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Descendencia viable derivada de ovocitos de mamíferos

únicos no fertilizados
Yanchang Weia,b,1 , Cai-Rong Yanga,b,c, y Zhen-Ao Zhaoa,b,d
un b
Centro de Medicina Reproductiva, Hospital Ren Ji, Facultad de Medicina, Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai 200135, China; Laboratorio clave de Shanghái para
C
Reproducción Asistida y Genética Reproductiva, Shanghai 200135, China; d94143 ; y Centro de Ciencias de la Reproducción, Universidad de California, San Francisco, CA
State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias, Beijing 100101, China

Editado por Elizabeth Robertson, Escuela de Patología Sir William Dunn, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido; recibido el 18 de agosto de 2021; aceptado
DESARROLLO
DE BIOLOGÍA

19 de enero de 2022

En los mamíferos, una nueva vida comienza con la fusión de un ovocito y un barrera que impide que los embriones bimaternales se desarrollen a término
espermatozoide. La partenogénesis, una forma de generar descendencia (3, 4), primero preguntamos si la reescritura de metilación dirigida de estos
únicamente a partir de gametos femeninos, está limitada debido a los problemas dos ICR podría mejorar el desarrollo partenogenético. Utilizamos una
derivados de la impronta genómica. Aquí, informamos descendencia de estrategia que puede lograr la edición de metilación dirigida de la región de
mamíferos vivos derivados de ovocitos no fertilizados individuales, que se logró impresión de un alelo pero no del otro. Empleamos ratones de fondo
mediante la reescritura de metilación de ADN dirigida de siete regiones de control de B6CASTF1
impresión. (C57BL/6 $ × CAST #), que portan suficientes polimorfismos de
La coinyección de ovocitos de ARN mensajero (ARNm) Cas9 (dCas9)-Dnmt3a un solo nucleótido (SNP) para una orientación específica. Diseñamos ARN
o dCpf1-Tet1 catalíticamente inactivo con ARN de guía única (ARNsg) dirigidos de guía única (sgRNA) con una región de motivo adyacente protospacer
a regiones específicas indujo la metilación o desmetilación de novo, (PAM) que coincide con un alelo pero no con el otro (Fig. 1A). Coinyectamos
respectivamente, de la región objetivo. Después de la activación partenogenética, Cas9 (dCas9)-Dnmt3a catalíticamente inactivo (ARNm) y sgRNA dirigidos a
estas regiones editadas mostraron el mantenimiento de la metilación como los ICR H19 y Gtl2 en ovocitos de vesícula germinal (GV) (Apéndice SI ,
regiones establecidas naturalmente durante el desarrollo temprano previo a la Tabla S1, que incluye todos los ARN guía [ARNg] utilizados en este estudio)
implantación. La transferencia de embriones partenogenéticos modificados a y determinaron los efectos de edición mediante secuenciación con bisulfito
madres adoptivas dio como resultado un desarrollo significativamente mayor y, de ovocitos en metafase única de la segunda meiosis (MII) utilizando un
finalmente, la generación de descendientes viables a término. Estos datos protocolo previamente desarrollado en nuestro laboratorio (18), que permite
demuestran que la partenogénesis se puede lograr mediante la reescritura la detección simultánea de metilación de una región específica del núcleo de
epigenética dirigida de múltiples regiones críticas de control de impresión. un solo ovocito y su primer cuerpo polar hermano (PB1) con alta eficiencia.
La secuenciación con bisulfito mostró que la mayoría de los alelos del fondo
ovocito j mamífero j descendencia j embrión temprano j impronta genómica
C57BL/6 estaban hipermetilados en el ICR H19, mientras que casi todos los
alelos del fondo CAST estaban hipometilados en el ICR H19, lo que indica
la metilación exitosa de novo del ICR H19 en uno alelo pero no el otro (Fig.
E n los mamíferos, una nueva vida comienza con el esperma con éxito 1B y Apéndice SI, Fig. S1). Utilizamos una estrategia similar para validar la
encuentro con el ovocito. La partenogénesis, una forma de generar
descendencia únicamente a partir de ovocitos no fertilizados, está limitada metilación de novo específica de alelo del Gtl2 ICR. Gtl2 contiene un ICR de
ÿ4,15 kb que regula la impronta de un grupo de genes de ÿ1 Mb debido a
en los mamíferos debido a los problemas derivados de la impronta genómica (1, 2).
Aunque los ratones bimaterno construidos con un ovocito sin crecimiento alelos específicos.
(ng), que imita el genoma paterno, y un ovocito completamente desarrollado
han sido generados por manipulación genética de regiones de impresión
específicas (3, 4), el uso del ovocito ng derivado de ratones recién nacidos
limita la aplicación de este método. La descendencia genética parteno, en la
que un individuo se desarrolla a partir de un solo ovocito no fertilizado, no
se ha informado en mamíferos. Significado
La coordinación fina entre los genomas paterno y materno es esencial
para el desarrollo de los mamíferos (5–8). Sin embargo, esta coordinación En los mamíferos, la partenogénesis está limitada debido a los problemas
se interrumpe en los embriones partenogenéticos debido al establecimiento derivados de la impronta genómica. Aquí, reportamos crías de mamíferos
doble de la impronta materna específica del genoma diploide. Varias regiones vivos derivadas de huevos únicos no fertilizados. Esto se logró mediante la
de control de impresión (ICR) metiladas paternamente, incluidas las ICR reescritura de la metilación del ADN dirigida de siete regiones de control de
H19 (9) y Gtl2 (10), funcionan en la regulación de genes que son esenciales impresión. Mediante el diseño de ARN guía con secuencias de motivos
para el desarrollo embrionario. Se ha demostrado que varios ICR metilados
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adyacentes al protoespaciador (PAM) que coinciden con un alelo pero no

