“VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DE MÉTODOS

MICROBIOLÓGICOS
CUANTITATIVOS Y CUALITATIVOS
(ISO 16140-3 e ISO 16140-4) ”

“Expositora: Cinthia Anyela Ramos Ynjante”

Lima, 16 de Abril 2023

BV_C2_Internal
 PARÁMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUALITATIVOS – ENFOQUE FACTORIAL
(Características de performance requerido)

Sensibilidad
Inclusividad /
Exclusividad

Nivel de
detección
(LOD50)

Robustez

Cabe indicar, que el laboratorio deberá sustentar técnicamente la

aplicación o no de cada uno de los parámetros de validaciones citados

Referencia: ISO 16140-3: 2021 Protocolo para la verificación en un único laboratorio de métodos de referencia y métodos alternativos validados
BV_C2_Internal
 I. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DEL NIVEL LOD50
El nivel de LOD50 se calcula utilizando el modelo factorial
ortogonal.
Para la determinación del LOD50 se requiere trabajar con 3 niveles
de concentración: alto (8 – 10 ufc/ porción de análisis, fraccional
(0.8 – 2 ufc/ porción de análisis) y blanco.
La variación sistemática de los factores garantiza que se pueda
inferir su impacto combinado. Esto contrasta con un estudio de
ROBUSTEZ FACTORIAL.
El criterio para la evaluación del efecto factorial Nivel (b) – Nivel
(a) ≤ 0.6 CONFORME

Referencia: ISO 16140-2: 2016 (item 5.1.3.4) e ISO 16140-4: 2020 (item 5.1.2.3)
BV_C2_Internal
 EJEMPLO DEL CÁLCULO DEL LOD50

• Caso práctico: El laboratorio usuario ha examinado 16

alimentos asignados a los 4 bloques, cada bloque
comprendido en dos configuraciones, en tres niveles de
contaminación.
• Los dieciséis alimentos se tomaron de la categoría combinada
de alimento “productos lácteos” que comprende “leche y
productos lácteos tratados térmicamente” y “leche cruda y
productos lácteos”, y que provienen de al menos tres tipos de
alimento:
• Los resultados se muestran en la tabla siguiente.

Referencia: ISO 16140-4: 2020 (Anexo E) BV_C2_Internal

 Leyenda
0: Negativo
1: Positivo

Referencia: ISO 16140-4: 2020 (Anexo E) BV_C2_Internal

CÁLCULO DEL LOD50 POR CADA CATEGORIA

.
.

BV_C2_Internal
CÁLCULO DEL LOD50 Y LOD95 POR CADA CATEGORIA

BV_C2_Internal
CÁLCULO DEL LOD50 POR CADA EXPERIMENTO

BV_C2_Internal
CÁLCULO DEL LOD50 POR CADA CONDICIÓN

BV_C2_Internal
 Protocolo para
determinar el LOD50

BV_C2_Internal
 I. ESTUDIO Y CÁLCULO DE LA SENSIBILIDAD

Para el estudio se debe tener en cuenta:

- Uso de muestras contaminadas de forma natura o artificial.

- La selección de categorías y tipos utilizados dentro de la validación
dependerá del tipo o grupo de microorganismos y campo de
aplicación de la validación.
- En todas las categorías seleccionadas (alimentos y otras categorías)
se deben incluir al menos 3 tipos diferentes por cada categoría.
- Para cada categoría examinada deben analizarse 60 muestras
individuales considerando 20 muestras por cada tipo (20 x 3 = 60)
- En una situación ideal, 10 muestras analizadas (un 50%) de cada tipo
deberían ser positivas y 10 negativas. Dentro de la categoría, como
mínimo 30 muestras deben presentar un resultado positivo.

Referencia: ISO 16140-2: 2016 (item 5.1.3.4) e ISO 16140-4: 2020 (item 5.1.2.3)
BV_C2_Internal
I. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LA SENSIBILIDAD

Los limites de aceptabilidad (AL) por categoría (de alimento) son

los siguientes:

ND = 3, PD = 1. Sí ND es superior a 3 o sí PD es superior a 1, el
método no se puede validar

Leyenda:
NA: Es el número de resultados de ensayos negativos
PD: Es el número de resultados de ensayos positivos para el método de nivel
cero
ND: Es el número de resultados negativos del ensayo
PA: El número de resultados positivos del ensayo del método de nivel alto

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 I. CÁLCULO DE LA SENSIBILIDAD

El cálculo de los resultados del estudio factorial en el

nivel cero y en el nivel alto deben basarse en los
principios indicados en la ISO 16140-2: 2016, para un
estudio no pareado.

No se utilizan resultados de ensayos de nivel bajo

(fraccionales). Todos los resultados de referencia en el
nivel cero se consideran negativos. En el nivel alto se
consideran positivos.

Referencia: ISO 16140-2: 2016 (item 5.1.3.4) e ISO 16140-4: 2020 (item 5.1.2.3)
BV_C2_Internal
 DESARROLLO DE TALLER

Referencia: ISO 16140-4: 2020 (Anexo E) BV_C2_Internal

 I. ENFOQUE FACTORIAL PAR LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS

En un enfoque factorial, se utiliza una variación sistemática de los

factores para estudiar el funcionamiento del método en un
rango definido de condiciones que generalmente se encuentran
durante la aplicación rutinaria del método.
Dentro de los factores típicos tenemos: analistas, medios de
cultivos e incubación, tiempos de incubación, lotes de
preparación de medios de cultivos, marca del medio de cultivo
preparación y almacenamientos de las muestras, equipos y
factores de estrés, etc

Referencia: ISO 16140-4: 2020

BV_C2_Internal
 A) ESTUDIO FACTORIAL ORTOGONAL

Para el estudio factorial se debe seguir:

- Se debe elegir un total de 12 artículos (productos) por cada

categoría.
- Se deben elegir al menos 3 o 4 tipos de alimentos.
- Cada articulo alimentario debe estar contaminado artificialmente en
3 niveles diferentes: un nivel bajo, nivel medio y nivel alto.
- El tamaño de la porción de análisis debe estandarizarse para cada
estudio.
- Cada configuración es una combinación de niveles de 4 factores del
método. Deben tenerse en cuenta 8 configuraciones diferentes.

