PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 3

TINCIONES

1. Objetivo
Observar la morfología de las bacterias empleando diferentes tipos de tinciones

2. Temas de estudio
● Generalidades y manejo del microscopio
● Morfología y Estructura bacteriana
● Tinciones
3. Fundamento teórico

Las bacterias son prácticamente transparentes (hialinas), por ello no es recomendable su

estudio mediante la observación de suspensiones de células en agua. El empleo de
colorantes biológicos permite aumentar el contraste entre la célula bacteriana y el medio
ambiente y a través del empleo de técnicas especiales, es posible distinguir algunos de los
constituyentes celulares más importantes. Cualquiera sea el procedimiento de tinción, éste
produce la muerte de la célula y en cierto modo la alteración de la estructura física de la
bacteria.

A pesar de los inconvenientes mencionados, las tinciones prestan una gran utilidad en el
estudio e identificación de las especies bacterianas.

3.1 Colorantes

Son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo que otorga color a la molécula
y un grupo auxócromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse
electrolíticamente y por lo tanto formar sales. Los colorantes que se ionizan en átomos o
moléculas de carga positiva reaccionan con estructuras celulares que posean cargas
negativas o viceversa.

Los colorantes se clasifican en ácidos, básicos y neutros.

a) Tinción básica es aquella en que el color está dado por el ion cargado
positivamente
b) Tinción ácida es aquella en que el color está dado por el ion cargado negativamente
c) Tinción neutra es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos
colorantes ácidos y básicos.

En general, las bacterias tienen afinidad por los colorantes de carácter básico. Estos
colorantes llevan en su parte cromófora carga electropositiva, la que tendría una fuerte
afinidad por las sustancias electronegativas que normalmente presentan las bacterias
El pH del medio tiene gran influencia en la tinción ya que permite una mayor o menor
disociación electrolítica del grupo auxocromo, permitiendo de esta manera una mayor o
menor afinidad por los grupos químicos sobre los cuales se une.

Si se aumenta el pH del medio existe una mayor afinidad del colorante por la bacteria,
sucediendo lo contrario si el pH se hace más ácido.

La fijación de colorantes a la célula bacteriana se facilita con el uso de mordientes, con los
que forman compuestos insolubles (yodo, fenol, ácido tánico, oxalato de amonio, etc.).

Algunos de los colorantes más empleados en microbiología son: azul de metileno, violeta de
genciana, fucsina básica, safranina, verde de malaquita, etc.

3.2 Tinciones

Las tinciones pueden clasificarse en: tinciones simples, diferenciales y especiales.

a) Tinciones simples. Son aquellas en que se utiliza un solo colorante. Su utilidad es

relativa, ya que sólo permite observar forma y agrupación celular.

b) Tinciones diferenciales. Permiten establecer diferencias tintoriales entre grupos de

bacterias, debido a ello son las más utilizadas en la identificación de bacterias. Estas
tinciones se basan en la aplicación de dos colorantes, un mordiente y un compuesto
químico decolorante; de esta forma las bacterias de diferente afinidad tintorial (reacción)
se observan teñidas de distinto color.

c) Tinciones especiales: Permiten poner de manifiesto alguna estructura especial de la

célula bacteriana, ej.: material nuclear, membrana citoplasmática, flagelos, cápsulas,
esporas, etc.

Tinción Gram

Cuando las bacterias son teñidas tanto con un colorante básico como el cristal violeta o
violeta de genciana y el frotis es tratado luego con una solución de yoduro (mordiente),
los cuerpos de algunas captan el colorante y el yoduro, produciendo un color que no
puede ser eliminado con alcohol-acetona; mientras que sí es fácilmente eliminado en otras
bacterias por medio de estos disolventes.

Las células Gram positivas retienen el complejo “cristal violeta – yodo”, que no puede ser
decolorado por soluciones alcohólicas o de acetona, por lo que permanecen de color azul
violeta.

Las células Gram negativas se decoloran completamente ante la presencia de alcohol o

acetona, por lo que toman el color del colorante de contraste y aparecen rojo rosáceo.
La base de la reacción diferencial de Gram es la estructura de la pared celular.
4. Parte experimental
4.1 Material
Cultivos bacterianos Portaobjetos
Asas microbiológicas Piceta
Mechero Bunsen Papel absorbente

4.2 Reactivos
Agua destilada o solución fisiológica 0.9 % estériles
Solución de azul de metileno al 1%
Kit de tinción Gram:
Solución cristal violeta al 1%
Solución de fucsina básica al 0.5 %
Solución de lugol
Solución decolorante alcohol-acetona (1:1)

4.3 Equipo
Microscopios ópticos compuestos de campo claro

4.4 Procedimientos
a) Preparación del frotis (extensiones) bacteriano

Los frotis de bacterias procedentes de cultivos en medios sólidos (agares) se hacen

sobre portaobjetos de vidrio, como sigue:

Lavar el porta objeto con agua y detergente, secarlo y desengrasarlo con

alcohol
Esterilizar el asa microbiológica sometiéndola directamente de forma vertical a
la llama del mechero hasta que en toda su longitud se ponga al rojo vivo
Enfriarla sumergiéndola en un tubo con agua destilada o solución fisiológica
Retirarla y depositar la gota de líquido sobre el portaobjetos
● Con el asa estéril ya fría tomar una pequeña colonia aislada o una porción del
cultivo que se quiera identificar, mezclarla con la gota de agua realizando
movimientos circulares hasta lograr una emulsión.
● Se deben conseguir extensiones finas y delgadas
● Dejar que la preparación se seque al aire y luego proceder a la fijación del
extendido. Este proceso puede realizarse mediante calor o mediante
productos químicos como el alcohol.
La fijación por el calor se realiza pasando lentamente el portaobjetos en
posición horizontal sobre la llama de un mechero. Se repite la última operación
dos o tres veces hasta lograr la sequedad total, cuidando de impedir la
combustión del extendido.
 Los frotis de bacterias a partir de cultivos en medio líquido se hacen de la miama
forma, excepto que no se precisa la dilución con agua.

b) Tinción simple
● Cubrir el frotis ya fijado con algún colorante básico, por ejemplo azul de
metileno (dos minutos)
● Lavar suavemente con agua
corriente Escurrir y dejar secar al
aire.
● Colocar una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con el
objetivo que corresponde.

c) Tinción diferencial (Gram)

● Cubrir la extensión con cristal violeta durante 1 min, cuidando que el

colorante cubra toda la preparación.
● Eliminar el exceso de colorante y lavar rápidamente con agua, manteniendo
el portaobjeto en posición inclinada.
● Cubrir el frotis con lugol durante 1
min. Lavar nuevamente con agua.
● Aplicar la solución decolorante de alcohol-acetona, durante 30 segundos
Lavar y escurrir
● Colorar el colorante de contraste, safranina por 30
segundos. Lavar y escurrir
● Secar al aire o en estufa
● Colocar una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con el
objetivo apropiado.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

● Diaz Gamazo. Manual Práctico de Microbiología. Masson. 3

ed. 2005
● Trigoso. Bacteriología básica. UMSA. 1992.
● Trigoso. Atlas de observación microscópica de bacterias.
UMSA.
● Tortora. Introducción a la Microbiología. Panamericana.
2009.
● Prescott. Microbiología. Mc Graw Hill. 7 ed. 2008
● Murray. Microbiología Médica. 7 ed. Elsevier.