por la madre, como Igf2r (11), Snrpn (12), Kcnq1ot1 (13), Nes pas (14) y
Peg10 (15), desempeñan un papel fundamental en la regulación del
desarrollo fetal y/o fetal. o crecimiento y desarrollo posnatal. Además,
algunos estudios han identificado varias regiones de impronta que son
críticas para apoyar el desarrollo a término completo de embriones bimaterno
y bipaterno (16, 17).
En este estudio, examinamos si la reescritura epigenética específica de
estas regiones podría mejorar el desarrollo partenogenético. Mediante la
edición de metilación dirigida de siete ICR, pudimos generar descendencia
viable a término completo directamente a partir de ovocitos de ratón
individuales no fertilizados.
con el otro, dCas9-Dnmt3a o dCpf1-Tet1 permiten la edición de la metilación
del ADN dirigida de manera específica al alelo. El éxito de la partenogénesis
en los mamíferos abre muchas oportunidades en la agricultura, la
investigación y la medicina.
Contribuciones de los autores: investigación diseñada por YW; YW, C.-RY y Z.-AZ realizaron investigaciones; YW,
C.-RY y Z.-AZ contribuyeron con nuevos reactivos/herramientas analíticas; YW, C.-RY y Z.-AZ analizaron los datos;
y YW y C.-RY escribieron el documento.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Este artículo es una presentación directa de PNAS.
Este artículo se distribuye bajo Creative Commons Attribution-NonCommercial NoDerivatives License 4.0 (CC BY-
NC-ND).
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1A quién puede dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: weiyc@shsmu.edu.cn.

Resultados y discusión
Este artículo contiene información de apoyo en línea en http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/
Debido a que la evidencia previa demostró que dos ICR paternamente pnas.2115248119/-/DCSupplemental .

metilados, los ICR H19 y Gtl2, forman el principal Publicado el 7 de marzo de 2022.

PNAS 2022 vol. 119 nº 12 e2115248119 https://doi.org/10.1073/pnas.2115248119 j 1 de 7

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Fig. 1. Reescritura de metilación de ADN dirigida de ICR H19 y Gtl2 en embriones partenogenéticos. (A) Estrategia para apuntar a un alelo pero no al otro. Él
La secuencia de sgRNA está subrayada. El PAM para sgRNA (NGG) está etiquetado con un cuadro rojo. La flecha indica el SNP (C57BL/6, G; CAST, A). (B) De objetivo
metilación novo del H19 ICR en el alelo C57BL/6 en ovocitos. Se sometieron ovocitos MII individuales a análisis de secuenciación con bisulfito. Cada ovocito
a la muestra se le asignó una identificación que comenzaba con una letra, seguida de un número de dos dígitos. Diferentes letras representan diferentes donantes de ovocitos y diferentes
números distinguen diferentes ovocitos de la misma donante. Los círculos blancos representan dinucleótidos CpG no metilados (CpG) y los círculos negros representan
CpG metilados. El polimorfismo se indica con rojo para G del alelo C57BL/6 y con verde para A del alelo CAST. dos adicionales
las regiones para H19 están presentes en el Apéndice SI, Fig. S1. La edición de la metilación de Gtl2 ICR está presente en el Apéndice SI, Fig. S2. (C) Mantenimiento de la metilación del
H19 ICR en embriones partenogenéticos de preimplantación. Una representación esquemática de la construcción de partenogenética supuestamente diploide
embriones se muestra en el Apéndice SI, Fig. S6A. Después de la activación partenogenética y el cultivo embrionario in vitro, un tercio del ADN convertido de 30 a
Se sometieron 40 blastocistos E 3.5 agrupados a análisis de secuenciación con bisulfito. Dos regiones adicionales para H19 están presentes en el Apéndice SI, Fig. S6B. El mantenimiento
de la metilación de Gtl2 ICR está presente en el Apéndice SI, Fig. S6C. (D) Fetos a los 13,5 días derivados de embriones fertilizados de control (izquierda). Sin modificar
los embriones partenogenéticos se desarrollaron hasta los 13,5 días y se muestra el feto más avanzado a los 12,5 días derivado de embriones partenogenéticos modificados (derecha).
(E) Análisis PCR cuantitativo en tiempo real de genes impresos regulados por ICR paternalmente metilados en control (columnas blancas) y embriones partenogenéticos reconstruidos
(columnas negras) E 9.5. (F) Análisis de PCR cuantitativo en tiempo real de genes impresos regulados por ICR metilados maternamente en control
(columnas blancas) y embriones partenogenéticos reconstruidos (columnas negras) E 9.5. Control, n = 9; partenogenética, n = 10. Los valores representan niveles de expresión relativos a
los del gen de control interno Gapdh. Los datos se expresan como media ± SEM *P < 0,05, **P < 0,01, frente al control. la línea punteada
(establecido como 1) representa el promedio de los niveles de expresión de cada gen de los controles. (G) Ensayos SNuPE para la expresión específica de alelo de los genes indicados.
Los carriles 1 y 2 contenían ADN derivado del ARN agrupado de embriones E 9.5 control partenogenéticos y fertilizados reconstruidos, respectivamente. Carriles 3
y 5 contenían ADN derivado del ARN agrupado de embriones C57BL/6 y CAST E 9.5, respectivamente. El carril 4 contenía ADN derivado de una mezcla 1:1
de ARN de embriones C57BL/6 y CAST E 9.5.

