Electroforesis de DNA plasmídico pBluescript II SK/KS (+) de Escherichia Coli

en gel de agarosa

Florencia Gobbo; Natacha Skrzyniecki; Julián Rojas

Departamento de Fisiología y Biología Molecular y Celular,

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
10 de Mayo de 2019

INTRODUCCIÓN

La electroforesis en gel de agarosa es un método de análisis cuantitativo de ácidos nucleicos

y en menor medida de proteínas. Este método aprovecha la generación de un campo eléctrico con el
fin de que la velocidad de migración por el gel, ya sea hacia el ánodo (polo positivo) o el cátodo
𝑞
(polo negativo), dependa del tamaño, la relación carga-masa (𝑚) y la estructura química de la
molécula de interés. El gel mencionado, a su vez, contiene poros de acuerdo a la concentración de
agarosa utilizada: a menor concentración más grande es el orificio de paso; mientras que a medida
que sea mayor su concentración, más chico. En efecto, se utilizó una concentración de agarosa
intermedia debido a que la cantidad de DNA plasmídico, con el cual experimentamos, no es ni muy
grande ni muy escasa y, así, las moléculas más pequeñas junto con las que se encuentran
comprimidas migran a una velocidad mayor que las más grandes, quedando estas últimas retenidas
a una menor distancia del lugar de siembra.
Como se enunció, ya desde el comienzo del título del trabajo, la electroforesis se realizó en
función de lo obtenido en trabajos previos con el DNA plasmídico de pBluescript II SK/KS (+) de
un peso molecular de 2961 pares de base de acuerdo a lo mencionado en la guía de trabajos
prácticos de IBMC del año 2019. Algo no menor en este asunto y muy importante a tener en cuenta
es la estructura del DNA para la migración por el gel. Como por cada par de base hay dos grupos
fosfatos con carga negativa, la relación carga-masa es uniforme. Así, resulta que la movilidad en
electroforesis depende de la longitud de la molécula (medida en número de pares de bases, bp)
separándose los fragmentos de acuerdo con su longitud en bp y su capacidad de atravesar los poros
del gel.
Inicialmente el movimiento es acelerado producto de la fuerza eléctrica mayor que la de
rozamiento dinámico, luego esas fuerzas se igualan migrando el DNA a una velocidad constante y,
por último, la fuerza de rozamiento se transforma en estática a causa de la dificultad de migración.
Como el DNA plasmídico (todos) in vitro puede encontrarse en tres topoisómeros, es decir, en tres
estructuras diferentes franquea diferencialmente el gel. Esos tres topoisómeros son: circular
superenrollado donde ocupa un menor volumen espacial; circular con Nick (rotura de puentes
fosfodiéster), lo cual implica pérdida de enrollamiento e interacciones débiles de Van Der Waals y
un aumento de volumen respecto el primero, para este tipo de estructura no será posible determinar
con certeza su PM debido a que por su forma tendrá más dificultades para pasar por los poros y
quedará más arriba de su respectiva marca durante la electroforesis; y, como tercera opción, en
forma bicatenaria lineal por rotura de ambos puentes fosfodiéster, mediante una enzima de
restricción que actuará en un sitio único de corte. En definitiva, esto acarrea que la velocidad de
corrida con que el primero percola el gel es mayor respecto del tercero y el segundo.
MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales biológicos

Se utilizó el plásmido extraído de Escherichia coli del cual se conoce su longitud en 2961 bp
de acuerdo a lo especificado en la introducción. La muestra fue conservada a baja temperatura en
las heladeras de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, pero la mitad contenía RNasas capaz
de degradar RNA y la otra no.

Diseño experimental

Calles de siembra Tratamiento previo

Plásmido pBluescript II SK/KS (+) extraído y purificado sin
1, 3, 5, 7, 9
RNasas

Plásmido pBluescript II SK/KS (+) extraído y purificado con

2, 4, 6, 8
RNasas

Molécula control del plásmido pBluescript II SK/KS (+) en

10
forma superenrollada.

