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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCAS

DIVISION DE ESTUDIOS BÀSICO SECTORIALES

LICENCIATURA EN BIOLOGÌA

UNIDAD CURRICURLAR: PRÀCTICA PROFESIONAL II

PROFESORA: ZAITH VILLEGAS

Actividades programadas para las Pasantías en


LIBIOTEC C.A.

Maracaibo 05 de Julio de 2020.


Actividades programadas para las Pasantías en LIBIOTEC C.A.

Revisión Bibliográfica:

El pasante debe familiarizarse con los equipos de laboratorio (Autoclaves,


Incubadoras, Cámaras de Recuento, Hornos de desecación entre otros) asi
como su función y manejo, además dominar las buenas prácticas en un
laboratorio de microbiología (manejo de cepas, cultivos acuosos, asepsia
entre otros), también debe tener conocimiento del genero bacteriano con el
cual se trabaja (Metabolismo, Fases de crecimiento y replicación así como
factores que afectan su desarrollo).

El Genero Bacillus:

 El género Bacillus pertenece a la familia Bacilliaceae, es un género que hoy


en día incluye más de 60 especies de bacilos. Este género está formado
por microorganismos bacilares Gram positivos, formadores de endosporas,
quimio-heterótrofos que normalmente son móviles y rodeados de flagelos
periticos. Son anaerobios o aerobios facultativos son catalasa positivos. Las
células bacterianas de este género tienen un amplio tamaño que varía 0,5 a
2,5 μm x 1,2-10 μm. Este género se encuentra comúnmente en suelos y
plantas donde tienen un papel importante en ciclo del carbono y el
nitrógeno. Son habitantes comunes de aguas frescas y estancadas, son
particularmente activos en sedimentos. (Koneman, 2001).

Taxonómicamente según la segunda Edición del Manual Bergey's (1982) el


género Bacillus pertenece a la familia I Bacilliaceae, del orden I Bacillales
de clase tres Bacilli, del fillum BXIII firmicutes del Dominio bacteria. En la
primera edición del género es claramente diverso desde el punto de vista
fenotípico y genotípico. La diferenciación entre especies del género Bacillus
se centro en los resultados en la fermentación de lactosa, sorbitol, manitol,
melobiosis, hidrólisis de la urea, y descarboxilacion de la lisina.(Anderson y
col.2003).

Más recientemente, los datos de la secuencias de RNA se han empleado


para dividir géneros de Bacillus en al menos cinco líneas diferentes. Entre
las especies más representativas del genero Bacillus se encuentran
B.alkalophilus, B anthracis, B azotoformans, B brevis,B cereus, B subtillis,B
coagulans,B firmus,B insolitus,B lincheniformis,B polimyxa y B turingiensis
entre otros. LIBIOTEC tiene en su cepario uno de los bacilos más usados a
nivel comercial es Bacillus subtilis Es una bacteria Gram positiva, produce
endospora las que son termorresistentes y también resiste factores físicos
perjudiciales como la desecación la radiación los ácidos y los
desinfectantes químicos, produce enzimas hidrofilicas extracelulares que
descomponen polisacáridos, ácidos nucleicos permitiendo que el organismo
emplee estos productos como fuente de carbono y electrones, producen
antibióticos como la bacitricina,polimixina,gramicidina y circulina,fermentan
la caseína y el almidón, vive dentro de los límites de 55 a 70ºC.

Es un gran controlador biológico, Bacillus subtilis promueve el desarrollo de


las plantas y previene las enfermedades del suelo causadas por Sclerotium
rolfsii, Fusarium spp., Verticillium spp, Sclerotinia sclerotiorum,
Phytophthora capsici, Pythium spp, y el nematodo nodulador de raíces
(Meloidogyne spp) y Rhizoctonia solani, agente causal de la enfermedad
denominada “mal del tallito” del algodonero. (Bergey's, 1989 -2000)

Identificación, Aislamiento y Purificación de Microorganismos del


Genero Bacillus:

1 Identificación: La identificación se realiza por medio de diluciones


seriadas de un medio de solución salina a una concentración del 9%
agregando el material (generalmente muestras de suelo) con microbiota
homogenizada, luego son cultivadas en un medio de Agar Plate Count
usado para observar e identificar las colonias por su morfología
macroscópica por medio de un contador de colonias con lupa de
aumento, se deben dejar dichas placas incubar a 35ºC por 24H, luego
de esta fase de crecimiento se procede a la identificación macroscópica,
y la microscópica con tinción de Gram directos de las colonias
seleccionadas y observarlas en objetivo de 100X. (Faria, 2020)