2 de 7 j PNAS Wei et al.

https://doi.org/10.1073/pnas.2115248119 Descendencia viable derivada de ovocitos de mamíferos únicos no fertilizados
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metilación (10). Se diseñaron cuatro sgRNA para apuntar a este
locus, y tres regiones dispersas en el ICR se utilizaron para
análisis de metilación para validar el efecto de focalización. La mayoría de los
alelos del fondo C57BL/6 mostró hipermetilación en estas tres regiones, lo
que sugiere la edición de metilación específica de alelo potencialmente exitosa
de Gtl2 ICR (SI
Apéndice, Fig. S2). El rango de orientación efectivo de este sistema
puede tener más de 500 pb en ambos lados del sitio de orientación de gRNA
pero no se extiende más allá de 1.000 pb en cualquier lado (Apéndice SI,
Higo. S3). Por lo tanto, diseñar múltiples sgRNA dentro de un locus objetivo
con un intervalo apropiado proporcionaría una edición efectiva
eficiencia y alta especificidad que, además, no sería
se espera que se extienda a los promotores de genes vecinos. Reemplazar
sgRNA con sgRNA codificado o Dnmt3a con un
forma inactiva resultó en ninguna inducción, excluyendo la posibilidad
de sobreexpresión de Dnmt3a o introducción de ARN pequeño (SI
Apéndice, Fig. S4). Análisis fuera del objetivo de los tres más probables
los loci fuera del objetivo no mostraron cambios significativos en la metilación,
lo que sugiere la especificidad potencialmente alta de este sistema (SI
Apéndice, Fig. S5). Después de la activación partenogenética e in vitro
cultivo embrionario, estos día embrionario partenogenético (E) 3.
5 blastocistos exhibieron hipermetilación tanto en H19 como en Gtl2
ICR derivados del alelo de fondo C57BL/6 pero hipometilación del alelo
derivado del fondo CAST, lo que sugiere el mantenimiento de la metilación
durante la preimplantación
desarrollo (Fig. 1C y Apéndice SI, Fig. S6). A continuación, transferimos
blastocistos E 3.5 partenogenéticos modificados H19me+Gtl2me+
en madres adoptivas CD1. Sin embargo, no obtuvimos el desarrollo de una
descendencia a término, como lo demuestra la mayoría de los
embriones muriendo antes de E 12.5 (Fig. 1D). Cuantitativo en tiempo real
El análisis de PCR reveló una expresión en gran parte normal de la
genes impresos regulados por los dos metilados paternalmente
ICR, H19 y Gtl2 (Fig. 1E), pero la expresión anormal de la
genes impresos regulados por ICR maternalmente metilados (Fig.
1F). La expresión específica de alelo se midió mediante la extensión del
cebador de un solo nucleótido (SNuPE) después de la RT-PCR (19, 20).
Los embriones partenogenéticos con ambos ICR editados mostraron en gran medida
expresión monoalélica de H19 e Igf2 (Fig. 1G, carril 1), que
es similar a la expresión monoalélica vista en el fertilizado
embriones de control (Fig. 1G, carril 2). Por el contrario, estos embriones
no mostró ninguna expresión de ninguno de los alelos de Snrpn, que
normalmente se expresa solo a partir del alelo paterno, y bialélico
expresión de Igf2r, que normalmente se expresa sólo a partir de la
alelo materno (Fig. 1G). El H19 ICR contiene cuatro
sitios de unión CTCF sensibles a la metilación, que son críticos para
regulando la impronta de este grupo de impronta (Apéndice SI,
Figura S1A, que muestra una representación esquemática del H19
ICR con información sobre cuatro sitios de unión de CTCF dentro de él)
(21). Para determinar si la edición de metilación altera CTCF
unión, realizamos un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina CTCF
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(ChIP) en estos cuatro loci. La unión de CTCF a
los cuatro sitios objetivo fue comparable en muestras de embriones
partenogenéticos modificados y en muestras de embriones naturalmente
embriones fertilizados (Apéndice SI, Fig. S7), sugiriendo devuelto
Unión de CTCF como resultado de la edición de metilación.
Luego dirigimos nuestra atención a los ICR maternalmente metilados.
Seleccionamos cinco ICR maternalmente metilados cuyas anormalidades
han sido vinculados a la letalidad embrionaria o postnatal o severa
trastornos del desarrollo (22). Estos fueron Igf2r (11), Snrpn (12),