Plásmido pBluescript II SK/KS (+) lineal por digestión con

11
enzima de restricción EcoRI

Síntesis in vitro de cadenas de DNA de peso molecular

12
conocido.

13 Plásmido pBluescript II SK/KS (+) digerido con enzima de

restricción Pvu II.
14
Tabla 1. Tratamiento de muestras previa siembra en cama electroforética donde los
números del 1 al 9 corresponde a los grupos, mientras que del 10 al 12 son controles y
marcos de referencia y las dos restantes réplicas con el fin de asegurarse cuántos
fragmentos quedan luego del tijereteo molecular.

El ensayo fue realizado por nueve grupos de operatividad variable. Miembros de cada grupo
llevaron a cabo el sembrado del plásmido siguiendo el orden numérico, es decir, grupo 1 en calle 1,
grupo 2 en calle 2 y así sucesivamente. Luego como se quería observar cuántos fragmentos
diferentes de DNA plasmídico estaban presentes en las muestras purificada y cuán grandes eran
unos con respecto a otros se sembró el marcador de peso molecular que nos sirve para contrastar, en
otro casillero el plásmido pBluescript II SK/KS (+) como control positivo de las muestras, en otro
carril el plásmido digerido por la enzima EcoRI y 2 carriles restantes con la enzima Pvu II.
Una información no menor es que EcoRI y Pvu II son dos enzimas cuya actividad se conoce
como restricción. Su sitio activo actúa sobre el DNA como una tijera de carácter molecular
reconociendo secuencias de pares de bases palindrómicas específicas y rompen los enlaces
fosfodiéster. Según es conocido, EcoRI corta dejando extremos cohesivos; mientras que Pvu II,
extremos romos.
 a)
5’...... …..3’
3’...... …..5’

b)
5’...... …..3’
3’...... …..5’

Figura 1. Sitios y simplificación del corte con secuencias palindrómicas de: a) EcoRI, b) PvuII

Preparación del gel

A partir de una solución buffer de TAE 50X (Tris base 242 g, Ácido Acético glacial 57,1 ml,
EDTA 0.5 M pH 8) se preparó una de 1X, la cual fue utilizada tanto en la preparación del gel como
en la corrida electroforética. Se extrajo de la solución concentrada un volumen equivalente a 20 ml
y se adicionó cantidad suficiente de agua para llegar a un volumen de 1L. De esta solución se sacó
un volumen de 120 ml (volumen de la cama) y se la trasladó a un Erlenmeyer dónde se añadió
revolviendo 0,96 g de agarosa con el objetivo de que la concentración de soluto sea de 0,8% m/v.
Esta última solución se llevó a un microondas por 2 minutos, se volvió a mezclar y, por último, se
sellaron los bordes de la cama y se la volcó colocando al mismo tiempo Xμl de bromuro de etidio
junto con los peines (formadores del pocillo). Para finalizar se aguardó un tiempo para que se
solidifique mandando la preparación a la heladera.
Un dato a tener en cuenta es la inserción de bromuro de etidio al gel. Este compuesto se
utiliza como agente intercalante en el DNA y tiene como propiedad conocida su absorbancia de luz
UV, lo cual al observar en un transiluminador con esta longitud de onda, toma una tonalidad
iridiscente y permite rastrear la ubicación del DNA.

