Práctica No.

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Métodos de Separación de Aminoácidos y Proteínas

Steffany Juárez (201701443)

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San
Carlos de Guatemala, Carrera de Química Biológica.

CUESTIONARIO

Cromatografía en capa fina

1. ¿Qué variantes de cromatografía en capa fina existen? Enumérelas.
 Cromatografía en columna
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en gases
 Cromatografía de adsorción
 Cromatografía de exclusión
 Cromatografía de partición
(Nelson & Cox, 2017).

2. ¿Qué factores son utilizados para la determinación del valor Rf?

 Factor de retención
 Placas de capa delgada de cromatografía
 Solventes
 Temperatura del disolvente
 Polaridad del compuesto determinado por el número y naturaleza de los grupos
funcionales La naturaleza del disolvente; un aumento en la polaridad del solvente
facilita el desplazamiento en la plaza
(Lamarque, 2008).

3. ¿Por qué es necesario que la cámara cromatográfica esté saturada antes de colocar la
cromatoplaca?
Porque en lugar de que el disolvente ascienda por capilaridad continuamente; se evaporara
de la copa adsorbente para equilibrar, al líquido con su presión de vapor, implicando un
descenso no homogéneo. Para poder generar las condiciones atmosféricas adecuadas para
la realización de la cromatografía de capa fina (Lamarque, 2008).

4. En cromatografía en capa fina, ¿qué significa el término revelado?

Se le denomina así a la capa del compuesto que asciende por el papel en el proceso de la
cromatografía, es decir, la forma visible en la que se presenta lo que se está separando
(Baynes & Dominiczak, 2011).
 5. ¿Por qué razón no se debe tocar la cromatoplaca directamente con los dedos?
Debido a que los dedos cuentan con grasa o la suciedad, puede afectar al valor de la
resolución por las impurezas agregadas y afectaría la visibilidad de la muestra; y puede
interferir en la separación (Baynes & Dominiczak, 2011).

6. ¿Por qué razón es necesario marcar el punto de origen a partir del cual se colocan las
muestras en la cromatoplaca?
Para poder establecer alguna diferencia en la cromatografía si se realiza con diferentes
sustancias de estudio, así como el desplazamiento de las muestras colocadas en la
cromatoplaca (Baynes & Dominiczak, 2011).

7. ¿Por qué se hace más de una aplicación por cada muestra?

Debido a que la cormatoplaca es bastante absorbente y al tener una cantidad adecuada de
analito se podrá determinar adecuadamente su recorrido en la cromatoplaca (Nelson & Cox,
2017).

8. ¿Cuál es la razón por la cual el diámetro de la mancha debe ser pequeño?

Debido a qué si se realiza una aplicación demasiado ancha en la cromatoplaca de las
sustancias de interés, se podrían mezclar y dar como resultado un falso positivo (Nelson &
Cox, 2017).

Cromatografía en columna
9. Describa las características químicas (estructura, descripción, usos) del gel empleado por su
grupo en la cromatografía en columna.
Mantiene al mínimo las corrientes de convección producidas por pequeños gradientes de
temperatura, y también minimiza los movimientos de las proteínas que no sean producidos
en el campo eléctrico. Es el polímero ramificado de la glucosa, los cuales se encuentran
formando una red tridimensional en forma de pequeños solutos, límites de exclusión según
tamaño (Lamarque, 2008).

10. Explique el principio de separación que corresponde a la cromatografía en columna

realizada por su grupo.
La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un
soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y
alúmina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este
soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase
móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se
establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente
eluyente que fluye por la columna (Lamarque, 2008).
11. Tomando en consideración que se requiere de 10 mL de agua para hidratar 1 g de Sephadex
G-50, indique cuál sería el volumen de agua dentro de las partículas de gel (Vi) en una
columna preparada a partir de 3 g de este Sephadex.
Sería un volumen de 30 ml de agua debido a que se requiere de 10 ml de agua para hidratar
1gr de sephadex y para poder realizar el procedimiento con 3 gr de Sephadex se requieren
30ml de agua.

12. ¿Qué diferencia existe entre el Sephadex G-100 y el G-150, con respecto a su capacidad de
separación de mezclas de proteínas y de polisacáridos?
El poro Sephadex G-100 permite el paso de proteínas con masa molecular 4,000-15,000 y el
Sephadex G- 150 entre 5,000- 300,000. Entre mayor sea el número se permite realizar una
separación más fina para la cromatografía de afinidad, debido a que se quedan atrapadas
más fácilmente las partículas más finas en el gel y permite paso con mayor facilidad de las
moléculas de mayor peso molecular (Lamarque, 2008).
13. Investigue composición, características generales y función que cumple cada uno de los
siguientes geles empleados en cromatografía en columna: superdex 200, sephacryl 100, CM
celulosa, DEAE celulosa, ConA sepharose 4B.
Superdex 200
o Las columnas de cromatografía de exclusión por tamaño de aumento Superdex 200
son ideales para el análisis de alta resolución y la purificación a pequeña escala de
anticuerpos monoclonales (mAb) y otras biomoléculas con Mr~ 10000 a 600000.
o Rendimiento mejorado: resolución y tiempo de ejecución mejorados en
comparación con el predecesor Superdex 200
o Resolución muy alta: el tamaño pequeño de las perlas y la distribución estrecha del
tamaño de las partículas proporcionan una alta resolución para una alta pureza de
proteínas
o Altas tasas de flujo: las perlas rígidas brindan excelentes propiedades de
presión/flujo