Kcnq1ot1 (13), Nespas (14) y Peg10 (15) ICR (Apéndice SI,
Tabla S1, que resume todos los ICR objetivo, así como todos
de los ARNg utilizados en este estudio). PCR cuantitativa en tiempo real
análisis reveló que los genes impresos regulados por estos cinco
Los ICR se expresaron de manera anormal como se describió anteriormente (Fig. 1F).
Preguntamos si la edición dirigida de la metilación de estos cinco
Los ICR, junto con los ICR H19 y Gtl2, podrían mejorar aún más
desarrollo partenogenético. Para lograr la desmetilación dirigida
de un alelo pero no del otro, usamos dCpf1-Tet1, que utiliza
Wei et al.
Descendencia viable derivada de ovocitos de mamíferos únicos no fertilizados
TTN como el PAM (23), y diseñó sgRNA con secuencias de PAM que
coincidían con un alelo pero no con el otro (Fig. 2A). Coinyectamos dCpf1-
Tet1 mRNA con sgRNA dirigidos a estos cinco
regiones en ovocitos GV y evaluó el efecto de edición en ambos
Oocitos MII y blastocistos E 3.5 partenogenéticos. Ovocito único
La secuenciación con bisulfito mostró que en la mayoría de los ovocitos, uno
el alelo estaba hipometilado, mientras que el otro permanecía hipermetilado,
lo que demuestra el éxito de la edición con este sistema
(Fig. 2B y Anexo SI, Fig. S8). Además, después de la activación y
En cultivo embrionario in vitro, estas marcas editadas mostraron un
mantenimiento de la metilación durante el desarrollo previo a la implantación, DESARROLLO
DE BIOLOGÍA
similar a las marcas establecidas naturalmente (Fig. 2C y Apéndice SI, Fig.
S9). El rango de edición de este sistema puede superar los 500 pb en ambos
lados de la secuencia objetivo (Apéndice SI, Fig. S10 A y B). En
en contraste, un gRNA ÿ 1,200 pb aguas arriba de la región analizada
indujo solo desmetilación parcial (Apéndice SI, Fig. S10C).
Diseño de múltiples sgRNA con un intervalo de menos de 1000 pb
podría desmetilar efectivamente el locus objetivo. el reemplazo de
sgRNAs con sgRNAs codificados o Tet1 con su forma inactiva
no mostró ninguna inducción, excluyendo que este efecto se debió a
la sobreexpresión de Tet1 o la introducción de ARN pequeño (SI
Apéndice, Fig. S11). Análisis fuera del objetivo de tres loci candidatos
no mostró ninguna actividad significativa fuera del objetivo, lo que sugiere el potencial
alta especificidad de este sistema (Apéndice SI, Fig. S12).
A continuación, para determinar si la modificación simultánea de
dos ICR metilados paternamente a través de dCas9-Dnmt3a y cinco
ICR maternalmente metilados a través de dCpf1-Tet1, como se mencionó
anterior, podría extender aún más el desarrollo, construimos embriones
partenogenéticos con las siete regiones modificadas (SI
Apéndice, Fig. S13 para el esquema). PCR cuantitativa en tiempo real
de genes regulados por estos ICR reveló significativamente
expresión mejorada en embriones partenogenéticos E 9.5 (Fig. 2
D y E). El ensayo SNuPE mostró en gran medida una expresión monoalélica
de H19, Igf2, Snrpn e Igf2r (Fig. 2F, carril 1) en estos
embriones modificados, que es similar al patrón de expresión monoalélica
visto en los embriones de control fertilizados (Fig. 2F, carril
2). Después de la transferencia de 158 blastocistos E 3.5 a 12 ratones
adoptivos pseudopreñados, pudimos obtener 13 ratones viables.
fetos de tres hembras en E 13.5, como lo demuestra una clara
latidos del corazón Estos datos sugieren que una mayor edición de metilación
mejoró significativamente el desarrollo partenogenético. De estos
13 embriones, seleccionamos 6 para el análisis de metilación de los siete
ICR editados en cada embrión individual. La secuenciación genómica con
bisulfito reveló que dos embriones poseían patrones de metilación en gran
medida normales en los siete ICR editados, mientras que los restantes
cuatro mostraron metilación anormal en varios ICR, y cada uno
tenía al menos una ICR (Apéndice SI, Fig. S14). Estos datos sugieren que
solo una parte de los embriones se puede editar simultáneamente con éxito
en los siete ICR.
En la siguiente serie de experimentos, construimos embriones genéticos
parteno con dos ICR metilados paternamente y cinco
ICR metilados maternamente modificados, que designamos
embriones partenogenéticos2+5 ; transfirieron blastocistos E 3.5 a