Preparación de muestras y electroforesis

Una vez que el gel de agarosa se solidificó, se le quitó a la cama el sellado de cinta junto con
los peines quedando en ese lugar un pocillo o well. Seguidamente, se la depositó en la celda
electrolítica adicionando la solución TAE 1X hasta que recubra completamente el gel. Esta solución
buffer se incorpora a raíz de que en la celda se le aplica corriente eléctrica y para que la electricidad
se transmita en solución debe de haber electrolitos, electrones libres. Además, tiene un pH alcalino
lo que beneficia la estabilidad del DNA en su migración debido a que el medio al ser básico está
plagado de grupos hidroxilos (OH-), los cuales poseen carga negativa y no se van a unir como si lo
harían los protones (H+) en un medio ácido, por ejemplo pH 3, alterando en consecuencia la
migración del DNA.
Posteriormente, los eppendorf de cada grupo que fueron conservados a baja temperatura le
fueron devueltos a cada grupo de acuerdo a la rotulación indicada. De ellos se extrajo con una
pipeta P20 un volumen de 4 µl y se lo transfirió a otro eppendorf conteniendo 2 µl de buffer de
siembra 3X. Los solutos de esta solución reguladora consistían en glicerol 15% m/v, xilene-cianol
0,1% y azul de bromofenol 0,1%. El glicerol aporta densidad a la muestra sembrada evitando su
difusión por la solución dado que se deposita sobre el fondo del pocillo y arrastra con esta acción a
toda la muestra. En tanto que los dos compuestos restantes son colorantes que sirven como marco
de referencia para saber cuándo detener la electroforesis con la única diferencia que el primero
corre como 5000 bp y el segundo como 500 bp, evitándose así que las muestras traspasen el gel y se
vuelquen en solución.

Extracción y análisis de datos

Una vez obtenida el patrón de bandas característico de la electroforesis, con el fin de obtener
la distancia de las líneas de DNA en cada calle se utilizó la herramienta “measure distance” en el
programa Adobe Acrobat Pro. Con ella fue posible obtener la recorrida desde el lugar de siembra
hasta donde haya quedado retenido el DNA tanto de los marcadores de peso molecular conocido
como así también de los fragmentos cortados por las enzimas de restricción. Consecuentemente, se
preparó una recta de calibrado con los pesos moleculares de los marcadores en función de la
distancia recorrida e interpolamos las distancias recorridas por los distintos segmentos para conocer
su tamaño molecular.

OBJETIVO

El objetivo primordial consistió en la cuantificación analítica del DNA plasmídico extraído

de Escherichia Coli detallado en el informe anterior1, verificar el estado estructural y la
comparación entre aquellas muestras que fueron tratadas RNasas y las que no. En consecuencia, se
trató de corroborar efectivamente la hipótesis y suposición previa de que habían quedado moléculas
de distintos tipos de RNA en la extracción y el proceso de purificación.
Además, en segundo lugar, deseábamos comprobar en cuantos lugares corta la enzima de
restricción Pvu II con respecto a EcoRI y estimar cuál es el peso molecular de esos fragmentos
medidos en pares de bases, teniendo en mente el mapeado molecular y comparando con el marcador
de peso molecular conocido

RESULTADOS

Muestras extraídas de DNA plasmídico

Todos los grupos obtuvieron el DNA plasmídico en un estado superenrollado tal cual se
observa al contrastar con el control positivo de la calle 10 en la figura 2. Paralelamente aquellos
grupos en donde se incorporó la RNasa, se observa una línea más arriba a la misma altura de EcoRI.
En comparación con aquellas muestras sin RNasa, se observa que esta línea no está y la que se
mencionó en primer lugar se encuentra ensanchada.

1
“Extracción de DNA cromosómico y plasmídico de Escherichia coli”. Gobbo, F; Skrzyniecki, N; Rojas, J; Melo, A.
S/F
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14

Figura 2. Gel insertado en cámara de electroforesis depositado, una vez concluida la corrida, en un
transiluminador UV donde se observan las respectivas bandas formadas.

Por otro lado, se observó efectivamente que aquellos plásmidos que se creyó se encontraban
purificados y sin residuos de RNA (los que no contenían RNasa), en realidad contenían restos de
ellos. Esto es apreciable dado que se presenta como un chorreado del mismo debajo de la línea del
plásmido superenrollado en las calles 1, 3, 5, 7 y 9. Lo vemos de esa manera debido a que el RNA
forma interacciones de carácter secundario por reglas de complementariedad (Adenina – Uracilo;
Citosina – Guanosina), lo que posibilita que el bromuro de etidio se intercale y refleje en el espectro
de luz UV. Además, estas especies moleculares son de un menor tamaño y se aprecia que estaban a
una elevada cantidad.

