla se dejó la temperatura constante; en pH=9 se obtuvo la mayor

absorbancia con A=1.099.
Tabla 3. Medición de la absorbancia con pH constante.

# pH T (°C) A(nm)
1 9 80 1.788
2 9 70 2.286
3 9 60 1.588
4 9 50 0.458
5 9 40 0.088
6 9 30 0.099

En esta tercera tabla se dejó el pH constante y en T= 70°C se obtuvo la mayor

absorbancia, con A=2.286.

En pH=9 y T=70°C la absorbancia fue mayor, por lo que este puede ser
considerado como su pH y temperatura óptima.

Tabla 4. Medición de la absorbancia mínima con T constante.

# pH T (°C) A(nm)
1 11 40 0.002
2 10 40 0.001
3 8 40 0.047
4 7 40 0.032
5 6 40 0.018
6 5 40 0.005
7 4 40 0.003

En esta cuarta tabla se observa que en pH=10 y en T= 40°C se obtuvo la absorbancia

mínima, con A=0.001.
Gráficos

Grafico 1. Representación de la Tabla 2.

pH vs A con T constante a 55°C

1.2

0.8
Absorbancia

0.6 A(nm)
0.4

0.2

0
5 6 7 8 9 10 11 12
pH

Grafico 2. Representación de la Tabla 3.

T vs A con pH=9 constante

2.5

1.5
Absorbancia

A(nm)
1

0.5

0
20 30 40 50 60 70 80 90
Temperatura
Grafico 3. Representación de la Tabla 4.

pH vs A con T constante a 40°C

0.05
0.045
0.04
0.035
0.03
Absorbancia

0.025 A(nm)
0.02
0.015
0.01
0.005
0
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
Análisis de resultados

Las enzimas son proteínas que dirigen y aceleran miles de reacciones bioquímicas en
procesos como la digestión, la captura de energía, la biosíntesis y también suelen
utilizarse para predecir los mecanismos de reacción. Entre los factores que influyen su
cinética se encuentran la concentración del sustrato cuando la concentración de la
enzima es contante, el pH, la fuerza iónica del medio y la presencia de inhibidores,
entre otros.

Si se tiene un glicósido natural, como en este caso lo es la hesperidina, y se le

añade una enzima como la 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168), el enlace
glucosídico del sustrato es hidrolizado. La hespéridina está compuesta por la unión de
rutinosa y hesperitina y cuando este enlace se hidroliza, se da la liberación de la rutinosa
6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa.

La rutinosa es precisamente un disacárido presente en algunos glucósidos

flavonoides y posee un carácter reductor. Esto se demostró mediante el ensayo para
detectar azucares reductores empleado en el simulador. Puesto que al hacer reaccionar
un azúcar reductor con el dinitrosalicilato que presenta una coloración amarillenta en
medio básico, permite la reducción del DNS a 3-amino-5-nitrosalicilato, cuyo color
característico es un rojo ladrillo.

A través de la incubación a diferentes valores para la temperatura y pH, se

permitió establecer un rango de temperatura y un rango de pH óptimo para el cual la
actividad de la enzima es máxima. De tal manera, que fue posible observar un
incremento en la absorbancia con respecto a los valores de 55 ℃ ≤T ≤70 ℃ y
8 ≤ pH ≤ 9.

Cuando una enzima toma valores mayores o menos que su rango de pH o de

temperatura, al tener una naturaleza proteica, esta se desactiva y su actividad enzimática
disminuye e incluso en algunos casos, cesa. Es por eso que los valores reflejados para la
absorbancia son menores, cuando se encuentran fuera de estos intervalos de pH y
Temperatura. A su vez, se puede visualizar, como la mayor absorbancia alcanzada se
obtuvo en condiciones de un pH=9 y una T= 70 ℃, valor comprendido entre los rangos
estipulados.