madres adoptivas; y les permitió desarrollarse a término. Un total de
Se construyeron 389 embriones2+5 modificados mediante micromanipulación.
Después de la activación artificial, 227 (58,4%) parten supuestamente de
embriones diploides de una célula nogenéticos que formaron dos pronúcleos.
y se recuperaron segundos cuerpos polares. Después del cultivo embrionario
in vitro, 192 (84,6%) desarrollaron el estadio de blastocisto y
fueron transferidos a 14 hembras receptoras. Un total de tres
(1,6%) se recuperaron crías vivas mediante autopsia a los 19,5 días de
gestación (Tabla 1). Dos de estos cachorros tenían un peso corporal más bajo (0.783
y 0,832 g) y presentó ligero retraso en el crecimiento al nacer;
estos cachorros murieron dentro de las 24 h. El cachorro restante tenía cuerpo
peso (1,101 g) similar al del tipo salvaje (1,147 ± 0,042 g;
media ± SEM) y creció hasta la edad adulta (Fig. 3A). Bisulfito
la secuenciación del tejido de la cola derivado del ratón sobreviviente demostró
que todos los ICR editados exhibieron una metilación correcta
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Fig. 2. Reescritura de metilación dirigida de cinco ICR metilados maternamente en embriones partenogenéticos. (A) Estrategia para apuntar a un alelo pero no al
otro. La secuencia de sgRNA está subrayada. El PAM para sgRNA (TTN) está etiquetado con un cuadro rojo. La flecha indica el SNP (C57BL/6, T; CAST, G). (B) Desmetilación dirigida de
Snrpn ICR en el alelo C57BL/6 en ovocitos. En la parte superior del panel se muestra un esquema que ilustra el lugar geométrico de ICR de Snrpn. Él
región sujeta a análisis de metilación se indica mediante un rectángulo verde. Los gRNA se indican mediante barras azules. Se sometieron ovocitos MII individuales a
análisis de secuenciación de bisulfito. A cada muestra de un solo ovocito se le asignó una identificación que comenzaba con una letra, seguida de un número de dos dígitos. Diferentes letras
representan diferentes donantes de ovocitos, y diferentes números distinguen diferentes ovocitos de la misma donante. Los círculos blancos representan CpG no metilados,
y los círculos negros representan CpG metilados. El polimorfismo se indica con rojo para G del alelo C57BL/6 y con verde para T del CAST
alelo La edición de la metilación de otros cuatro ICR metilados maternamente (Igf2r, Kcnq1ot1, Peg10 y Nespas ICR) está presente en el Apéndice SI, Fig. S8.
(C) Mantenimiento de la metilación del Snrpn ICR en embriones de preimplantación partenogenéticos. La microinyección de ARN y la construcción de supuestamente
embriones partenogenéticos diploides se realizaron como se describe anteriormente. Después de la activación partenogenética y el cultivo embrionario in vitro, una quinta parte de los
El ADN convertido de ~100 blastocistos E 3.5 agrupados se sometió a análisis de secuenciación con bisulfito. El mantenimiento de la metilación de otros cuatro ICR es
presente en el Apéndice SI, Fig. S9. (D) Análisis PCR cuantitativo en tiempo real de genes impresos regulados por ICR paternalmente metilados en control (columnas blancas) y embriones E
9.5 partenogenéticos modificados (columnas negras). (E) Análisis PCR cuantitativo en tiempo real de genes impresos regulados por
ICR metilados en control (columnas blancas) y embriones E 9.5 partenogenéticos reconstruidos (columnas negras). Control, n = 9; partenogenético, n = 8. El
los valores representan niveles de expresión relativos a los del gen de control interno Gapdh. Los datos se expresan como media ± SEM *P < 0,05, **P < 0,01, versus
control. La línea de puntos (establecida como 1) representa el promedio de los niveles de expresión de cada gen de los controles. (F) Ensayos SNuPE para la expresión específica de alelos de
los genes indicados. Los carriles 1 y 2 contenían ADN derivado del ARN agrupado de embriones E 9.5 de control partenogenéticos y fertilizados reconstruidos,
respectivamente. Los carriles 3 y 5 contenían ADN derivado del ARN agrupado de embriones C57BL/6 y CAST E 9.5, respectivamente. El carril 4 contenía ADN derivado
de una mezcla 1:1 de ARN de embriones C57BL/6 y CAST E 9.5.