Referencia: ISO 16140-4: 2020 (item 5.2.1.2) BV_C2_Internal

 A) DISEÑO ORTOGONAL FACTORIAL

- Cada articulo alimentario se analiza bajo dos

configuraciones diferentes (=combinación de niveles de
cuatro factores)
- Cada uno de los 12 artículos (alimentarios) se analiza en
dos configuraciones con 2 replicas, a nivel bajo, nivel
medio y nivel alto.
- Se realizan un total de 48 ensayos [12 artículos
(alimentarios) x (2) replicas x 2 configuraciones] por cada
método (método de referencia y alternativo = 96 ensayos

BV_C2_Internal
 NÚMERO DE ENSAYOS POR CATEGORIAS PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS (Enfoque factorial)

Leyenda
A: Número de ensayos del método alternativo
R: Número de ensayo del método de referencia
a: Para el estudio de inclusividad se requieren 80
cepas (130 para Salmonella)

Referencia: ISO 16140-4: 2020 BV_C2_Internal

 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS SIN MÉTODO DE REFERENCIA
(Diseño Ortogonal Factorial – Por categoría de alimento)

Referencia: ISO 16140-4: 2020 BV_C2_Internal

(DISEÑO ORTOGONAL FACTORIAL – POR CATEGORÍA DE ALIMENTO)

BLOQUE 1 BLOQUE 2 BLOQUE 3 BLOQUE 4

BV_C2_Internal
 PARÁMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS
(Características de performance requerido)

Veracidad
relativa Precisión
interna

Perfil de
exactitud

Robustez

Incertidumbre
Cabe indicar, que el laboratorio deberá sustentar técnicamente la
aplicación o no de cada uno de los parámetros de validaciones citados

Referencia: ISO 16140-3: 2021 Protocolo para la verificación en un único laboratorio de métodos de referencia y métodos alternativos validados
BV_C2_Internal
 I. CÁLCULO DE LA PRECISIÓN INTERNA
(repetibilidad interna y reproducibilidad interna)
Se utiliza la siguiente notación:
i: hacer referencia a el nivel (1≤ i ≤3)
j: hace referencia a la configuración (1≤ j ≤8)
K: hace referencia a la réplica (1≤ k ≤3)

Se registran los datos de la siguiente manera:

Yjik: es el resultado del ensayo transformado en logarítmicamente (log10) en el
nivel i para la configuración j de la replica k utilizando el método alternativo;
Yp1 y p2: son las dos medias de los valores pareados y, con p denotado de la
muestra respectivamente (1≤ p ≤12) de las configuraciones correspondientes.

Referencia: ISO 16140-3: 2021

Referencia: ISO 16140-4: 2020 BV_C2_Internal

Referencia: ISO 16140-4: 2020 BV_C2_Internal
 I. CÁLCULO DE LA VERACIDAD RELATIVA
Es un estudio de comparación entre los resultados obtenidos con el
método de referencia y los resultados del método alternativo.
Para el cálculo se debe tener en consideración lo siguiente:
• Se deben utilizar muestras contaminadas de forma natural o
artificial. Para ello se analizaran distintos artículos, tipos y
categorías.
• Se deben de incluir al menos 3 tipos de alimentos por cada
categoría.
• Para cada categoría se deberá examinar un mínimo de 15
muestras (proveniente de 3 tipos de diferentes)

Referencia: ISO 16140-3: 2021

Referencia: ISO 16140-4: 2020 y ISO 16140-2: 2016 (item 6.1.2) BV_C2_Internal
 I. CÁLCULO DEL PERFIL DE EXACTITUD
Es un estudio de comparación de los resultados obtenidos por el método de
referencia con el método alternativo.
Para el cálculo se debe tener en consideración lo siguiente:
• Se deben utilizar muestras contaminadas de forma natural o artificial.
Para ello se analizaran distintos artículos, tipos y categorías.
• Se deben de incluir al menos 1 tipo utilizando seis muestras por cada
tipo. De las 6 muestras, debería haber dos: 2 nivel bajo, 2 nivel
intermedio y 2 nivel alto (deberían cubrir el rango del tipo de alimento
seleccionado)
• Para cada categoría se deberá examinar un mínimo de 15 muestras
(proveniente de 3 tipos de diferentes).

https://standards.iso.org/iso/16140/-4/ed-1/en/
Referencia: ISO 16140-3: 2021

Referencia: ISO 16140-4: 2020 y ISO 16140-2: 2016 (item 6.1.3) BV_C2_Internal
BV_C2_Internal
I. CÁLCULO DEL PERFIL DE EXACTITUD

BV_C2_Internal
BV_C2_Internal
BV_C2_Internal
 RESUMEN DE LOS LÍMITES DE ACEPTABILIDAD PARA
LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

Referencia: ISO 16140-4: 2020 BV_C2_Internal

 DESARROLLO DE TALLER

Referencia: ISO 16140-4: 2020 (Anexo E) BV_C2_Internal

BV_C2_Internal