Sephacryl 100
o Para la separación de péptidos y proteínas pequeñas
o Excelente purificación en un amplio rango de peso molecular
o Alta reproducibilidad debido a la estabilidad química y física a largo plazo
o Alta velocidad de caudal y recuperación
o Adecuado para uso a escala industrial
o Condiciones de almacenamiento: 20 % etanol; de 4 ° a 30 °C
o Disponible en una variedad de colores y tamaños

CM celulosa
o Los geles que forma con el agua son de carácter aniónico y estables a pH = 4 – 10.
Sin embargo, los aumentos de temperatura provocan una pérdida de viscosidad.
 o Las soluciones de CMC mantienen una viscosidad constante y su máxima estabilidad
se da en un rango de pH que va de 6 a 9
o Por debajo de pH 4 hay transformación de la CMC en ácido carboximetilcelulósico,
el cual flocula, dando viscosidades superiores.
o Por encima de pH 10, la viscosidad disminuye notablemente

DEAE celulosa
o Purificación de proteínas

ConA sepharose 4B
o Se utiliza para la purificación de alta capacidad de proteínas de fusión marcadas con
glutatión-S-transferasa (GST)
o Capacidad de unión: > 5 mg de GST de hígado de caballo/ml de medio (en función
del caudal) Tamaño medio de partícula: 90 μm
o Caudal recomendado (H2O a temperatura ambiente): 75 cm/hora
o Estable en presencia de todos los tampones acuosos más utilizados
o Estable en el intervalo de pH de 4 a 13

Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

14. Explique el principio de separación de proteínas por electroforesis SDS-PAGE.
Puede utilizarse para separar una gran variedad de moléculas cargadas incluidas
aminoácidos, polipéptidos, proteínas y ADN. Cuando se aplica una corriente a moléculas
disueltas en soluciones tampón, las moléculas con una carga neta negativa al pH
seleccionado migran hacia el ánodo, y las que tienen carga neta positiva migran hacia el
cátodo. Para minimizar la difusión y convección, normalmente se utiliza un soporte poroso,
como el papel, acetato de celulosa o un gel polimérico (Bayn & Dominiczak, 2011).

15. Describa las características químicas de la poliacrilamida.

Son químicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pH (7-7.5),
temperatura (autoignición < 150˚C) y fuerza iónica. Es un homopolímero. Puede ser
sintetizado en forma de cadena lineal o entrecruzado, e incluso se emplea junto con otros
monómeros como lo pueden ser el acrilato de sodio para formar diferentes copolímeros.
(Kemira, 2010).

16. Investigue la toxicidad de la poliacrilamida e indique las condiciones de bioseguridad

relacionadas con su uso.
Riesgos y efectos a la salud
 Ingestión accidental: Puede causar ligera irritación.
 Inhalación: Ninguno.
 Piel (contacto y absorción): Ninguno.
 Ojos: Puede causar ligera irritación.
Emergencia y primeros auxilios
  Contacto con los ojos: Enjuague inmediatamente con abundante agua por lo menos
durante 15 minutos.
 Contacto con la piel: Lave inmediatamente con suficiente agua y jabón.
 Ingestión: No se anticipa que el material se nocivo por ingestión. No son necesarias
medidas especiales de primeros auxilios.
 Inhalación: No se anticipa que el material sea lesivo por inhalación. Retirar a la
víctima al aire libre.
Toxicidad aguda
 Oral DL50, rata: No aplica > 5000 mg/kg estimado
 Dermal DL50, conejo: No aplica > 2000 mg/kg estimado
 Inhalación CL50, rata (4 horas): No aplica > 20.0 mg/kg estimado
Condiciones de bioseguridad
 Medidas higiénicas: Antes de comer, beber o fumar lávese la cara y las manos con
agua y jabón.
 Ojos: Usar protección ocular/ facial.
 Piel y cuerpo: Evitar contacto con la piel.
 Manos: Usar guantes impermeables.
 Respiratoria: No se recomienda ninguno.
(Kemira, 2010).

17. ¿Qué función cumple el SDS en la electroforesis? Explique.

Su papel es la desnaturalización y el establecimiento de una relación carga-tamaño
constante en la proteína, de modo que la movilidad de la proteína durante la electroforesis
sea exclusivamente proporcional a su peso molecular (Menor, 2019).

18. En algunos protocolos empleados en SDS-PAGE, se utilizan agentes reductores (β

mercaptoetanol, por ejemplo), mezclados con la muestra y el colorante (buffer de carga).
¿Qué función cumple el agente reductor en el proceso de separación de proteínas?
Su función es la ruptura de los puentes disulfuro, permitiendo la desnaturalización de las
proteínas (Nelson y Cox, 2017).
REFERENCIAS

Baynes, J. & Dominiczak, M. (2011). Bioquímica médica. (3ª. Ed). Barcelona, España: Elsiever Mosby.
Kemira. (2010). Hoja de datos de seguridad de la poliacrilamida aniónica. Recuperado de:
https://aniq.org.mx/pqta/pdf/Respaldo/Optifloc%20A1638%20(MSDS).pdf
Lamarque, A. (2008). Fundamentos teórico- prácticos de química orgánica. Buenos Aires, Argentina.
Grupo editor encuentro.
Menor, C. (2019). Biología molecular, evolución química y astrobiología. Madrid, España:
Universidad de Alcalá.
Nelson, D. & Cox, M. (2017). Lehninger. Principios de bioquímica. (7ª. Ed). Barcelona, España:
Omega.
DIAGRAMAS DE FLUJO