Tamaños de los fragmentos de muestras, Eco RI y PVU II

Gráfico 1. Pares de bases de los marcadores de peso molecular en escala logarítmica en función de
la distancia recorrida

Para hallar los pares de bases de las bandas formadas al ser tratadas con Pvu II y la banda de
EcoRI se midió la distancia desde el lugar en el que fueron sembradas hasta su detención.
Respectivamente, la banda superior denominada línea 1 de Pvu II tuvo un trayecto de 7,120 cm,
mientras que la línea inferior llamada línea 2 de Pvu II, 12,25 cm; en tanto que en EcoRI se produjo
un recorrido de 6,790 cm. A su vez, como comparación entre los pesos moleculares de las muestras
extraídas se tomó como marco de referencia general para todas la calle 3, sin RNasas, y calle 4, con
RNasas. La primera correspondiente al grupo 3 se registró una sóla banda con una distancia de
8,520 cm, en tanto que en la segunda se registraron dos bandas: línea 1 (superior) con una distancia
de 6,440 y línea 2 (inferior) con 8,210
Estos datos fueron extrapolados a la ecuación de la línea de tendencia que modela
matemáticamente la situación y que mejor se adecua a los valores que tenemos en nuestro gráfico,
la cual se indica a continuación:

𝑦 = −0,1776𝑥 + 4,7107

Donde “x” es distancia en cm e “y” el log10bp (logarítmo en base diez de los pares de bases o el
peso molecular de DNA).

Entonces se hicieron las operaciones algebraicas pertinentes con el fin de obtener los pares de bases
en base a esta ecuación:

Log10(𝑏𝑝) = −0,1776𝑥 + 4,7107

Pvu II (línea 1)
10 – 0,1776 (7,120) + 4,7107 = bp
2789,9 = bp ≅ 2790
Pvu II (línea 2)
10 – 0,1776 (12,25) + 4,7107 = bp
 342,85 = bp ≅ 343

EcoRI (línea única)

10 – 0,1776 (6,640) + 4,7107 = bp
3399,66 = bp ≅ 3400

Calle 3 (línea única)

10 – 0,1776 (8,520) + 4,7107 = bp
1607,19 = bp ≅ 1607

Calle 4 (línea 1)
10 – 0,1776 (6,440) + 4,7107 = bp
3689,40 = bp ≅ 3689
Calle 4 (línea 2)
10 – 0,1776 (8,210) + 4,7107 = bp
1788,97 = bp ≅ 1789

Procedencia bp Log10 (bp) Distancia (cm)

12000 4,08 3,670
5000 3,70 5,140
2000 3,30 7,660
1650 3,22 8,330
1000 3,00 9,960
Marcador de peso 850 2,93 10,43
molecular 650 2,81 11,21
500 2,70 11,86
400 2,60 12,36
300 2,48 12,91
200 2,30 13,08
100 2,00 13,97
Calle 3 G3 - línea 1 1607 3,21 8,520
Calle 4 G4 - Línea 1 3689 3.57 6,440
Calle 4 G4 - Línea 2 1789 3.25 8,210
EcoRI 3400 3.53 6,640
Línea 1 2790 3,45 7,120
Pvu II
Línea 2 343 2,54 12,25

Tabla 2. Pares de bases con su respectiva escala logarítmica en función de la distancia

recorrida y luego del cálculo con regresión lineal.