2 Aislamiento: Esta etapa se realiza a partir de colonias seleccionadas


anteriormente y se siembran por agotamiento en medio de Agar Plate
Count luego se procede a la descripción macroscópica de las colonias
previamente diferenciadas en la fase de identificación con el fin de
corroborar el tipo de colonia que fue tomada en esta fase, después se
realizan la descripción microscópica que se incluye la Tinción Gram
además se realiza una tinción con verde de malaquita para observar la
posición de la endoesporas, cabe a destacar que es necesario realizar
pruebas bioquímicas para poder acercarse aún más a la especie del
Bacilo con más precisión dependiendo del tipo de compuesto que
degrade según lo indica el Manual Taxonómico de Bergey`s. (Faria,
2020)

3 Purificación: Con el fin de mantener la pureza de las cepas y retirarle


alguna otra colonia contaminante que esté presente la cual puede
provenir de un agente externo del área donde este almacenado las
colección de cepas, así como del mal manejo y malas prácticas en un
laboratorio de microbiología, se debe sembrar en medio acuoso la
colonia no afectada del agar dejar crecer y realizar diluciones seriadas
en solución fisiológica al 9% o agua destilada para sembrar en placas
con Agar Plate Count y dejar incubando por 24H a 35ºC para
posteriormente llevar a cabo una diferenciación y caracterización
macroscópica de las colonias en el medio sólido y una microscópica con
objetivo de 100X por medio de la tinción de Gram se observan los
bacilos su diámetro y ancho, también se tiñen con verde de malaquita
para verificar la posición de la espora según el tipo de bacilo que
estemos purificando. Para evitar el riesgo de contaminación se deben
realizar recambios de las cepas puras cada 3 o 4 meses, también es
importante mantener la asepsia de las áreas en general del laboratorio.
(Faria, 2020).
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Bioaumentacion de Microorganismos del Genero Bacillus:

1 Activación de las Cepas: Para poder utilizar los Bacilos que se tienen
en la colección de LIBIOTEC se debe previamente activar sus funciones
metabólicas mediante medios de cultivos acuoso como son el caldo de
peptona, se debe prepara según la cantidad de cepas a usar y ser
esterilizado en tubos de rosca de 5 mL en el autoclave, una vez se tiene
preparado el medio se procede a la inoculación del caldo peptona bajo
el mechero y en un mesón previamente desinfectado con cloro. Se usa
un aza de titanio esterilizada con el mechero dejándola al rojo vivo
durante al menos 15s y esperar que enfrié un poco, se verifica este fría
colocando la punta de esta en una porción del agar, se toca con la punta
del aza la colonia de la placa y se introduce en el tubo, antes de cerrar
el tubo se debe flamear la boquilla y el aza para mantener la esterilidad
y evitar contaminar la cepa. Luego se procede a incubar los tubos a
35ºC por 24h, transcurrido este tiempo se observa en cámara de
Neubauer el crecimiento, y se toma nota de la cantidad de Bacilos, su
vigorosidad, definición del tamaño y si hay la presencia de algún agente
contaminante. Una vez realizado este procedimiento están listos para
ser utilizados en la bioaumentacion. (Faria, 2020).

2 Bioaumentacion: Una vez que se tiene un consorcio de cepas


seleccionadas activadas se procede a aumentar en volúmenes más
grandes para utilizarlos para la producción de productos probióticos,
probióticos y bioremediadadores de suelo y agua. Se preparan fiolas de
500mL con medio enriquecido de melaza y sales según la cantidad
deseada de cada bacteria, se esterilizan y se inoculan bajo mechero las
fiolas con las cepas activadas, la inoculación es de tubo a fiola
agregando aproximadamente 1 mL luego se flamean las boquillas y se
cierra, luego se procede a inocular a 35 ºC por 24h, transcurrido este
tiempo se debe realizar la revisión de cada fiola inoculada en cámara de
Neubauer tomando nota de la cantidad de bacilos, vigorosidad,
definición del tamaño y si hay algún contaminante externo, luego de esto
están listo para ser usado el medio en procesos productivos. (Faria,
2020)

3 Monitoreo del producto final: Para tener un control de la calidad del


producto procesado se debe realizar un monitoreo a escala que simule
el medio que utilizan en campo, usualmente es melaza y se recomienda
que sea melaza. Se deben tomar las muestras de cada lote de producto
preparado con los medio de cultivos de la bioaumentacion, de este se
hace la relación a 250 g/1000 L a 0,25g/100mL, de este modo se puede
tener un control de los resultado esperados en campo teniendo en
cuenta que el método de bioaumentacion en campo es diferente al
método en laboratorio que controla las variables óptimas para el
crecimiento y desarrollo de las bacterias. (Faria, 2020

Bibliografia:

 Anderson,T.H. 2003 “Microbial eco-physiological indicators to asses


soil quality.”Ag.Ecosys.Environ.98:285-293.

 Bergeys D, 1989 - 2000. “Manual of the Determinative Bacteriology.”


Night Edition.Philadelfia 2 :540-589.2

 Koneman.E.W 2001.”Diagnostico microbiológico: Texto y atlas de


color”. Quinta Edicion.Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

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