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Tabla 1. Desarrollo de embriones partenogenéticos modificados2 +

5 Progreso del desarrollo No.

N.° de ovocitos reconstruidos N. 227

° de ovocitos desarrollados hasta blastocisto 192 (84,6% de ovocitos reconstruidos) 192
N.° de embriones transferidos N.° de (100% de blastocistos) 14/14 3 (1,6% de
gestantes/receptoras N.° de crías vivas N.° embriones transferidos a receptoras) 1
de crías sobrevivientes (0,5% de embriones transferidos a receptoras)

patrones, lo que indica que las marcas de metilación editadas se heredaron (Fig. 3 C y D y Apéndice SI, Fig. S15 B y C). Observamos que aunque el
al organismo completamente desarrollado, lo cual es fundamental para único ratón con un peso corporal normal al nacer creció hasta la edad adulta,
apoyar el desarrollo partenogenético a término completo (Fig. 3B y Apéndice mostró un retraso en el crecimiento posnatal, con una reducción aproximada
SI , Fig. S15A). En contraste, la secuenciación con bisulfito del tejido de la del 19,8 % en el peso corporal en comparación con los controles (Apéndice DESARROLLO
DE BIOLOGÍA

cola de dos ratones partenogenéticos que murieron dentro de las 24 h
posteriores al nacimiento demostró que al menos uno de los siete ICR
exhibió pérdida de impronta de metilación, lo que confirma que los siete ICR
son necesarios para el desarrollo a término completo del ratón partenogenético. embriones
SI, Fig. S16A). Esto podría explicarse por el tercer ICR crítico paternalmente
metilado, Rasgrf1 ICR, que regula la expresión de Rasgrf1 y no fue editado.
Rasgrf1 regula el crecimiento posnatal al inducir la secreción de hormona
de crecimiento de la glándula pituitaria (24), y en nuestro estudio, la
expresión de Rasgrf1 se reguló a la baja en los cerebros de ratones
partenogenéticos en comparación con los de los controles (Apéndice SI, Fig.
S16B). Después de aparearse con un semental macho a las 16 semanas de
edad, el ratón partenogenético mostró un rendimiento reproductivo normal
(Fig. 3 A). La PCR cuantitativa en tiempo real de cerebros derivados de tres
cachorros seleccionados al azar reveló niveles de expresión normales de
Rasgrf1, lo que sugiere que el trastorno de impronta primaria no puede
transmitirse potencialmente a la próxima generación debido a una nueva
ronda de reprogramación epigenética de la línea germinal (Apéndice SI, Fig.
S17) .
Para determinar aún más si el Rasgrf1 ICR no modificado explica el
retraso del crecimiento posnatal observado en ratones partenogenéticos,
realizamos una edición de metilación adicional de este locus. El grupo de
impronta Rasgrf1 contiene un ICR paternalmente metilado de ~8 kb (25).
Diseñamos ocho sgRNA dirigidos a este locus (Apéndice SI, Tabla S2 y Fig.
S18A). Después de la validación de los sgRNA efectivos en ovocitos
(Apéndice SI, Fig. S18 B–D), los aplicamos a la construcción de embriones
partenogenéticos.
Construimos embriones partenogenéticos con siete ICR mencionados
anteriormente, junto con la modificación Rasgrf1 ICR, que denominamos
embriones partenogenéticos3+5 . La transferencia de 155 E 3.5 embriones
partenogenéticos3+5 generó dos crías vivas (Apéndice SI, Tabla S3). Ambos
tenían un peso corporal (1,142 y 1,104 g) similar al de los controles (1,138
± 0,034 g; media ± SEM) al nacer y sobrevivieron hasta la edad adulta.
Ambos ratones exhibieron patrones de metilación normales en Rasgrf1 ICR
(Apéndice SI, Fig. S18E).
Las trayectorias de peso corporal mostraron un aumento de peso corporal
de ambos ratones comparable al de los controles de tipo salvaje (Apéndice
SI, Fig. S18F), apoyando la hipótesis de que el Rasgrf1 ICR no modificado
contribuyó al retraso del crecimiento posnatal del individuo partenogenético.

Juntos, estos datos demuestran que la partenogénesis se puede lograr

en mamíferos mediante la regulación epigenética adecuada de múltiples
ICR. Esto es consistente con la famosa hipótesis del conflicto parental
Fig. 3. Generación de ratones partenogenéticos mediante la reescritura de
(también conocida como la hipótesis de Haig) (6, 7), que propone que el
metilación dirigida de siete ICR. (A) Ratones partenogenéticos que crecieron hasta
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el

equilibrio mediado por la impronta entre los genomas paterno y materno es

la edad adulta con un rendimiento reproductivo normal. Se muestra una fotografía
del ratón parenogenético de ~4,5 meses de edad y su descendencia. (B)
fundamental para el desarrollo de los mamíferos.
Secuenciación con bisulfito de H19 ICR y Peg10 ICR en el ratón partenogenético
vivo. El estado de metilación de otros cinco ICR del ratón partenogenético vivo está Consideramos varias posibilidades para explicar la baja eficiencia de la
presente en el Apéndice SI, Fig. S15A. (C) Secuenciación con bisulfito del H19 ICR generación de ratones partenogenéticos. Primero, solo una pequeña porción
en un ratón partenogenético con retraso en el crecimiento que estaba vivo a de embriones con las siete regiones de impronta corregidas pueden soportar
término pero murió dentro de las 24 h. El estado de metilación de otros seis ICR el desarrollo a término completo. De acuerdo con esta idea, dos de seis
está presente en el Apéndice SI , Fig. S15B. (D) Secuenciación con bisulfito de embriones E 13.5 (Apéndice SI, Fig. S14) y uno de los tres hijos recién
Peg10 ICR en el otro ratón partenogenético con retraso en el crecimiento que
nacidos (Apéndice SI, Fig. S15) exhibió una impresión de metilación correcta
estaba vivo a término pero murió dentro de las 24 h. El estado de metilación de
en las siete regiones editadas. De hecho, esto puede subestimar la
otros seis ICR está presente en el Apéndice SI , Fig. S15C. También se observó
frecuencia de embriones editados sin éxito. Especulamos que muchos
una metilación anormal en el Snrpn ICR de este animal. El ADN de la punta de la cola se usó para el análisis de metilación.
Los círculos blancos representan CpG no metilados y los círculos negros embriones modificados con impronta incorrecta murieron antes de E 13.5 o
representan CpG metilados. El polimorfismo se indica con rojo del alelo C57BL/6 y del nacimiento. En segundo lugar, es posible que nos hayamos perdido
con verde del alelo CAST. lugares importantes adicionales. Uno de tales

