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GUÍA Nº 6
ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO DE
BACTERIÓFAGOS
OBJETIVOS

• Conocer y comprender el concepto de bacteriófago y como estas entidades

biológicas pueden ser usadas para la prevención y control de enfermedades
bacterianas.
• Conocer y aplicar las técnicas de enriquecimiento y aislamiento de bacteriófagos
• Obtener un cultivo puro de un fago a partir de una muestra ambiental mixta.

BACTERIOFAGOS

Los bacteriófagos o fagos son probablemente las entidades biológicas más abundantes en
el planeta. Son parásitos intracelulares obligados de bacterias y no poseen actividad
metabólica propia. El proceso de multiplicación de los fagos es complejo e implica varias
etapas sucesivas. Los fagos líticos se replican al interior de su bacteria hospedera y la
progenie viral es liberada provocando la lisis celular (Figura 1).

Figura 1: Ciclo lítico de un bacteriófago.

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La habilidad natural que poseen los fagos líticos de matar y destruir a las células
bacterianas infectadas puede ser determinante en la composición de las comunidades
bacterianas, y además ha sido utilizada con éxito para el control de enfermedades
bacterianas en diferentes modelos animales e incluso el hombre.

TÉCNICA DE ENRIQUECIMIENTO DE FAGOS PROVENIENTES DE MUESTRAS DE AGUA

Esta técnica utiliza al hospedero bacteriano específico para enriquecer al bacteriófago. La

bacteria hospedera (cebo) es parasitada por el fago, replicándose al interior de la bacteria,
lo que le permite aumentar el número de partículas virales que son posteriormente
liberadas y capaces de infectar a una nueva bacteria, de esta forma, se consigue aumentar
la posibilidad de aislar al bacteriófago específico contra ese microorganismo.

Protocolo de enriquecimiento:

1. Tomar una muestra de medio litro de agua de regadío en un recipiente limpio.

2. Agregar a la muestra 1% de triptona y 0,5% de extracto de levadura.

3. Inocular 1 mL de un cultivo líquido de la bacteria cebo crecida durante la noche (o/n) a

su temperatura óptima.

4. Incubar la muestra a 25°C por 24 horas con agitación constante a 160 rpm.

5. Posterior a la incubación, tomar 5 mL y centrifugar a 10.000 rpm por 10 min.

6. Tomar el sobrenadante, filtrarlo (filtros con un tamaño de poro de 0,22 μm) y depositar
el filtrado en un tubo estéril nuevo (lisado mixto).

7. Almacenar el lisado a 4°C para su posterior utilización.

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TÉCNICA DE AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

Hasta este momento el lisado obtenido es mixto, o sea posee más de un bacteriófago. El
objetivo del aislamiento es generar un lisado puro, con sólo un tipo de partícula viral. La
técnica de doble capa de agar nos permitirá aislar cada bacteriófago.

Protocolo de aislamiento por doble capa convencional:

1. Inocular un medio líquido (de crecimiento) con una dilución 1/1000 de un cultivo o/n de
la bacteria hospedera.

2. Incubar el cultivo en agitación a la temperatura óptima hasta que la bacteria hospedera

alcance la fase exponencial temprana (OD600nm ~0,1).

3. Paralelamente hacer diluciones seriadas del lisado en suero salino estéril (0,85% de
NaCl).

4. Agregar 0,1 mL de la 1ª dilución del lisado a 1mL del cultivo fresco de la bacteria
hospedera. Esto se repite para cada dilución.

5. Incubar 20 min a temperatura ambiente.

6. Agregar la mezcla del lisado + bacteria a 3 mL de agar blando (0,6% de agar) mantenido
a 45ºC (en baño termorregulado).

7. Esparcir sobre una placa de agar de base (1,5 % agar).

8. Incubar a 25°C por 24h.

OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

Un cultivo puro se obtiene tomando una placa de lisis (Figura 2) con una punta de
micropipeta estéril. Posteriormente, se eluye la placa de lisis aislada en 1 mL de medio de
cultivo líquido o suero salino. Finalmente se utiliza el fago eluido para producir fago a
través del método de doble agar.

Si al realizar el protocolo de doble placa de agar aparecen nuevamente más de un tipo de

placa de lisis, repetir este paso.

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Figura 2: Placas de lisis de un bacteriófago.

RESUMEN

1. Enriquecer la muestra con suplementos y con la cepa hospedera fresca.

2. Centrifugar la muestra y filtrar (0,22 μm).

3. Utilizar filtrado para detectar placas de lisis por el método de doble agar.

4. Aislamiento de una placa de lisis.

5. Eluir la placa de lisis.

6. Utilizar el fago eluido para producir más fago a través del método de doble agar.