DISCUSIÓN

La suma de ambos fragmentos, línea 1 y 2, de Pvu II nos da un total de 3133 bp respecto del
tamaño del plásmido que es 2961 bp. Es decir, una diferencia de 172 bp, un margen bastante
aceptable. Sin embargo, también nos aporta información sobre en cuantos lugares corta y podemos
afirmar que lo hace en dos. Con relación a EcoRI, la línea nos da un total de 3400 bp contra los
2961 bp mencionados y se distancia en 439 bp. Entonces, EcoRI sólo corta este plásmido en un solo
sitio dejándolo en forma lineal. Concluimos que esta diferencia en cantidad se puede deber a que
nuestra preparación del gel contenía una concentración de agarosa de 0,8% m/v, pero el marker
considerado (el tamaño, no la distancia de estos al lugar de siembra) era de 0,9% y esto pudo haber
alterado la velocidad de migración. Al mismo tiempo, pudo haber un error de medición de
milésimas que junto con la regresión lineal nos diera por encima del valor.
 Paralelamente, deducimos que la línea del grupo 3 de 1607 bp junto con la línea 2 del grupo
4 de 1789 bp tenían una pequeña diferencia en cuanto a los pares de bases de 182 bp.
Probablemente se deba a que la muestra 3 no contenía RNasas, razón por la cual el RNA que quedó
arrastró mucho más abajo el DNA o concentró mayor bromuro de etidio que el resto de la muestra
en contraste con la otra. Además al comparar con la calle 10 donde se sembró el plásmido control
con isomería superenrollada, suponemos que ambas muestras también tienen un gran enrollamiento.
Pero de estas dos bandas no sólo esto podemos analizar, sino que en contraste con el peso molecular
del plásmido en cuestión que era de 2961 bp observamos una disparidad de aproximadamente 1200
bp y, entonces, no es lo óptimo tenerlo en este estado para determinar su peso molecular.
En tercer lugar, la línea 1 del grupo 4 llegó casi a la misma distancia que el plásmido
digerido por EcoRI con lo cual algunas moléculas en la extracción se le rompieron mecánicamente
sus enlaces fosfodiéster y quedaron en forma lineal. No podemos observar la banda mencionada en
las muestras sin pretratar con RNasa, tal vez por la misma causa de arrastre de RNA sobre DNA o
porque al DNA plamídico se rompió y formó alguna asociación por complementariedad en función
de las reglas de Watson-Crick con el RNA o, simplemente, porque son pocas para formar una
banda.

BIBLIOGRAFÍA

Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (6a edición, incluye CD interactivo). Garland Publishing,
New York & London (2014)

Guía de trabajos prácticos. Introducción a la Biología Molecular y Celular. 2019

Lodish, H., Berk, A., Lawrence Zipurski, S., Matsudaira, P., Baltimore, D. y Darnell, J. E. Biología
Celular y Molecular. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, 2005 (traducción de la 5a edición
en inglés)
ANEXO: gracias a los conocimientos que obtuvimos tanto en el experimento como en las teóricas
podemos contestar las siguientes dos preguntas propuestas y que no fueron contestadas en la
redacción del trabajo.

5. ¿Qué ocurre si dañamos mecánicamente el DNA plasmídico? Si se dañara abruptamente el DNA

plasmídico se provocarían roturas en su estructura dando de esta manera distintos segmentos de
DNA de diversos tamaños y formas, lo que provocaría que durante la migración las bandas corran a
distintas distancias según sus variados PM logrando que al mirar el resultado bajo la luz UV se vea
un chorreado.

8. Si al tratar una preparación de DNA plasmídico con enzimas de restricción aparecen dos bandas
¿Se puede asegurar que existen dos sitios de corte para esas enzimas?

La respuesta sería no ya que si no sabemos cómo es el plásmido, y no sabemos el tamaño, es

imposible determinar si el mismo tenía solo dos sitios de corte para esa enzima. Además, aunque las
probabilidades no sean altas una enzima de restricción puede tener varios sitios de corte, puede ser
que los segmentos dados sean de dos PM iguales provocando que se vean dos bandas.