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candidato es Grb10, que se ha demostrado que participa en el
generación de ratones bipaternos (16). Usando elegante haploide
técnicas de células madre embrionarias, Li et al. fueron capaces de generar
ambos ratones bimaterno y bipaterno por modificación genética de
múltiples regiones de impresión, entre las cuales Grb10 está involucrado en
el desarrollo a término completo de embriones bipaternos (16).
El éxito de la partenogénesis en los mamíferos abre muchas
oportunidades en agricultura, investigación y medicina. Más lejos
identificación y edición de ICR adicionales podría mejorar la
eficiencia del desarrollo partenogenético. Optimización adicional del
sistema de edición, como el empleo de quiméricos
Dnmt3a/3l (26) o varios dominios Dnmt3a a través de SunTag
sistema (27), podría mejorar la eficiencia de la edición múltiple
y mejorar la tasa de éxito de la generación de descendencia partenogenética
viable. También se requieren estudios futuros para evaluar exhaustivamente
los problemas fuera del objetivo.
Métodos
Ratones. Todos los procedimientos de cuidado y uso de animales se realizaron de acuerdo con las pautas.
del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Ratones utilizados para ovocitos
los donantes eran de fondo B6CASTF1 (C57BL/6 $ × CAST #), mientras que los ratones usaban
para las madres adoptivas eran antecedentes de CD1. Todos los ratones se alojaron bajo temperatura
controlada (22 ± 2 °C) e iluminación (ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h) y tenían
libre acceso a agua esterilizada y alimento granulado ad libitum.
Generación de mRNA y sgRNA de dCas9-Dnmt3a y dCpf1-Tet1. Introdujimos el promotor T7 en la
secuencia objetivo mediante PCR para generar plantillas utilizadas para la transcripción in vitro. Para
dCas9-Dnmt3a, el promotor T7 fue
agregado por PCR usando el cebador dCas9-Dnmt3a For y Rev (Apéndice SI, Tabla S4)
y el plásmido Addgene 84476 como molde. Para el dCas9-Dnmt3a inactivo
formulario, el promotor T7 se añadió por PCR usando el cebador dCas9-Dnmt3a IF Para
y Rev (Apéndice SI, Tabla S4) y el plásmido Addgene 84478 como molde.
Para dCpf1-Tet1 y su mutante, se usó PCR superpuesta para generar las plantillas (28). Para sgRNA
coinyectado con dCas9-Dnmt3a (o su mutante) mRNA,
el promotor T7 se agregó a sgRNA específicos mediante PCR usando diferentes cebadores
(Apéndice SI, Tabla S4) y el plásmido Addgene 42230 como molde. Para
CRISPR RNA (crRNA) coinyectado con dCpf1-Tet1 (o su mutante) mRNA, el T7
Se añadió el promotor al crRNA específico mediante PCR usando los diferentes cebadores. Los
cebadores utilizados se enumeran en el Apéndice SI, Tabla S4. Las secuencias proteicas completas de
dCas9-Dnmt3a y dCpf1-Tet1 y sus mutantes se enumeran en SI
Apéndice, Tabla S5. Se proporcionan detalles adicionales en el Apéndice SI,
Métodos SI.
Recolección y microinyección de ovocitos GV. Se usaron ovocitos en la etapa GV
para microinyección. Se aislaron ovarios de ratones hembra B6CASTF1 (8–12
semanas de edad) 46 h después de la inyección intraperitoneal de 10 unidades internacionales (UI) de
gonadotropina sérica de yegua preñada y complejos de ovocitos cumulus fueron
recuperados de los ovarios al pinchar repetidamente los folículos antrales con una fina
aguja de acero bajo el campo visual de un microscopio de disección (29). Cúmulo
las células se eliminaron mediante un breve tratamiento con hialuronidasa (3 mg/mL) en M2
medio. El mRNA dCas9-Dnmt3a o dCpf1-Tet1 (50 ng/ÿL) y sgRNA (20
ng/ÿL) se inyectaron en el citoplasma de los ovocitos GV con un bien reconocido
GV en medio M2. Se proporcionan detalles adicionales en el Apéndice SI, Métodos SI.
Construcción de embriones partenogenéticos. PB1 se transfirió al citoplasma del ovocito hermano MII
para formar embriones partenogenéticos diploides. Inicialmente, los ovocitos MII se trataron brevemente
con 5 ÿg/mL de citocalasina B en M2
medio durante ~5 min. Solo se usaron ovocitos maduros con PB1 redondo intacto para
más experimentos. PB1 fue succionado lentamente en la pipeta de inyección con un
accionado por piezoeléctrico y se aspiró brevemente hacia adentro y hacia afuera en polivinilpirrolidona
al 7% hasta que la membrana de PB1 se rompió ligeramente. Luego se inyectó PB1
en el citoplasma de los ovocitos hermanos MII. Los ovocitos MII fueron activados artificialmente
por tratamiento en medio M16 libre de Ca2+ que contiene SrCl2 10 mM durante 2 h. Él
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6 de 7 j PNAS
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embriones reconstruidos con dos segundos cuerpos polares y pronúcleos fueron
lavado y cultivado en gotitas de 50 ÿL de potasio simplex optimizado
medio suplementado con aminoácidos bajo aceite mineral a 37 °C en aire humidificado con 5% de CO2
hasta el estadio de blastocisto a los 3,5 d. Después de eso,
Se transfirieron 12–16 blastocistos a los cuernos uterinos de 2,5 días después del coito.
receptoras pseudoembarazadas (6 a 8 blastocistos por cada cuerno uterino). cachorros vivos
fueron recuperados por autopsia a los 19.5 d de gestación.
Secuenciación de bisulfito. La secuenciación genómica con bisulfito se realizó como se describió
anteriormente (18). Brevemente, para los ovocitos MII, la modificación con bisulfito se logró utilizando un
método previamente desarrollado en nuestro laboratorio (18). un solo
El ovocito MII que contenía su hermano genético PB1 se sometió a cada reacción.
Brevemente, se usó alcohol tetrahidrofurfurílico para proteger el ADN de la degradación. Se ligó un
adaptador de 9 nt con el ADN fragmentado y los fragmentos
se amplificaron tres veces para generar suficientes plantillas para la amplificación por PCR. En Métodos
SI se proporciona un procedimiento detallado para la secuenciación de bisulfito de la región específica
de un solo ovocito . Para los blastocistos, se combinaron blastocistos E 3.5
sometido directamente al kit EZ DNA Methylation-Direct (Zymo Research) para
conversión de bisulfito. Para E 13.5 embriones o tejidos somáticos, el ADN genómico fue
purificado utilizando el Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), después de
cuya modificación con bisulfito se logró usando la metilación de ADN EZ
Equipo (Zymo Research). Luego, el ADN convertido se amplificó por PCR con
secuencias de cebadores como se resumen en el Apéndice SI, Tabla S6. Detalles adicionales
se proporcionan en el Apéndice SI, Métodos SI.
PCR cuantitativa en tiempo real. Analizamos los niveles de ARNm por qRT-PCR después
transcripción inversa como se ha descrito antes (30). El ARN total se extrajo usando
el reactivo TRIzol (Invitrogen) y cuantificado por absorbancia a 260 y 280
nm en un espectrofotómetro PerkinElmer. Luego se usó como plantilla para
síntesis de ADN complementario mediante síntesis de primera cadena SuperScript III (Invitro gen) con
hexámeros aleatorios. La cantidad de ARNm se determinó con el
Sistema qRT-PCR 7500 (Applied Biosystems), utilizando secuencias de cebadores como se resume en
el Apéndice SI, Tabla S7 y SYBR Green SuperMix UDG (Invitrogen).
Se proporcionan detalles adicionales en el Apéndice SI, Métodos SI.
SNuPE. SNuPE se realizó como se describió previamente (19, 20). ARN total de
Los embriones E 9.5 se extrajeron utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) como se describe
sobre. Los productos de RT-PCR se aislaron del gel de agarosa utilizando el kit de extracción de gel
MinE laúd (Qiagen). Cebadores utilizados para distinguir C57BL/6 y CAST
los alelos fueron descritos por Szabo y Mann (20) y se enumeran en SI
Apéndice, Tabla S8. Se proporcionan detalles adicionales en el Apéndice SI,
Métodos SI.
Ensayo de chip. Realizamos ChIP como se describió anteriormente (31). el anticuerpo
utilizado en este experimento es un anticuerpo policlonal de conejo anti-CTCF (07729, poro Milli). Los
cebadores de qPCR se enumeran en el Apéndice SI, Tabla S9. Los detalles adicionales son
proporcionado en el Apéndice SI, Métodos SI.
Análisis estadístico. Los datos fueron analizados por SPSS 16.0 después de la transformación logarítmica
o transformación de raíz cuadrada a menos que los datos sin procesar se distribuyeran normalmente.
Las mediciones se analizaron mediante ANOVA o, si correspondía, mediante análisis de dos colas.
Prueba t de Student. Todos los datos se muestran como media ± SEM. Se consideró P < 0,05
Estadísticamente significante.
Disponibilidad de datos. Todos los datos del estudio están incluidos en el artículo y/o
información.
EXPRESIONES DE GRATITUD. Agradecemos a Y. Zhai, C. Zhang e Y. Zhang por la asistencia técnica;
Y. Yang para el análisis estadístico; Q. Zhang por el cuidado de los animales;
y Sangon Biotech Corporation (Shanghai, China) por su ayuda con la secuenciación. Este trabajo fue
apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFC1004500 y
2017YFC1001300), el Programa Nacional
Fundación de Ciencias Naturales de China (81601274), la Investigación Innovadora
Equipo de Universidades Locales de Alto Nivel en Shanghái (SSMU-ZLCX20180401), y
el Laboratorio Clave de Shanghai para la Reproducción Asistida y Reproductiva
Genética (20DZ2270900).
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